Name: Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a analizar la composición celular en lesiones ateroscleróticas avanzadas de ratones mediante tinción inmunofluorescente. Este protocolo estandarizado permite cuantificar poblaciones celulares en arterias braquiocefálicas con rigor y reproducibilidad.

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Agradecemos el centro de la proyección de imagen biológica (apoyado por NIH 1S10OD019973-01) en la Universidad de Pittsburgh por su asistencia. Este trabajo fue apoyado por es apoyado por científicos concesión de desarrollo 15SDG25860021 de la American Heart Association a D.G. R.A.B. fue apoyado por los NIH grant HL136188 F30.

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<li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nature Medicine. 21, 628(2015).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

A pesar de décadas de investigación y los avances técnicos en el estudio de la aterosclerosis, el campo tiene una historia decepcionante de traducir los resultados científicos en terapias clínicas34,35. Este fenómeno puede explicarse en parte por las discrepancias en los modelos animales, diseños experimentales y análisis de la lesión. Adjunto, describimos un gasoducto experimental que se utilizó para analizar la composición celular en las lesiones aterosclerótic...

La ateroesclerosis es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo que la mayoría de las enfermedades coronarias, enfermedades de las arterias periféricas y accidente cerebrovascular. Aterosclerosis coronaria de etapa tardía pueden llevar a complicaciones severas, incluyendo la contabilidad de la infracción miocardio casi el 16% del mundo población mortalidad1,2. Debido a su impacto devastador en la salud pública, se han hecho esfuerzos importantes para descifrar los mecanismos de conducción de progresión de la aterosclerosis, así como para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, la tasa de probabilidad de aprobación (LOA) de ensayos clínicos para la enfermedad cardiovascular es entre los más bajos en comparación con otros campos clínicos (sólo 8,7% para la fase I)3. Esto puede explicarse en parte por muchas barreras que ateroesclerosis plantea al desarrollo de drogas eficaces incluyendo su naturaleza casi omnipresente, clínicamente silenciosa progresión y heterogeneidad de la enfermedad significativa. Por otra parte, el diseño subóptimo de los estudios preclínicos en animales también puede explicarse por la falta de éxito en la traducción clínica. En concreto, creemos que es necesario implementar estudios de intervención siempre que sea posible investigar la eficacia de estrategias terapéuticas. Además, hay una necesidad crítica para llevar a cabo procedimientos estandarizados para el análisis de la lesión incluyendo caracterización avanzada de composición celular de la etapa tardía de la lesión aterosclerótica phenotyping y asignación de destino.
La gran mayoría de los estudios de aterosclerosis se centrará en modelos de prevención de la aterosclerosis consisten en drogas tratamiento gene manipulación o (golpe de gracia o knock-in) en los ratones jóvenes sanos, antes de la iniciación de la enfermedad y la progresión. Estos estudios han descubierto un gran número de genes y moléculas de señalización que juegan un papel en el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, la mayoría de estos objetivos no se traducen en terapias eficaces en humanos. De hecho, es difícil extrapolar el efecto de que una terapia tiene en ratones jóvenes saludables a pacientes ancianos con lesiones ateroscleróticas avanzadas. Como tal, la realización de estudios de intervención en la preclínica experimental probablemente proporciona una representación más precisa de la pertinencia y la eficacia de una nueva terapéutica. La idea es apoyada por los efectos sorprendentemente divergentes de inhibición de la citocina proinflamatoria interleukina-1β (IL-1β) cuando emplee una prevención4,5,6 o intervención estrategia7. Diferencias entre prevención y estudios de intervención sugieren que diversos procesos celulares ocurren en diferentes fases de desarrollo de aterosclerosis y destaca el hecho de que están probables que estudios de prevención suficientes para modelar el escenario clínico adecuadamente.
La American Heart Association publicó recientemente una Declaración científica que detalla las recomendaciones para el diseño experimental apropiado procedimiento estandarización, análisis y reporting de ateroesclerosis animal estudios8. Se destacan los beneficios y limitaciones de las técnicas predominantes utilizadas en el campo. Por ejemplo, la cara en Sudán IV tinción de la aorta se realiza a menudo como una primera lectura. Aunque cara en tinción de Sudan IV de deposición de lípidos es un método adecuado para la evaluación de la carga global de la placa, es incapaz de distinguir las lesiones de la estría grasa incipiente de lesiones más avanzadas de última etapa. Como tal, la interpretación de la cara en la coloración es a menudo ambigua y superficial9. Análisis cuidadoso del tejido secciones utilizando el tamaño de buque, lesión y la luz de parámetros morfológicos y la cuantificación de los índices de estabilidad de la lesión proporciona una comprensión más precisa del efecto de un experimento.
