Name: 纳索尼亚维特里彭尼斯的 Rnai 和克里斯普基因编辑的普帕尔和成人注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习在Nasonia vitripennis中进行蛹期和成虫期注射的方法，利用RNAi和CRISPR/Cas9技术实现基因功能分析。该技术无需胚胎显微注射，操作简便且存活率高，为昆虫遗传学研究提供了实用工具。

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本工作部分由提供给 O.S.A. 的加州大学圣地亚哥分校启动资金以及提供给 J.L.R. 的美国国家科学基金会/生物科学部资助项目 1645331 支持。

1. 纳索蜂的饲养
<ol>
	<li>将约20只交配后的雌虫单独放入塞有棉花的小型玻璃试管中。 
	注意：为减少饲养空间，使用10 x 85 cm、4 mL的试管最为理想。雌虫因具有较大的翅膀以及产卵器而易于与雄虫区分（图1A）。有关饲养N. vitripennis的详细方案亦可见于其他文献13,14,15。
	<ol>
		<li>每支试管中加入两只S. bullata 寄主，并将寄生蜂在25 ± 1 °C、相对湿度30%、12小时光照/12小时黑暗的条件下培养2-3天。 
		​注意：寄生蜂也可在较低温度或室温下维持培养；但其发育速度将会减缓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2-3天后，使用细头画笔小心移除雌虫，以避免持续产卵及子代发育不同步。 
	​注意：移除的雌虫可选择重新提供寄主继续饲养，或在5 °C条件下保存最多一个月。
	<ol>
		<li>若需注射的阶段为白色蛹期，则将被寄生的寄主在25 °C、相对湿度30%、12小时光照/12小时黑暗的条件下继续培养7天；若所需发育阶段为黑色蛹期，则培养13天；若需年轻的新羽化成虫，则培养14天。 
		注意：黄色和黑色蛹亦可在5 °C条件下保存最多一周。更长时间的保存将增加下一代幼虫进入滞育的频率，从而使注射后的筛选及突变品系的建立更加困难。</li>
		<li>使用解剖针轻轻敲破寄主蛹壳，以获取所需发育阶段的N. vitripennis蛹或成虫（图1A）。 
		注意：若需在特定成虫日龄进行注射或收集处女雌虫，建议在第13天将深色蛹从寄主体内取出，按性别分离，并在羽化后收集成虫。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 白蛹与黑蛹的排列
<ol>
	<li>在载玻片中央涂抹一条学校用胶水，制备载玻片。使用解剖针将胶水摊开，形成一层较厚的胶层（图1B），用于固定蛹体。转移蛹之前，让胶水干燥约2分钟。 
	注意：胶水不可过度干燥，否则蛹体无法牢固粘附在载玻片上，在注射过程中容易滑动。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用解剖针将胶水涂抹在蛹头部背面。</li>
	<li>将蛹腹部朝上固定在载玻片的胶层上。将20–30只蛹并排排列在载玻片上（图1C）。 
	​注意：避免胶水接触蛹的腹部，也避免将蛹完全浸入胶水中；否则成虫将无法正常羽化。</li>
	<li>将带有蛹的载玻片放入培养皿中，静置约10分钟使胶水完全干燥。在开始注射前，用解剖针轻轻推动蛹体以测试其粘附牢固程度。如果大多数蛹松动脱落，则需重新制备新的载玻片；或者，移除所有松动的蛹，仅对牢固粘附在载玻片上的蛹进行注射。</li>
</ol>
3. 针头准备
<ol>
	<li>将一根毛细玻璃管装入拉针仪中，按照制造商的说明制备微针。 
	注意：本演示中使用 P-1000 铂金丝针头拉制仪和铝硅酸盐玻璃毛细管。该仪器的操作手册（见 材料表）介绍了如何正确装载毛细玻璃管以及在此仪器上设置程序。使用以下参数（加热：536；拉制：80；速度：100；延迟：70) 用于向黄色蛹、黑色蛹和成虫注射铝硅酸盐玻璃毛细管。 
	此外，使用 P-2000 程控拉针仪，按照以下参数制备石英玻璃针加热：805；拉制：145；速度：50；延迟：145）。该手册提供了在此仪器中装载毛细石英管和设置程序的说明。若无拉制仪，也可使用可定制的毛细玻璃管。</li>
