Name: Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Erfahren Sie die serielle Synchrotron-Kristallographie mit Festziel-Chips an der Diamond Light Source. Diese Methode ermöglicht dynamische Proteinstudien bei Raumtemperatur mit minimalem Probenverbrauch und Echtzeit-Datenvisualisierung.

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Diese Arbeit wurde durch das iNEXT-Discovery (Grant 871037) unterstützt, das durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission finanziert wird.

1. Vorbereiten und Laden eines Chips
HINWEIS: Der Prozess findet in einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung statt (Abbildung 1), typischerweise zwischen 80% und 90% oder höher relativer Luftfeuchtigkeit, um das Austrocknen von Proteinkristallen zu verhindern. Einmal geladen und versiegelt, können Kristalle mehr als 24 Stunden überleben. Dies kann jedoch zwischen den Kristallsystemen stark variieren. Innerhalb der Kammer werden eine an einer Ladestufe befestigte Vakuumpumpe mit geringer Leistung benötigt, um einen Siliziumchip(Abbildung 1),einen Siliziumchip, einen Chiphalter mit Polyesterfolie(Abbildung 2),eine p200-Pipette, 200-μL-Pipettenspitzen, eine Pinzette, Filterpapier und die Proteinkristallschlämme aufzunehmen.
<ol><li>Bereiten Sie einen Chiphalter vor.<ol>
<li>Schneiden Sie zwei Blätter Polyesterfolie in Quadrate ca. 6 cm x 6 cm.</li>
		<li>Legen Sie die Polyesterplatten über die beiden Grundplatten (groß und klein).</li>
		<li>Befestigen Sie die Polyesterplatten mit den Metalldichtungsringen an Ort und Stelle.</li>
		<li>Ziehen Sie vorsichtig an der überschüssigen Polyesterfolie, um Falten zu entfernen, um die Visualisierung und Zentrierung der Proben später zu erleichtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie einen Siliziumchip mit entsprechend großen Aperturen (7-30 μm) relativ zur Größe der Kristalle.</li>
	<li>Glühentladung des Chips für 25 Sekunden bei 0,39 mBar und mit einem Strom von 15 mA, um eine einfache Verteilung von Mikrokristallen auf dem Chip zu ermöglichen.</li>
	<li>Platzieren Sie den Siliziumchip mit einer Pinzette auf der Chipladestufe mit den erhöhten Stäben nach unten.</li>
	<li>Tragen Sie 200 μL der Mikrokristallschlämme mit einer Pipette auf die flache Seite des Chips auf.</li>
	<li>Verteilen Sie die Kristallschlämme, um alle "Stadtblöcke" des Chips abzudecken.</li>
	<li>Wenn der Chip beschädigt ist, bedecken Sie alle Löcher mit einem kleinen Stück Polyesterfolie oder einer Filterpipettenspitze, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Vakuum angewendet werden kann.</li>
	<li>Wenden Sie ein sanftes Vakuum an, bis die gesamte überschüssige Flüssigkeit durch den Chip gesaugt wurde.</li>
	<li>Entfernen Sie den Chip mit einer Pinzette aus der Spanladestufe.</li>
	<li>Tupfen Sie die Unterseite des Chips vorsichtig mit Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie den beladenen Chip auf die größere Hälfte des Chiphalters zwischen den Führungsmarken flach mit der Seite nach unten.</li>
	<li>Versiegeln Sie den Chip, indem Sie die kleine Hälfte des Chiphalters darauf legen.<ol>