Finalmente, estudios de histopatología humana han sugerido que la composición celular es un mejor predictor de la ruptura que el tamaño de la lesión, con pobres de lesiones en células de músculo liso (SMC) y ricos en macrófagos, siendo más susceptibles a la ruptura10, 11. Estas observaciones se basaron en coloración para marcadores clásicamente utilizados para la identificación de la célula (es decir, ACTA2 para SMC o LGALS3 CD68 de macrófagos). Sin embargo, la expresión de estos marcadores no está estrictamente restringida a un solo tipo de células en las lesiones ateroscleróticas debido a la plasticidad de los linajes múltiples incluyendo SMC, células endoteliales y células mieloides12. En particular, la identificación inequívoca del SMC en la lesión aterosclerótica fue prácticamente imposible hasta la última década debido a la característica de estas células para dedifferentiate y reprimir sus genes marcador de linaje específico (un proceso denominado fenotípica de la conmutación) en13de los vasos lesionados o enfermos. Esta limitación en la identificación de SMC ha sido burlada por el desarrollo del linaje seguimiento7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. se compone de etiquetado permanentemente SMC y sus crías para seguir su destino y evolución fenotípica durante la progresión de aterosclerosis mediante la combinación de la expresión del recombinase de Cre impulsado por promotores específicos de SMC (es decir, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24,25,de Acta226 y SM22α14,16) y la activación de Reporteros (p. ej., proteínas fluorescentes, β-galactosidasa) [revisado en Bentzon y Majesky 201827]. En uno de los primeros estudios con seguimiento de linaje SMC fuera de ajuste de la embriogénesis, Speer et al.14 proporcionó evidencia que SMC puede modular su fenotipo y transdifferentiate en condrogénica de células durante la calcificación vascular mediante el uso de un modelo de seguimiento de linaje SM22α Cre R26R LacZ. Aunque estos estudios fue pionero en seguimiento del linaje SMC, que estaban parcialmente equívocos en que cualquier dado SMC no expresando su SM22α en el ajuste de la enfermedad sería marcado por el reportero. Esta limitación ha sido soslayada por el desarrollo y uso del tamoxifeno-inducible Cre ERT/LoxP que permite un control temporal de etiquetado de la célula. Celular se produce exclusivamente durante el parto de tamoxifeno y se limita a la célula expresando células específicas del tipo promotor conducir expresión Cre ERT en el momento de la exposición a tamoxifeno, evitando el trazado alternativo de tipos de células activando Cre en el ajuste de la progresión de la enfermedad. Seguimiento del linaje de SMC en la aterosclerosis, el tamoxifeno-inducible Myh11- Cre/ERT2 transgen asociado a reporteros fluorescentes (eYFP7,15,del17,18 , 21, mTmG19,25, confeti20,22,23 estudios de expansión clonal) ha demostrado una notable eficacia y especificidad en las SMC y ha utilizado para destino mapa SMC las poblaciones en las lesiones ateroscleróticas en estudios recientes. Lo importante, estos estudios revelaron que: 1) 80% de SMC dentro avanzado hacer lesiones ateroscleróticas no expresa ningún convencionales marcadores SMC (ACTA2, MYH11) utilizados en análisis immunohistological y por lo tanto habría sido identificado erróneamente sin seguimiento del linaje 17; 2) subconjuntos de SMC expresan marcadores alternativos tipos de células incluyendo marcadores de macrófagos o de células madre mesenquimales marcadores16,17,19; y 3) SMC invertir y rellenar la lesión aterosclerótica por expansión oligoclonal y clones SMC mantienen plasticidad a la transición a poblaciones fenotípicamente diferentes20,23. Para resumir, ahora está claro que las células musculares lisas presentan una notable diversidad fenotípica en las lesiones ateroscleróticas y pueden tener papeles beneficiosos o perjudiciales sobre la patogénesis de la lesión según la naturaleza de sus transiciones fenotípicas. Estos descubrimientos representan una nueva vía terapéutica notable para dirigidos a los SMC atero-promover fenotípica las transiciones en la última etapa de aterosclerosis.
En este documento, proponemos un protocolo estandarizado para el análisis de fase las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos para la disección de animales, inclusión, seccionamiento, tinción y cuantificación de las lesiones de la arteria braquiocéfala. Para determinar el efecto de inhibición de la interleucina-1β en destino SMC y fenotipo, utilizamos el linaje SMC ApoE- / - ratones alimentados con una dieta occidental para 18 semanas antes de recibir inyecciones semanales de un anticuerpo anti-IL1β o emparejado de isotipo IgG control de seguimiento.