	<li>用针头吸取 5 µL 注射混合物（按照先前的RNAi方案预先配制）10 或 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白12 (RNP) 注射在 N. vitripennis使用微量上样吸头。 
	注意：演示过程中，针头内装有与红色染料混合的双链RNA（dsRNA）（参见 材料表用于白化期蛹注射的试剂，以及用于黑化期蛹和成虫黄蜂注射的BAPC-Cas9-sgRNA。这些试剂将靶向 朱砂 基因。成功被敲降或敲除的黄蜂将表现出红色眼睛，而非野生型的棕色眼睛。</li>
	<li>打开针头，将针尖在由两张重叠的载玻片构成的表面上滑动（图1D）或者，使用精细镊子打开针尖以形成锋利边缘，或通过缓慢刺穿黄蜂的胸部或腹部来开针。</li>
</ol>
4. 使用飞秒激光注射仪进行蛹期注射
<ol>
	<li>将排列好的蛹置于解剖显微镜下。将针头插入飞秒注射仪（femtojet）的注射管中，并拧紧夹头。</li>
	<li>在显微镜下观察针头，打开飞秒注射仪，通过旋转旋钮设置Pc和Pi的注射参数。 
	注意：建议将Pc值设为600 hPa，以实现液体的持续流动。Pc值取决于针头的开口大小。使用P-1000拉针仪按指定参数制备的针头，其Pc值在500 hPa至700 hPa之间时可产生稳定的流动。若需要更低的Pc值，表明针头开口可能过大，可能会损伤昆虫；而更高的Pc值则表明针头尚未完全打开或开口过小。</li>
	<li>将针头以约30°的垂直角度小心插入第2和第3可见腹节之间（图1E）。持续流动注射，直至白色期蛹的整个腹部变为粉红色，或黑色期蛹的腹部明显膨胀。当明显观察到腹部无法再容纳更多液体，或液体开始从体外溢出时，停止注射。小心移至下一个蛹，并重复上述步骤。 
	注意：注射过程中应避免针头触碰或损伤产卵器。</li>
	<li>将注射后的蛹连同载玻片转移至含有浸有去离子水滤纸的培养皿中，以维持湿度。盖上皿盖，并置于25 °C环境中，直至寄生蜂羽化（图1F）。</li>
</ol>
5. 使用吸管对蛹进行注射
<ol>
	<li>根据以下系数计算注射混合液的用量：每 1 µL 溶液可注射 4 只蛹。 
	注意：通常注射 20–30 只蛹需要约 5–8 µL 的核糖核蛋白（RNP）复合物-皂苷混合液或含 BAPC 的 RNP 溶液12。</li>
	<li>按照第 2 节建议的方法排列蛹，并将排列好的载玻片置于解剖显微镜下（图 1E）。</li>
	<li>取一根毛细玻璃针，在两片载玻片之间折断针尖，操作如步骤 3.4 所示（图 1D）。确保针尖开口足够大，以便通过口吹空气使注射液顺利流出，但又不能过大，以避免液体流失或损伤蛹体（图 1E）。 
	注意：此步骤至关重要，因为操作者需通过口吹气将注射混合液推入昆虫血淋巴。建议事先练习，以确定适合特定溶液黏度的最佳针尖孔径。进行五组、每组 20 只蛹的注射练习，通常足以掌握口控注射系统。</li>
	<li>使用微加载吸头将核糖核蛋白溶液12吸入一根针中，并将该针插入吸液管组件的连接器包中。 
	注意：在演示过程中，针中装载的是靶向Nasonia cinnabar基因的 BAPC-Cas9-sgRNA12。</li>
	<li>将针小心插入第 2 和第 3 可见腹节之间，进针角度约为 30° 垂直角（图 1E）。持续注射，直至白色期蛹的整个腹部变为粉红色，或黑色期蛹的腹部明显膨胀。当明显观察到腹部无法再容纳更多液体，或液体开始从体外溢出时，立即停止注射。小心移动至下一只蛹，重复上述步骤。 
	注意：注射过程中应避免针头触碰或损伤产卵器。</li>
	<li>将注射后的蛹连同载玻片转移至含有浸有去离子水滤纸的培养皿中，以维持湿度。盖上皿盖，并置于 25 °C 环境中，直至寄生蜂羽化（图 1F）。</li>
</ol>
6. 使用吸管对成虫进行注射
<ol>
	<li>进行成虫准备时，用细毛画笔将20只雌性成虫分为一组，置于洁净的小试管中。将试管放在冰上5分钟，直至雌虫被麻醉。或者，也可使用CO2对雌虫进行麻醉并注射。 
