使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路

细胞内细菌将效应蛋白分泌到宿主中，这些宿主可以操纵生物通路，促进病原体的生存。揭示效应器的宿主靶点对于了解细胞内病原体（如沙眼衣原体）至关重要。酵母毒性和抑制剂筛选可以提供有关细菌效应蛋白的自然生物靶点的关键见解，当结合伙伴未知时，可以特别有用。

我们演示酵母毒性和抑制剂检测在这里筛选衣原体沙眼效应蛋白， 但这项技术也已被用于定性军团菌嗜血杆菌和科西拉燃烧剂效应剂.首先接种五毫升的单辍汤与酵母的单组转化与含有质粒的效应蛋白。使用酵母单独与载体转化作为负对对，并在30摄氏度的温度下孵育孵化，同时摇动。

第二天，通过96孔板的 A6 井向 A2 中加入 180 微升无菌水。漩涡过夜培养，并添加180微升酵母到井 A1。然后连续用水稀释井中的酵母。使用多通道移液器将每次稀释的五微升分液检测到单滴出葡萄糖和单滴出半乳糖板上，并在 30 摄氏度下孵育板 48 小时。

孵育后，通过比较酵母的生长，将含有半乳糖的介质上生长的酵母的生长与仅表达载体的酵母的生长进行比较，直观地评估毒性。接种100毫升的单滴出汤与先前准备的酵母库存的1毫升，并在30摄氏度下孵育16至24小时，在150 RPM下摇晃。第二天，将隔夜培养的100毫升加入900毫升预先加热的单滴汤，并在30摄氏度下孵育烧瓶4至5小时，同时摇晃。

孵育后，在摄氏4度下，在6000次g下分粒，10分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在250毫升的无菌水中。重复离心并丢弃上经剂。

然后将颗粒重新在250毫升的一毫升醋酸锂中重新暂停。通过离心对培养物进行颗粒化，去除醋酸锂，并在 9.6 毫升 50%PEG 3350 中重新暂停颗粒。然后添加手稿中描述的转化试剂，并将体积调整为 15 毫升，无菌水轻轻反转以混合。

在30摄氏度下孵育混合物30分钟。然后加入750微升DMSO，在42摄氏度的水浴中孵育30分钟。在热冲击前添加 DMSO 对于实现高转化效率至关重要。

孵育后，在3000次g中离心5分钟，将酵母颗粒为颗粒。丢弃上经剂，用10毫升无菌水清洗颗粒，然后重复离心，使酵母颗粒。将颗粒重新在8毫升水中。

通过将样品稀释 1 至 10，将每次稀释的 100 微升电镀到双滴出的加糖上，确定转化效率。然后板200微升的样品在双辍半乳糖加糖板和孵育板在30摄氏度48至96小时或直到菌落出现。一旦菌落出现，修补他们双辍学半乳糖的阿加，并孵育他们另外24至48小时。

使用部分贴片接种五毫升的双滴出肉汤，并在26摄氏度下孵育孵化，在150 RPM下摇晃。第二天，从 A2 井开始，在 96 孔板的 5 口井中加入 180 微升无菌水。漩涡一夜之间文化混合。将180微升酵母加入井 A1，并使用水在 A2 至 A6 井中连续稀释。在单滴出葡萄糖和单滴出半乳糖板上发现每次稀释的五微升，确保单独包括毒性效应器作为控制。

在30摄氏度下孵育板48小时，然后将酵母的生长与毒性效应器单独与酵母的生长与潜在的抑制器进行比较。要确认与毒性效应器相比毒性降低的抑制剂，请根据手稿指示分离质粒并将其重新转化为有毒酵母。接种双辍糖汤与从转化板的殖民地。

孵育过夜，并发现双辍糖和半乳糖加糖，以确认抑制毒性。在执行酵母抑制器筛选之前，对感兴趣的效应蛋白进行了酵母毒性测试。在乳糖可吸收的促进剂的控制之下，在酵母中表达感兴趣的蛋白质，将乳糖的生长与葡萄糖的生长进行比较。

当CT229被测试毒性时，观察到较小的菌落和生长抑制。理想情况下，应观察到两到三个日志减少，以继续酵母抑制器屏幕。抑制器屏幕通过利用酵母基因组库pYAP 13改变毒株，并在乳糖上电镀转化剂进行。

在双滴出半乳糖剂中发现获得的抑制克隆，以确认抑制毒性。抑制器pSup1和pSup2抑制了效应蛋白的毒性，而pSup3则没有。这些程序需要仔细注意细节，除了关键的准备工作，包括有大量的介质和板准备之前执行实验。

一旦识别抑制剂，就可以进行实验，以验证与利益效应器的相互作用，包括下拉、免疫荧光结肠化、效应器敲除或击除屏幕中确定的宿主因子。这种衣原体效应器技术的发展使得效应蛋白的初次表征得到了加速，并有助于我们集中力量阐明调解宿主病原体相互作用的基本分子机制。