<table><tbody><tr><td>Solución acuosa de paraformaldehído al 16%</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Perfusión y fijación de tejidos</td></tr><tr><td>Aguja de mariposa 23G</td><td>Fisher</td><td>BD367342</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 25G</td><td>Fisher</td><td>14-821-13D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal A1 Microscopio</td><td>confocal</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo ACTA2-FITC (ratón)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Alexa-647 anti cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Solución de desenmascaramiento de antígenos, a base de ácido cítrico</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300 Solución de</td><td>recuperación de antígenos</td></tr><tr><td>Chow Diet</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.7012</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td>Cualquier cubreobjetos de 50 x 24 mm</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Núcleo fluorescente contratinción</td></tr><tr><td>Burro Alexa-488 anti-conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Burro Alexa-555 anti-ratas</td><td>Abcam</td><td>ab150154</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>DPBS 10X sin Calcio y Magnesio</td><td>Gibco</td><td>14200166</td><td>PBS para diluciones de soluciones y lavados. Diluir a 1x en agua desionizada</td></tr><tr><td>Casete de inclusión</td><td>Fisher</td><td>15-182-701D Tubo</td><td></td></tr><tr>de<td>vacío ETDA</td><td>Fisher</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Etanol a prueba de 200</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de espuma</td><td>Fisher</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel de pescado de agua fría</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFP (cabra)</td><td>abcam</td><td>ab6673</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>de cabra IgG control</td><td>Vector Labs</td><td>I-5000</td><td>IgG control</td></tr><tr><td>Dieta alta en grasas</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Programa informático https://imagej.nih.gov/ij/&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo LGALS3 (rata)</td><td>Cedarlane</td><td>CL8942AP</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>LSM700 Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio confocal</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio, Superfrost Plus</td><td>Cuchillas</td> de micrótomo Fisher <td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td></td><td>30-538-35</td><td></td></tr><tr><td>Control de IgG para ratones Control de IgG</td><td>I-2000</td> de <td>Vector Labs</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen de elementos NIS</td> Software <td>de imagen Nikon</td><td>para la</td><td></td> adquisición de imágenes en z-stack</tr><tr><td>Suero de caballo normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Pap Pen</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de cacahuete</td><td>Sigma</td><td>P2144</td><td></td></tr><tr><td>Oro prolongado Montador antidecoloración</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Medio de montaje&nbsp;</td></tr><tr><td>Control de IgG</td><td>de conejo Vector Labs</td><td>I-1000</td><td>Control de IgG</td></tr><tr><td>de rata Control de IgG</td><td>Vector Labs</td><td>I-4000 Control de</td><td>IgG</td></tr><tr><td>Anticuerpo RUNX2 (conejo)</td><td>Abcam</td><td>ab192256</td><td>Jeringa de anticuerpos primarios</td></tr><tr><td></td><td>BD 309628</td><td></td><td>jeringa de 1 ml</td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher</td><td>X55K-4</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen Zen</td> Software <td>de imagen Zeiss</td><td>para la adquisición de</td><td></td> imágenes en z-stack</tr></tbody></table>

análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Aterosclerosis es la principal causa de muerte en todo el mundo y, a pesar de innumerables estudios preclínicos que describe objetivos terapéuticos prometedores, nuevas intervenciones han permanecido esquivas. Esto es probablemente debido, en parte, a una dependencia de modelos preclínicos prevención investigando los efectos de la manipulación genética o tratamientos farmacológicos sobre el desarrollo de aterosclerosis en lugar de la enfermedad establecida. También, resultados de estos estudios son a menudo confusión debido al uso de análisis superficial de la lesión y la falta de caracterización de poblaciones de células de la lesión. Para ayudar a superar estos obstáculos traslacionales, proponemos una mayor dependencia en los modelos de intervención que emplean la investigación de los cambios en la composición celular a nivel unicelular por tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. Para ello, se describe un protocolo para las pruebas de un supuesta agente terapéutico en un modelo murino de la intervención como un enfoque sistemático para la disección animal, inclusión, corte, coloración y cuantificación de las lesiones de la arteria braquiocéfala. Además, debido a la diversidad fenotípica de las células dentro de las lesiones ateroscleróticas de la tarde-etapa, describimos la importancia del uso de sistemas de linaje de la célula-específica, inducible calco ratón y cómo esto se puede aprovechar para la caracterización objetiva de poblaciones celulares de la lesión aterosclerótica. Juntos, estas estrategias pueden ayudar a los biólogos vasculares con mayor precisión las intervenciones terapéuticas del modelo y analizar la enfermedad aterosclerótica y que se traducirán en una mayor tasa de éxito en los ensayos clínicos.