	注意：冰麻醉更优，因为成虫寄生蜂耐寒性强，注射后可轻松恢复。雌虫可承受比蛹期更多的注射液体量：1 µL溶液可用于3只雌虫，而蛹期则需4只才能使用相同体积。请据此准备相应体积的溶液。</li>
	<li>准备一个装有冰的冰桶，并将一块载玻片放置在冰上。在解剖显微镜下，将雌虫并排置于低温载玻片上，腹部朝上（图1E）。</li>
	<li>使用微加载尖端将核糖核蛋白溶液12装入一根针头中，并将针头插入吸液管组件的连接包内。注射时，从另一侧缓慢将针头插入腹部，同时用钝头解剖针从对侧支撑固定雌虫。避免触碰产卵器，否则会严重损伤这一关键生殖结构（图1E）。 
	注意：操作方向可根据操作者习惯选择，两种方式均可接受。</li>
	<li>以约30°的垂直角度，小心地将针头插入第2和第3可见腹节之间（图1E）。向雌虫腹部注入溶液，当液体无法继续进入或观察到多余溶液渗漏时停止注射。小心移动至下一只寄生蜂，并重复上述步骤。 
	注意：注射应缓慢进行，在拔出针头前将针头保留在腹部约3秒，然后极缓慢地抽出。这有助于调节体内液体压力，避免拔针后溶液从注射部位渗出。</li>
	<li>完成注射后，用画笔小心地将每只注射过的雌虫单独转移至含有一个寄主的新试管中。在室温下静置恢复约1小时，确认其存活后，再将试管放回饲养培养箱中。 
	​注意：在本演示中，针头内装载的是靶向Nasonia cinnabar基因的BAPC-Cas9-sgRNA12。</li>
</ol>
7. 注射后护理与突变体筛选
<ol>
	<li>从注射后的蛹羽化出成虫后，将单个蜂个体放入用棉花塞住的玻璃管中，并放入一只 S. bullata 寄主（图1G）。相比之下，注射后的雌蜂应在注射后立即分别放入含有寄主的单独玻璃管中。</li>
	<li>对于CRISPR/Cas9基因敲除实验，让雌蜂寄生寄主一天，并连续三天每天更换一次寄主。 
	注意：由于 N. vitripennis16具有单双倍体性别决定系统，未交配的雌蜂将产生单倍体雄性子代，这有利于突变的检测。对于通过RNAi敲低雄性特异性基因的实验，可将注射后的个体与野生型个体单独交配，然后使其寄生寄主。每天使用一个寄主，具体更换频率根据实验设计而定。</li>
	<li>将已被寄生的寄主置于25 °C条件下培养，直至G0代雄性子代羽化（约13–14天）。</li>
	<li>在解剖显微镜下筛选G0代雄蜂中出现突变表型的个体。cinnabar 基因负责眼色素的形成12：眼睛呈棕色的蜂为野生型，眼睛呈鲜红色或介于红色与棕色之间的蜂为突变体（图1H）。</li>
</ol>
8. 注射后的杂交与饲养
<ol>
	<li>将所有红眼的突变G0雄性（表型为cinnabar12基因功能缺失）与野生型处女雌性交配1-2天（图2A）。 
	注意：如果被破坏的基因不产生可见表型，则需要通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因并进行测序，以鉴定突变个体。在从G0雄性中提取DNA进行PCR之前，最好先将其与野生型处女雌性交配。或者，可从G0雄性的一条腿中提取DNA以鉴定突变体，仅保留经验证携带突变的个体用于后续交配。</li>
	<li>每只雌性提供两只S. bullata寄主，在25 °C、30%相对湿度及12:12光暗周期条件下让其产卵。每2-3天更换一次寄主。
	<ol>
		<li>将已被寄生的寄主置于25 °C、30%相对湿度及12:12光暗周期条件下培养约10天。</li>
		<li>约10天后，用解剖针轻轻敲开被寄生的寄主，从中取出每一只N. vitripennis蛹。</li>
		<li>借助细头画笔挑选雌性蛹（图1A）。 
		​注意：雌性为二倍体且杂合子，因此其眼色表现为野生型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将15-20只雌性蛹放入玻璃管中，在25 °C下培养至羽化。羽化后，每只雌性提供约20只S. bullata寄主，让新羽化的G1代处女雌性寄生寄主2-3天。 
	注意：这些雌性将产生50%的G2代突变雄性。