<li>Die beiden Hälften des Chiphalters rasten ein. Wenn die zweite Hälfte nicht bündig sitzt, drehen Sie den Halter um 180 °, um die Magnete richtig auszurichten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schrauben Sie den Chiphalter mit Sechskantschrauben zu, um den Chip sicher zu fixieren. HINWEIS: Alternativ kann ein "chiploser" Chip auf ähnliche Weise beladen werden, wobei ein kleineres Volumen an Kristallschlämme (~ 15 μL) zwischen den beiden Polyesterfolienschichten im Chiphalter 37eingeklemmt ist, oder ein kleineres Volumen kann mit einem 50 μm dicken doppelseitigen Klebeabstandshalter geladen werden, der wie zuvor beschrieben direkt auf die Polyesterfolie aufgetragen wird 38 . Die Verwendung von Selbstabstandhaltern ermöglicht es auch, mehrere Proben (oder Varianten von Proben wie Ligandeneinweichen) auf jeden chiplosen Chip zu laden. Ein komplementärer Ladeansatz, der den akustischen Fallauswurf (ADE) zum Laden von Siliziumchips nutzt, kann auch bei Diamond39verwendet werden. ADE ermöglicht das Beladen von Chips mit kleineren Mengen an Kristallschlämm als die Pipettenbeladung. Es ist eine besonders nützliche Technik, wenn Proben knapp sind, obwohl die chemische Zusammensetzung und Viskosität der Aufschlämmung berücksichtigt werden müssen.</li>
</ol>2. GUI und Setup an der Beamline
<ol><li>Führen Sie die gesamte Chipausrichtung und -einrichtung für die Datenerfassung über eine einfache grafische Benutzeroberfläche (GUI) des EPICS Display Managers (edm) durch (Abbildung 3a). Dies bietet eine Point-and-Click-Schnittstelle zur Beamline-Instrumentierung und liefert Eingabeparameter für die Python-basierte Datenerfassung. Unterfenster bieten zusätzliche Steuerung für die Erfassung aus Teilbereichen eines Probenhalters (Abbildung 3b) oder Laser-/LED-Pumpsondenexperimente (Abbildung 3c).</li>
</ol>3. Ausrichtung des Chips
<ol><li>Platzieren Sie den geladenen Chip auf der XYZ-Stufe an der Beamline (siehe Abbildung 4a) mit den kinematischen Halterungen.<ol>
<li>Achten Sie darauf, die Etappen nicht entlang ihrer Fahrtrichtung zu ziehen. Die Magnete in den kinematischen Halterungen sind ziemlich stark, so dass dies ganz einfach durch Zufall geschehen kann.</li>
		<li>Bei Annäherung an die Halterung sollte der Chiphalter in einem leichten Winkel (±30°) gehalten werden. Wenn die Magnete Kontakt aufnehmen, lassen Sie den Chiphalter parallel zum Boden drehen (0°) und der Chiphalter rastet ein (Abbildung 4b).</li>
		<li>Beim Entladen eines Chips folgen Sie einem umgekehrten Pfad. Drehen und winkeln Sie den Chip von den Stufen weg, bevor Sie den Chiphalter wegziehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie das On-Axis-Betrachtungssystem der Beamline und die Chip-Ausrichtungs-GUI, um die obere linke Fiducial des Chips zu lokalisieren. Fiducials sind drei Quadrate, zwei kleine und ein großes, im rechten Winkel zueinander (Abbildung 5a). Der Chip ist wieder beleuchtet, so dass der Chip dunkel mit Öffnungen als weiße Quadrate erscheint.</li>
	<li>Zentrieren Sie die Fiducial-Null in X, Y und Z (Abbildung 5b). Richten Sie X und Y aus, indem Sie sich nach links/rechts bzw. nach oben/unten bewegen. Richten Sie Z aus, indem Sie den Chip in und aus dem Fokus bewegen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Fiducial Zero setzen .</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.2 für fiducial one (oben rechts, Abbildung 5c) und fiducial two (unten links, Abbildung 5d),um alle Fiducials mit dem Röntgenstrahl auszurichten.</li>
	<li>Erzeugen Sie eine Koordinatenmatrix durch Drücken des Make-Koordinatensystems,das den Offset, die Nickung, das Rollen und das Gieren des Chips relativ zu den Stufen berechnet, so dass alle nachfolgenden Bewegungen im Chip-Koordinatenrahmen ausgeführt werden können.</li>