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - ratones fueron inyectados con tamoxifeno entre seis y ocho semanas de edad antes de ser alimentados con una dieta alta en grasas. En 18 semanas de dieta alta en grasas de alimentación, dos grupos de ocho ratones trataron semanalmente con un anticuerpo monoclonal anti-IL-1β de ratón o un comparable de isotipo IgG del control en 10 mg/kg durante 8 semanas (figura 1)7. Ratones fueron...

Proponemos un protocolo estandarizado para caracterizar la composición celular de etapa tardía las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos de disección animal, tejido inclusión, seccionamiento, tinción y análisis de las arterias braquiocefálicas de atheroprone músculo liso células linaje seguimiento ratones.

Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Nuestro protocolo ayuda a los investigadores a implementar tuberías experimentales estandarizadas para realizar la caracterización fenotípica de poblaciones similares mediante tinción inmunofluorescente. Con esta técnica, los investigadores pueden analizar rigurosamente la composición similar de los tejidos complejos de la enfermedad y realizar análisis cualitativos y cuantitativos de los fenotipos de los tipos celulares de interés. Demostrar el procedimiento será Sidney Mahan, un técnico de mi laboratorio.Para preparar al animal para la cosecha de la arteria braquiocéfala, corte el peritoneo hasta el esternón, teniendo cuidado de no dañar los tejidos abdominales. Y hacer dos cortes en la línea media axilar a través del tórax, teniendo cuidado de no dañar el corazón y los pulmones. Luego, corta el diafragma para exponer parcialmente el corazón.Para profusar el ratón, instale un sistema de profusión de gravedad de tal manera que la presión del líquido de profusión sea equivalente a la presión arterial murina promedio para permitir una profusión y mantenimiento constantes de la morfología del vaso. Luego, profusa al animal con cinco mililitros de temperatura ambiente PBS, 10 mililitr

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El análisis ex vivo de lesiones arteriales a partir de modelos animales de enfermedad cardiovascular se basa clásicamente en técnicas histológicas e inmunohistoquímicas. Estos proporcionan mediciones bidimensionales en lesiones tridimensionales. Este manuscrito describe la generación de lesiones arteriales para análisis cuantitativo en 3 dimensiones mediante tomografía óptica de proyección.

Generación y cuantificación de 3 dimensiones de las lesiones arteriales en ratones mediante tomografía óptica de proyección

Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.

Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino

Este video muestra a dos modelos de desarrollo de la placa de la íntima en las arterias murinos y hace hincapié en las diferencias en la hiperplasia miointimal y la aterosclerosis.

Inducir miointimal Hiperplasia Versus aterosclerosis en ratones: una introducción de dos modelos válidos

La calcificación vascular es un importante predictor y contribuyente a la enfermedad cardiovascular humana. Este protocolo describe los métodos para inducir la calcificación de células de músculo liso vascular primario cultivadas y para cuantificar la calcificación y la carga de macrófagos en aortas animales mediante imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano.

Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación

Este estudio describe un procedimiento invasivo para la inducción de la aterosclerosis acelerada en ratones. En comparación con otros métodos que utilizan lesiones inducidas por electricidad o crio, la lesión inducida por la mecánica imita la condición humana de la restenosis después de las terapias de revascularización y es ideal para el estudio de los mecanismos moleculares involucrados.

Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Los modelos murinos de aterosclerosis son herramientas útiles para investigar vías patógenas a nivel molecular, pero requieren una cuantificación estandarizada del desarrollo de lesiones. Este protocolo describe un método optimizado para determinar el tamaño de la lesión en los vasos arteriales principales, incluyendo la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala.

Cuantificación de la aterosclerosis en ratones

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para analizar la carga aterosclerótica en ratones. Los investigadores pueden usar este protocolo para comparar la abundancia, la ubicación y el tamaño de las lesiones ateroscleróticas en diferentes animales.

Imágenes y análisis de lesiones de aorta entera teñidas de O de color rojo aceite en un modelo de ratón con hiperlipidemia por aneurisma

Este protocolo proporciona una metodología integral para el análisis cuantitativo de las placas ateroscleróticas para facilitar una investigación más profunda sobre los mecanismos y la progresión de la aterosclerosis.

Aislamiento y análisis de lesiones del arco aórtico y la raíz en un modelo de ratón aterosclerótico

Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

Aprende a analizar la composición celular en lesiones ateroscleróticas avanzadas de ratones mediante tinción inmunofluorescente. Este protocolo estandarizado permite cuantificar poblaciones celulares en arterias braquiocefálicas con rigor y reproducibilidad.

Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones (Video) | JoVE Journal

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