	<ol>
		<li>将已被寄生的寄主在25 °C、30%相对湿度及12:12光暗周期条件下培养，直至G2代雄性成虫羽化。</li>
		<li>将剩余的G1代蛹置于5 °C环境中保存8-10天。此后取出，转移至25 °C、30%相对湿度及12:12光暗周期条件下培养至羽化（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤8.3.1中G2代雄性羽化后，筛选红眼突变表型个体。使用细头画笔将红眼雄性与野生型雄性分离。 
	​注意：本世代（G2代，图2A）中出现红眼小蜂表明基因编辑已发生在生殖系中，且该突变为可遗传。</li>
	<li>将红眼雄性与步骤8.3.2中新羽化的G1代雌性（图2A）放在一起，使其交配1-2天。每只雌性提供2只S. bullata寄主，并置于25 °C、30%相对湿度及12:12光暗周期条件下培养10-11天。
	<ol>
		<li>10-11天后，用解剖针敲开被寄生的寄主，从中取出每一只N. vitripennis蛹（图2A）。</li>
		<li>借助细头画笔将红眼小蜂（雄性和雌性）与野生型个体分离（图1H）。将红眼小蜂共同饲养于玻璃管中，不得与野生型小蜂混合。 
		注意：在此阶段（G3代，图2A），单倍体雄性和二倍体雌性均携带并表现出cinnabar基因突变的表型。若目标基因突变不产生可见表型，可将单只G0雄性与一只野生型雌性交配约1天，随后移除雄性，通过PCR和测序进行分子水平的突变鉴定；同时让该雌性寄生寄主。仅对经确认携带突变的G0雄性后代继续进行杂交方案（图2B）。若实验目的是通过RNAi敲低候选基因，则可直接使用注射了dsRNA的个体进行所需的功能检测（如致死性、不育性或滞育诱导实验3,7）。由于RNAi效应是瞬时的，无法建立稳定维持目标表型的品系（图2C）3,7。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="蛹期显微注射工作流程（使用Femtojet）；蛹的分期排列、注射、孵化及突变体筛选。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61892/61892fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：蛹期及成虫期Nasonia vitripennis显微注射时间线。（A）收集白色（上）和黑色（下）的雄性和雌性蛹，（B–C）将其排列并对齐，粘附于载玻片上以进行注射。（D）通过在两张重叠的载玻片之间滑动制备并打开毛细玻璃针。（E）将针头连接至Femtojet（上）或吸管装置（下）以进行注射。（F）将注射后的蛹连同载玻片转移至底部铺有湿润滤纸的培养皿中以维持湿度。羽化后，（G）将雌虫单独放入小玻璃管中，并使其在腐肉蝇属（Sarcophaga）蛹上产卵。（H）对后代进行筛选以鉴定突变体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61892/61892fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="CRISPR/CAS9 RNAi基因筛选示意图；可见表型和PCR检测方法，果蝇表型发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61892/61892fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：显微注射后的杂交方案。 CRISPR/Cas9介导的基因编辑中，针对(A)可产生可见表型的基因和(B)不产生可见表型的基因所采用的杂交方案流程示意图。(C) RNAi筛选流程示意图。缩写：cin = cinnabar；PCR = 聚合酶链式反应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61892/61892fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