	<li>Klicken Sie auf Blockprüfung, um die XYZ-Stufe in die erste Vertiefung jedes Stadtblocks zu verschieben, um visuell zu bestätigen, dass der Chip gut ausgerichtet ist.</li>
	<li>Wenn das Röntgenkreuz mit den Öffnungen übereinstimmt, ist der Chip ausgerichtet. Ist dies nicht der Fall, wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.3. HINWEISE: Bei Schwierigkeiten beim Ausrichten (gebrochene Fiducials) können über das Pulldown-Menü "Ausrichtungstyp" verschiedene Blenden auf dem Chip für die Ausrichtung verwendet werden. Für die Erfassung fester Zieldaten stehen viele verschiedene Chiptypen zur Verfügung. Verschiedene Chiptypen werden durch die Verwendung des Pulldown-Menüs "Chiptyp" berücksichtigt. Die am häufigsten verwendeten Chiptypen, die bei I24 verwendet werden, sind "Oxford" und "Custom" -Chips. Die Anzahl und der Abstand von Aperturen und Fiducials auf dem Chip werden aus einem Chip-Wörterbuch ausgelesen, das über das Pulldown-Menü definiert ist. Der benutzerdefinierte Chip ermöglicht es, den Blendenabstand im laufenden Betrieb zu definieren, was besonders nützlich ist für Dünnschicht-Sheet-on-Sheet- oder andere "chiplose" Chips, bei denen sich Kristalle zufällig über denHalter befinden 37. Eine neue Python-GUI, die Move-on-Click-Funktionalität und automatisierte Chip-Ausrichtung bietet, befindet sich derzeit in der Entwicklung, ist aber zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Manuskripts noch nicht für den routinemäßigen Einsatz bereit.</li>
</ol>4. Einrichtung der Datenerhebung
HINWEIS: Die Einrichtung der Datenerfassung hängt vom untersuchten System und dem durchzuführenden Experiment ab. Dies kann vom einfachsten SSX-Experiment, dem Sammeln einer Niedrigdosisstruktur, bis hin zu einem zeitaufgelösten Experiment mit Lasern oder schnellem Mischen reichen, um eine Reaktion einzuleiten, die mehrere vollständige Datensätze mit unterschiedlichen Zeitverzögerungen erfordert. Um eine Datensammlung einzurichten, müssen die folgenden Parameter definiert werden.
<ol><li>Experimentelle Variablen: Geben Sie je nach Bedarf den Ordner, den Dateinamen, die Belichtungszeit, die Übertragung, die Detektorentfernung und die Anzahl der Aufnahmen pro Blende ein.</li>
	<li>Chiptyp: Passen Sie den Chiptyp wie oben beschrieben an den verwendeten Chip an.<ol>
<li>Wenn ein dünner Film oder ein "chiploser" Chip verwendet wird, stellen Sie den Chiptyp auf Keine ein.</li>
		<li>Definieren Sie die Anzahl der Schritte und die Schrittgröße in x und y in der GUI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie den Kartentyp fest: Dadurch können Unterabschnitte eines Chips für die Datenerfassung ausgewählt werden (Abbildung 3b). "Keine" bedeutet, dass Daten von jeder Blende auf einem Chip gesammelt werden. "Lite" bedeutet, dass Daten aus ausgewählten Stadtblöcken auf dem Chip gesammelt werden (Abbildung 3b). Dies kann nützlich sein, wenn beispielsweise bekannt ist, dass ein Bereich eines Chips schlecht geladen oder leer ist. Mit "Full" können einzelne Blenden für die Datenerfassung ausgewählt werden. In diesem Fall muss eine korrekt formatierte Textdatei bereitgestellt werden. Details und eine Vorlage erhalten Sie von beamline-Mitarbeitern.</li>
	<li>Pump-Probe: Wählen Sie die Art des Pumpensondenexperiments und die gewünschte Zeitverzögerung. Die Auslösung der Pumpe (in der Regel eine LED oder ein Laser) ist oft spezifisch für ein bestimmtes Experiment, wird hier also nicht im Detail beschrieben.<ol>
