小鼠骨骼肌肉外泄原发性肌基器的分离和分化

这是一个协议，用于分离原发性小鼠肌肉干细胞，用于研究代谢外体。与过去尝试过的其他协议相比，该协议提供了更多的干细胞。更重要的是，一旦我们把这些干细胞分化成 myotube，它们就表现出正常的生理，所以像昼夜节律一样。

首次尝试此过程时，请做详细的笔记并保存多个图像，因为每个组织外植看起来都不同，并且肌细胞的外培养会有变化。如果没有视觉演示，很难知道是否隔离了正确的单元格。当我们在实验室中建立这种方法时，我们受益于其他人的慷慨帮助， 他们向我们展示了这种方法。

根据手稿准备消毒盘后，将两到三张厚吸水纸放入塑料袋中，用移液器用无菌水润湿纸张表面，准备湿润室。将腔室在紫外线下放置五分钟进行消毒。从四到八周大的老鼠解剖所需的肌肉，并在含有每毫升根霉素40微克的PBS中轻轻冲洗以进行灭菌。

使用无菌钳将肌肉转移到无菌的10厘米非涂层培养皿。在肌肉上加入0.5至1毫升电镀介质，使组织湿润，但无法浮动。使用无菌手术刀或剃刀刀片轻轻地将肌肉切成小碎片。

使用钳子或移液器将肌肉碎片转移到预涂覆的六厘米板表面。非常轻轻地将额外的 0.8 毫升电镀介质覆盖在组织上。将含有湿润室肌肉碎片的六厘米培养皿放在湿润室内，并在 37 摄氏度和 5%的二氧化碳下返回孵化器 48 小时。

在37摄氏度的水浴中准备和预热肌细胞介质、三辛和PBS-根霉素。要为每个肌肉组涂上一个T25烧瓶，在烧瓶表面加入两毫升的涂层溶液，轻轻摇动，在表面形成均匀的涂层，并在四摄氏度下孵育烧瓶一小时。现在用移液器，从肌肉外植中去除电镀介质，然后用两毫升PBS-根霉素轻轻冲洗肌肉外植。

快速拆下 PBS，不要让板位于 PBS 中。然后轻轻加入一毫升PBS-根霉素，将盘子放在37摄氏度的培养箱中一分钟。使用 P1000 移液器将 PBS 与细胞收集到 15 毫升离心管中。

接下来，在盘子中加入一毫升的三辛，然后将其返回到37摄氏度的培养箱中三分钟。轻轻敲击板，将肌细胞进行分离。用单元格收集 trypsin，并结合 PBS 集合。

将八毫升肌细胞介质加入离心管，轻轻倒置混合。轻轻覆盖肌肉板上两毫升电镀溶液，然后将板返回 37 摄氏度的培养箱。在离心机中旋转含有细胞的离心管，以200倍g旋转3分钟。

吸上一道液，在管中保持约一毫升。轻轻添加肌细胞介质，将细胞转移到预涂层的烧瓶中，并将烧瓶放在 37 摄氏度的培养箱中。从 P0 肌爆 T25 烧瓶中吸出介质。

用两毫升温暖的PBS-根霉素短暂冲洗细胞，然后从烧瓶中吸出PBS。将两毫升温暖的PBS放入每个含有肌细胞的烧瓶中。将带 PBS 的烧瓶放入 37 摄氏度的培养箱中三分钟。

然后用力敲击烧瓶的侧面，将细胞分离。在光学显微镜下检查自由漂浮的肌细胞。将烧瓶直立放在组织培养罩中，用 10 毫升肌细胞介质冲洗烧瓶底部两到三次，以确保所有细胞都脱落。

在15毫升离心管中收集细胞介质混合物。在200倍g下离心3分钟。吸气介质在管中留下约一毫升，小心避免细胞颗粒。

轻轻地将适当体积的肌细胞介质添加到离心管中，然后轻轻混合。将细胞混合物分配到新的T75烧瓶中，每个瓶6毫升。在每个新的T75烧瓶中加入10毫升的肌细胞介质。

水平轻轻摇动烧瓶，将细胞分布，并在37摄氏度的培养箱中放置过夜。在该协议中，在标准光显微镜下观察从外植中产生原生细胞。早期收获的肌细胞出现小圆和明亮的球体。

肌细胞分化需要四到六天的时间，在此期间，细胞的形态从单圆球变成拉长融合的长多核纤维。生产了完全差异化的 myotube，这些管管已准备好测量氧气消耗率。这些单元可用于许多下游应用。

例如，我们经常使用它们来研究海马仪器中的基板通量。