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<li>Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Tribolium+Deformed+ortholog+and+its+ability+to+directly+regulate+Deformed+target+genes+in+the+rescue+of+a+Drosophila+Deformed+null+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant.</a> Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).</li>
<li>Hughes, C. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+Deformed%2C+proboscipedia+and+Sex+combs+reduced+in+the+milkweed+bug+Oncopeltus+fasciatus%3A+novel+roles+for+Hox+genes+in+the+hemipteran+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head.</a> Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA+into+anesthetized+adult+Drosophila+triggers+RNA+interference+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system.</a> Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).</li>
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<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+gene-editing+in+the+malaria+mosquito+anopheles+stephensi+by+ReMOT+control%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control.</a> G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+in+the+silverleaf+whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Shirai, Y., Daimon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+cardinal+are+responsible+for+the+red-1+and+peach+eye+color+mutants+of+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).</li>
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<li>Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+genetic+tools+to+control+ACP%5BTitle%5D)+AND+%22Citrus+Research+Board+Citrograph+Magazine%22%5BJournal%5D)">Developing genetic tools to control ACP.</a> Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).</li>
</ol>

JLR 和 DCR 已就 ReMOT Control 技术申请临时专利保护。O.S.A 是 Agragene, Inc. 的创始人，持有该公司股权，并担任其科学咨询委员会成员。其余所有作者声明不存在利益冲突。