<li>"Kurze" Verzögerungen beziehen sich auf Experimente, bei denen an jeder Öffnung zwischen der Pumpe und der Sonde ein Verweilen besteht (d. h. Pumpe, Sonde, "zur nächsten Probe bewegen"). Verzögerungen liegen in der Regel in der Größenordnung von 1 Sekunde oder mehreren zehn Millisekunden.</li>
		<li>Lange Verzögerungen beziehen sich auf eine EAVA-Strategie (Excite and Visit Again), bei der Aperturen zweimal besucht werden, mit einer definierten Zeitverzögerung zwischen den Besuchen (z. B. Pumpen, Bewegen, Pumpen, Bewegen, Sonde, Bewegen, Sonden, Sonden, Sonden usw.). Die Zeitverzögerung wird berechnet und Röntgenbelichtungszeiten (Abbildung 3c) und beträgt typischerweise ~ 1 Sekunde oder mehr.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gemeinsame Datenerhebungsmethoden
HINWEIS: Im Folgenden sind die wichtigsten Parameter aufgeführt, die die Art des durchgeführten Experiments definieren. In diesem Abschnitt wird davon ausgegangen, dass die anderen Einstellungen aus Protokoll 3 "Datenerfassung einrichten" definiert wurden.
<ol><li>
Szenario 1: Datenerfassung mit niedriger Dosis. Erfassung eines einzelnen Beugungsbildes aus jeder ausgewählten Blende auf dem Probenhalter.<ol>
<li>Stellen Sie die Anzahl der Aufnahmen pro Blende auf 1 ein.</li>
		<li>Stellen Sie die Pumpensonde auf Keine ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Szenario 2: Eine Dosisreihe, bei der n Bilder nacheinander von jeder ausgewählten Blende auf dem Probenhalter gesammelt werden. Der Chip ist an jeder Blende stationär, während jeder Satz von n Bildern gesammelt wird.<ol>
<li>Stellen Sie die Anzahl der Aufnahmen pro Blende auf 'n' ein. Beachten Sie, dass die Verarbeitung vereinfacht wird, wenn n= 5, 10, 20 oder ein anderes Vielfaches von 10 ist. Es ist schwierig, Trends zu ermitteln, wenn n < 5. Es ist nützlich, die Gesamtzeit zu berücksichtigen, die benötigt wird, um einen Chip abzudecken, und die Anzahl der Bilddateien, die erzeugt werden, wenn n erhöht wird.</li>
		<li>Stellen Sie die Pumpensonde auf Keine ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Szenario 3: Pump-Probe-Verfahren<ol>
<li>Wählen Sie eine Methode aus dem Pulldown-Menü Pump Probe aus, um das Laser Excitation Control Center zu öffnen.</li>
		<li>Für ein Pumpensondenexperiment füllen Sie die Laserverweildauer bei jeder Öffnungsoption aus.</li>
		<li>Für EAVA füllen Sie die Laserverweildauer bei jeder Blende und Röntgenbelichtung aus und klicken Sie auf Berechnen.</li>
		<li>Wählen Sie die entsprechende Option Wiederholen im Dropdown-Menü der edm-GUI-Pumpensonde für die gewünschte Verzögerungszeit aus.</li>
		<li>Wenn das Experiment einen Vorbeleuchtungsschritt erfordert, füllen Sie den Abschnitt Laser 2 Dwell aus.</li>
		<li>Nachdem alle experimentellen Variablen definiert sind, drücken Sie Parameter setzen und kurze Liste erstellen. Dadurch werden experimentelle Variablen auf den Geobrick-Controller geladen. Nachdem dies erledigt ist, bewegt das Drücken von Start den Detektor hinein, die Hintergrundbeleuchtung und startet die Datenerfassung. An allen Stellen der Datenerfassung ist es sinnvoll, ein Terminalfenster geöffnet zu haben, in dem Feedback zum Status und Ergebnis der einzelnen Schritte gedruckt wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Datenverarbeitung