随着近年来Nasonia vitripennis作为多种生物学问题研究的模式生物被日益广泛使用2,3,7,17，亟需开发并优化注射方法，以建立一种简化且高效的N. vitripennis基因功能分析流程。目前采用的胚胎显微注射基因编辑试剂的方法具有较大挑战性13，需要专用设备和经过高度培训的技术人员。因此，为了使基因编辑技术更易于非专业实验室获取，开发CRISPR试剂的替代递送方法至关重要。本文展示了一种详细的可视化技术，描述了两种替代性注射操作流程，可用于将编辑试剂（CRISPR/Cas9或dsRNA）递送至昆虫的血淋巴和卵巢中。
将&#160;dsRNA 注射到昆虫血腔中是向多种节肢动物递送 dsRNA 的常用方法<sup class="xr...

CRISPR/Cas9 基因编辑技术是一种强大的功能基因组学研究工具，尤其适用于多种新兴的模式生物，例如 jewel 小蜂（Nasonia vitripennis）。由于其易于培养且拥有完整的基因组序列，jewel 小蜂已成为揭示多种生物学过程分子机制的重要实验体系。例如，近年来 N. vitripennis 已被用于解析单双倍体性别决定系统的表观遗传基础1,2、B 染色体的生物学特性3,4,5,6，以及昼夜节律和季节性调控的遗传基础7,8。使 N. vitripennis 适合实验操作的一些特征包括：较短的世代周期（在 25 °C 下约为 2 周）、高繁殖率、在蛹期易于区分性别，以及能够进入滞育状态并在 4 °C 下长期保存品系。其生命周期始于雌蜂将丽蝇（Sarcophaga bullata）的蛹作为寄主。雌蜂通过产卵器将多达 50 粒卵产入丽蝇的蛹壳内。卵孵化为幼虫后以 S. bullata 蛹体为食，在随后数天内继续发育，之后化蛹，最终羽化为成虫并从寄主蛹壳中羽出9。
目前已有一些分子工具可用于开展对N. vitripennis的功能遗传学研究，例如RNA干扰（RNAi）10和CRISPR/Cas911,12，但这些技术的应用仍受到限制，主要原因是胚胎显微注射操作困难13。由于N. vitripennis的卵需要寄生于蛹期宿主才能发育，因此对卵的操作极具挑战性。处于前囊胚期的胚胎必须从宿主蝇类蛹中采集，迅速进行显微注射，并立即重新放回宿主体内继续发育13。这些步骤需要极高的精确度和专门的技术培训，以避免损伤显微注射后的胚胎或蛹期宿主13。此外，这些卵体积微小且极为脆弱，尤其在显微注射后，其细胞质黏稠度很高，容易导致注射针头持续堵塞13。上述特性使得胚胎显微注射操作异常困难，需要经验丰富的操作人员以及大多数N. vitripennis实验室所不具备的专用设备。
优化CRISPR试剂递送的替代注射方法将有助于巩固N. vitripennis作为模式生物的地位。对蛹期和成虫的操作比对胚胎的操作更具可行性，且可通过基础的注射装置完成。本文描述了两种针对蛹期和成虫的注射方案：一种使用专门的注射设备，另一种则使用装配有玻璃毛细管针头的吸管装置。吸管装置特别适用于无法获得胚胎显微注射专用设备的实验室。文中展示了对N. vitripennis不同发育阶段（包括白色或黑色蛹以及成虫小蜂）进行高效注射的操作方法。其中，处于白色蛹期的小蜂特别适用于RNAi介导的基因敲低实验。尽管在2006年由Lynch和Desplan首次报道了Nasonia中的RNAi技术10，但目前尚无关于RNAi注射操作过程的可视化实验流程。近期，RNAi技术已被用于鉴定B染色体PSR（父系性别比率，Paternal Sex Ratio）中的haploidizer基因3，并用于研究生物钟基因period在N. vitripennis生物节律中的作用7。
可利用黑色蛹期和成虫期的寄生蜂，通过 ReMOT Control（受体介导的卵巢货物转导）和 BAPC（支化两亲性肽胶囊）方法诱导 CRISPR/Cas9 生殖系基因编辑。Nasonia 中的这两种卵巢递送方法最近已被证实可有效靶向 cinnabar 基因并产生生殖系突变7,12。本文提供了一种简化的显微注射方案，包含蛹期和成虫期注射的分步可视化操作流程，可用于开展 Nasonia 的功能遗传学研究，并有望推广至其他寄生蜂种类，且无需特殊设备，避免了胚胎显微注射的复杂性。

<table><tbody><tr><td>100 x 15 mm 可叠放培养皿，聚苯乙烯，单层，无菌</td><td>Sigma</td><td>960-97693-083</td><td></td></tr><tr><td>铝硅酸盐玻璃毛细管，外径 1 mm × 内径 0.58 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>也可使用硼硅酸盐或石英材质</td></tr><tr><td>校准型微毛细移液管用吸液管组件</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>BAPC</td><td>phoreus biotech</td><td>BAPtofect-25 0.5 mg Kit</td><td></td></tr><tr><td>带核定位信号（NLS）的 Cas9 蛋白</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>VWR</td><td>10806-330</td><td></td></tr><tr><td>无 DNase/RNase 蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express 可编程显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtotips 微量上样吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>细尖画笔</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>肉蝇蛹，&amp;nbsp;&lt;em&gt;Sarcophaga bullata&lt;/em&gt;</td><td>Ward's Science</td><td>470180-392</td><td></td></tr><tr><td>食用色素染料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃试管</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>胶水</td><td>Elmer's</td><td></td><td>可水洗、无毒学生胶</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 或 P-2000</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr></tbody></table>