HINWEIS: Im Großen und Ganzen kann die Datenverarbeitung in drei Gruppen unterteilt werden, basierend auf der Dringlichkeit, mit der Feedback erforderlich ist. Schnelles Feedback ist erforderlich, um zu zeigen, ob Kristalle vorhanden sind und sich beugen, und wenn ja, in welcher Anzahl. Dies sollte mit der Datenerfassung Schritt halten. Durchführung der Datenindizierung und -integration, die langsamer sein kann, aber dennoch auf vergleichbaren Zeitskalen mit der Datenerfassung durchgeführt werden sollte. Das Zusammenführen und Skalieren von Reflexionsintensitäten in eine mtz-Datei zur Strukturlösung und zur Erzeugung von Elektronendichtekarten stellt den letzten Schritt dar und kann noch langsamer sein. Hier werden startende Pipelines bei I24 nur für die ersten beiden Stufen diskutiert, da sie für Echtzeit-Feedback erforderlich sind, um Ihr Experiment zu leiten, obwohl zu beachten ist, dass Metriken wie Trefferraten und Skalierungsstatistiken kein Ersatz für die Überprüfung der Elektronendichte sind, die die einzige Bestätigung liefern kann, dass ein Ligand gebunden hat oder eine Reaktion stattgefunden hat. in crystallo.
<ol><li>Schnelles Feedback<ol>
<li>Um die Datenverarbeitungsmodule zu laden, geben Sie module load i24-ssx in die Klemme einer beliebigen Beamline-Workstation ein.</li>
		<li>Um die Trefferfindungsanalyse auszuführen, geben Sie i24-ssx /path/to/visit/directory/ in das Terminal ein: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ HINWEIS: Dies öffnet drei Terminalfenster und, sobald Daten auf die Festplatte geschrieben wurden, eine grafische Darstellung der Spot-Finding-Ergebnisse aus Der Beugungsintegration für Advanced Light Sources (DIALS) 40,41(Abbildung 6a).<ol>
<li>Die Standardeinstellungen bewerten alle 10. Bilder und werden alle paar Sekunden aktualisiert, um die Rechenlast zu minimieren.</li>
			<li>Ändern Sie den Standardwert, indem Sie am Ende des obigen Befehls ein Argument hinzufügen. Zum Beispiel würde 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx die Treffersuche auf jedem anderen Bild ausführen. Dies kann jedoch den Cluster (eine gemeinsam genutzte Ressource!) übermäßig belasten und die Verarbeitungszeiten verlangsamen. Das Diagramm ist farbcodiert, basierend auf der Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Indizierung, Rot zeigt an, dass mindestens 15 Bragg-Spots gefunden wurden (gute Chance auf Indizierung), Blau zeigt wenig bis gar keine nützliche Beugung.</li>
			<li>Zeigen Sie Beugungsbilder von Interesse im DIALS-Bildbetrachter an, indem Sie auf die Spots auf der Spot-Finder-Oberfläche klicken.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Feedback zur Indizierung und Integration HINWEIS: Die Indizierung und Integration von Beugungsdaten erfolgt mit DIALS unter Verwendung der dials.still_process Funktion 40,41. Daher sollten spezifische Informationen zu Ihrem Kristall (erwartete Kristallraumgruppe, Elementarzelle und eine Experimentgeometrie) in eine .phil-Textdatei eingefügt werden.<ol>
<li>Laden Sie DIALS-Module, indem Sie Modulladewahlräder in ein Terminal eingeben.</li>
		<li>Um mit der Verarbeitung eines Datensatzes zu beginnen, geben Sie dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.philein. Der Fortschritt aller noch verarbeitenden Datensätze kann durch Ausführen des stills_monitor-Skripts überwacht werden, indem monitor_stills_process.py eingegeben wird (nach dem Laden des Moduls i24-ssx und dem Ändern des Verzeichnisses zum aktuellen Besuch) ( Abbildung6b).</li>
		<li>Die Unit-Cell-Verteilung indizierter Beugungsdaten (Abbildung 7a) kann mit dem Befehl ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true überwacht werden Dies ist besonders nützlich, um Elementarzellenpolymorphe zu identifizieren und aufzulösen, wie zuvor besprochen 42.</li>
		<li>'Visualzie', wenn und wie diese Verteilung über ein festes Ziel variiert, indem ein 2D-Plot (Abbildung 7b) mit dem Befehl python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.outerzeugt wird.</li>
		<li>Erstellen Sie stereografische Projektionen aller indizierten Beugungsdaten (Abbildung 7c) mit dem Befehl DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt. HINWEIS: Es ist eine häufige Pathologie bei der Verarbeitung von Standbilddaten von Kristallen, bei denen die Symmetrie des Bravais-Gitters höher ist als die Raumgruppensymmetrie, die zusammengeführte Daten als perfekter Zwilling erscheinen. Datenverarbeitungsalgorithmen haben sichentwickelt,um diese Pathologie zu lösen 43,44,45,46, aber Benutzer sollten dies bei der Verarbeitung ihrer Daten beachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die serielle Synchrotrondatenerfassung ist eine relativ neue Technik an MX-Beamlines, die die Lücke zwischen den ultraschnellen Datenerfassungen, die derzeit bei XFELs durchgeführt werden, und dem herkömmlichen Synchrotron-basierten MX schließt. Dieses Manuskript soll einen Überblick darüber geben, wie feste serielle Zieldaten an der Beamline I24, Diamond Light Source für niedrige Dosen, Dosisreihen und zeitaufgelöste Experimente erfolgreich gesammelt werden können. Wie bei der Standardkristallographie ist die Probenvorbereitung eine wichtige Lösung für den Flaschenhals in der Struktur. SSX ist nicht anders, und die Herstellung einer homogenen Kristallaufschlämmung in ausreichenden Mengen hat noch nicht von mehreren Jahrzehnten der Untersuchung und Verfeinerung profitiert, wie es das Wachstum einzelner großer Proteinkristalle getan hat. Die Vorbereitung dieser Aufschlämme geht jedoch über den Rahmen dieses Papiers hinaus und wurde an anderer Stelle zusammengefasst36. Der kritische Schritt in dem hier beschriebenen Ansatz beinhaltet die sorgfältige Verwendung der verfügbaren Probe unter Verwendung einfach zu bedienender GUI-Schnittstellen (Schritt 3) und automatisierter Datenverarbeitungspipelines (Schritt 6), um die Chipladung (Schritt 1) und den Ablauf eines Experiments zu informieren.
Die schnelle Feedback-Pipeline ist ein leistungsstarkes Tool, mit dem Benutzer die anfänglichen Trefferraten während der Datenerfassung bewerten können, um nachfolgende Chip-Ladeprotokolle für eine erfolgreiche Datenerfassung zu informieren. Bei einer niedrigen Trefferquote (<5 %) riskieren Benutzer, unvollständige Daten zu sammeln und/oder Strahlzeit mit zusätzlichen Sammlungen zu verschwenden. In diesem Fall könnte die Probe gepoolt, durch sanfte Zentrifugation konzentriert und/oder größere Volumina in Schritt 1.5 geladen werden. Eine höhere Trefferquote ist im Allgemeinen günstig, es gibt jedoch einen Punkt der abnehmenden Rendite, an dem die Überlastung zu mehreren Kristallen im selben Bohrloch führt. DIALS ist in der Lage, mit Multigitterbeugungsdatenumzugehen 50, aber ein größeres Problem als die Indexierung und Integration ist die nachteilige Wirkung, die kristallgruppierung auf die gleichmäßige Aktivierung von Kristallen durch Laserlicht oder schnelles Mischen für präzise zeitaufgelöste Experimente haben kann. Es sollte daher besonders darauf geachtet werden, dass feste Ziele für zeitaufgelöste Experimente nicht überlastet werden.