蛹期与成虫期显微注射用于nasonia vitripennis的rnai与crispr基因编辑

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

jewel 蜂（Nasonia vitripennis）已成为研究单双倍体性别决定的表观遗传学、B染色体生物学、宿主-共生体相互作用、物种形成以及毒液合成的高效模式系统。尽管已有包括CRISPR/Cas9在内的多种分子工具可用，但对该生物的功能遗传学研究仍然有限。在N. vitripennis中应用CRISPR/Cas9技术的主要限制源于胚胎显微注射的技术难题。由于胚胎体积小，且胚胎发育依赖于寄主蛹，因此对该生物乃至多数寄生蜂类的胚胎注射尤为困难。为克服这些挑战，研究人员优化了通过成虫注射将Cas9核糖核蛋白复合物递送至雌性&#160;卵巢的方法，取代传统的胚胎显微注射，实现了体细胞及可遗传的生殖系编辑。研究人员利用ReMOT Control（受体介导的货物卵巢转导）或BAPC（支化两亲性肽胶囊）技术，在蛹期及雌性成虫中优化了注射流程。这些方法被证明是胚胎注射的有效替代方案，能够实现位点特异且可遗传的生殖系突变。

本文介绍了两种简便的蛹期和成虫显微注射方法，可使用飞秒注射仪（femtojet）或移液管进行操作。第一种方法能够更精确地注射液体，对于RNA干扰实验的一致性至关重要；而第二种方法则可用于向Nasonia蛹或成虫体内注射较大量的液体。
代表性结果展示于 表1 存活率良好（20%至89%），且通过所述注射方法可有效获得目标表型（通过RNAi实现基因敲低或通过CRISPR实现基因编辑），无需进行繁琐的卵期注射。
<table fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">阶段</td>
			<td rowspan="2">试剂&#160;</td>
			<td rowspan="2"><st...

本文介绍了对华金小蜂（Nasonia vitripennis）蛹期和成虫期进行高效显微注射的方法，作为胚胎显微注射的可行替代方案，可通过RNA干扰（RNAi）介导的RNA沉默或CRISPR/Cas9基因组编辑介导的基因敲除，实现对目标基因的功能分析。

蛹期与成虫期显微注射用于Nasonia vitripennis的RNAi与CRISPR基因编辑

jewel 蜂（Nasonia vitripennis）已成为研究单双倍体性别决定的表观遗传学、B染色体生物学等方面的高效模式系统，……

针对寄生蜂等非模式昆虫的研究受到限制，原因是胚胎显微注射操作极为困难。我们的方法绕过了这一难题，实现了位点特异且可遗传的生殖系突变。通过向蛹期或成年雌性个体注射，操作快速简便，无需昂贵设备或专门培训即可成功完成胚胎显微注射所需的复杂操作。该技术将使那些没有昂贵设备的普通实验室也能对所使用的任何昆虫模式物种进行功能研究。在优化之后，该方法可用于研究Nasonia中许多其他基因的功能遗传学。我们还认为，该方法可能可用于向Nasonia或其他昆虫递送核酸，以实现遗传转化。首先，将约20只交配后的雌虫单独放入小型玻璃试管中，试管口用棉花塞住。每支试管中加入两只S. bullata寄主，并将蜂类在25°C、30%相对湿度、12小时光照与12小时黑暗交替的条件下饲养2至3天。2至3天后，使用细头毛笔轻轻移出雌虫，以避免持续过度产卵，确保后代发育同步。移出的雌虫可选择重新寄生或在5摄氏度下保存长达一个月。若目标注射阶段需要白色蛹，则将寄生后的宿主置于25摄氏度、30%相对湿度及12:12光暗循环条件下培养7天；若所需发育阶段为黑色蛹，则培养13天；若为年轻的新生成虫，则培养14天。当达到所需阶段时，用解剖针轻轻敲破宿主蛹壳，以回收N. vitripennis的蛹和成虫。在载玻片中央涂抹一条学生用胶水，以制备载玻片。用解剖针将胶水摊开，形成较厚的一层，用于固定蛹体。在转移蛹之前，让胶水干燥约两分钟。在解剖显微镜下，使用解剖针将胶水涂抹在蛹头部的背面。将蛹腹部朝上，固定在载玻片的胶层上。将20至30只蛹并排排列在载玻片上。将带有蛹的载玻片和一个培养皿放置约10分钟，使胶水充分固化。在开始注射前，用解剖针轻轻推动蛹，检测其与胶水的粘附情况。如果大多数蛹松动脱落，则需重新制备新的载玻片。或者，移除所有松动的蛹，仅对牢固附着在载玻片上的蛹进行注射。将一根毛细玻璃管装入拉针仪中，按照制造商的说明制备微针。使用微量移液器吸头吸取5 µL已配制好的注射混合液，注入微针中。将针头在由两张重叠载玻片构成的表面上滑动，以打开针尖。或者，使用精细镊子打开针头尖端，形成锋利边缘。将排列好的蛹置于解剖显微镜下的载玻片上，然后将针插入 FemtoJet 的注射管中，并拧紧夹持头。在显微镜下观察针头，打开FemtoJet，通过旋转旋钮调节补偿压力和注射压力参数。将针头以约30度的垂直角度小心插入第二和第三可见腹节之间。持续注入液体，直至白色蛹期个体的整个腹部变为绿色，或黑色蛹期个体的腹部明显膨胀。当明显观察到腹部无法再容纳更多液体或液体开始从虫体流出时，停止注射。小心转移至下一只蛹，并重复上述步骤。将载有已注射蛹的载玻片转移至培养皿中。将培养皿盖上皿盖，置于 25 摄氏度环境中，直至寄生蜂羽化。成虫制备时，用细毛笔将 20 头未交配雌虫分组转移至洁净的小型离心管中。将载玻片置于冰上冷却，于解剖显微镜下，

pupal-adult-injections-for-rnai-crispr-gene-editing-nasonia

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

纳索尼亚维特里彭尼斯的 Rnai 和克里斯普基因编辑的普帕尔和成人注射

在模式生物中，转基因技术可操控基因功能，而RNA干扰（RNAi）则可降低特定mRNA转录水平1-2。本实验方案旨在介绍将稳定遗传的DNA和瞬时双链RNA导入嗜尸线虫Pristionchus...

通过显微注射实现嗜尸线虫Pristionchus pacificus的RNAi介导基因敲低与转基因

RNA干扰（RNAi）是揭示基因功能的极为重要的工具。然而，在主要的人类疟疾传播媒介冈比亚按蚊（Anopheles...

向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

通过胚胎显微注射将核酸递送至全球重要农业害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata

对Nasonia vitripennis胚胎进行显微注射是实现可遗传基因组修饰的关键方法。本文详细描述了Nasonia...

用于Nasonia vitripennis基因组操作的胚胎显微注射与移植技术

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

我们提供了一种详细的方案，用于饲养火衣鱼（Thermobia...

火虫 Thermobia domestica 中的卵显微注射与高效交配用于基因组编辑

昆虫真社会性的许多特征依赖于巢群内部的交流与劳动分工。通过显微注射和CRISPR介导的突变技术对蚂蚁胚胎中的关键调控基因进行遗传操作，有助于揭示真社会性昆虫利他行为的本质。...

蚂蚁Harpegnathos saltator中通过胚胎注射实现CRISPR介导的诱变

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

本文提供了用于采集和显微注射玉米叶蝉的合子前胚胎的实验方案，旨在通过基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术对其基因组进行修饰，或通过种系转化插入带有标记的转座元件。...

玉米叶蝉（Peregrinus maidis）胚胎的显微注射用于CRISPR/Cas9基因组编辑

本文展示了在雌雄同体斯氏线虫（Steinernema...

基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

学习在Nasonia vitripennis中进行蛹期和成虫期注射的方法，利用RNAi和CRISPR/Cas9技术实现基因功能分析。该技术无需胚胎显微注射，操作简便且存活率高，为昆虫遗传学研究提供了实用工具。

蛹期与成虫期显微注射用于Nasonia vitripennis的RNAi与CRISPR基因编辑

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