Der Bearbeitungs- und Integrationsschritt ergibt ein Diagramm, wobei das zentrale Kreuz die Strahlrichtung darstellt, wobei jeder Punkt die Richtung der hkl 001-Reflexion einzelner Gitter darstellt und der äußere Ring des Kreises eine Drehung von 90° von der Strahlachse darstellt. Dies zeigt, ob Ihre Kristalle eine bevorzugte Ausrichtung haben, was sich auf die Vollständigkeit der Daten auswirken und auf die Notwendigkeit hinweisen kann, mehr Daten zu sammeln oder das Ladeprotokoll zu variieren. Im linken Bereich von Abbildung 7cist der Effekt der Überlastung eines Chips mit HEWL-Kristallen dargestellt. Wenn sich die Öffnungen mit mehr Kristallen füllen, haften sie an den abgewinkelten Wänden der Öffnungen, anstatt sich an der Basis in einer zufälligen Ausrichtung zu verkeilen. Die beiden orthogonalen Ellipsen sind das Ergebnis von Kristallen, die an den Innenwänden des Chips liegen und sich bei ~35° zur Strahlrichtung befinden. Dies reduziert das Volumen der geladenen Kristalle, reduziert die Trefferrate und reduziert drastisch den Anteil der Kristalle, die in diesen bevorzugten Ebenen liegen.
Es ist zu beachten, dass bei I24 andere serielle Ansätze wie LCP-Extruder und mikrofluidische Chips verfügbar sind. Diese verwenden ähnliche GUIs und die gleichen Verarbeitungspipelines, so dass viele der oben genannten Punkte auch dann anwendbar bleiben, wenn eine andere Technik verwendet wird. Über den hier beschriebenen Fixed-Target-Ansatz hinaus gibt es eine Reihe von seriellen Ansätzen sowohl für SSX als auch für SFX, von denen jeder bestimmte Vorteile gegenüber dem anderen hat, abhängig von dem durchzuführenden Experiment und der für das Experiment verwendeten Beamline. Da sich serielle Ansätze schnell entwickeln, ist es ratsam, die Beamline-Webseiten (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) auf aktuelle Aktualisierungen zu überprüfen und so früh wie möglich bei der Planung der Beamtime mit den Beamline-Mitarbeitern zu sprechen. Der Zugang zu I24 für Standard- und Serienexperimente ist am Einsatzort kostenlos. Für Nutzer aus dem Vereinigten Königreich und der EU werden die Reise- und Aufenthaltskosten teilweise durch iNEXT Discovery übernommen.

Die serielle Synchrotronkristallographie (SSX) ist eine aufkommende Methode der Datenerfassung, die von Röntgenlasern mit freiem Elektronen (XFEL)1,2,3inspiriert wurde. An einem XFEL wird ein einzelnes Beugungsmuster aus einem meist sehr kleinen Proteinkristall aufgezeichnet, bevor der Kristall durch den extrem hellen Röntgenpuls zerstört wird. Dies bedeutet typischerweise, dass ein neuer Kristall in den Röntgenstrahl eingebracht werden muss, um ein weiteres Beugungsmuster zu erhalten4. Diese Notwendigkeit, Kristalle kontinuierlich aufzufüllen, hat die Entwicklung vieler serieller Probenabgabetechniken vorangetrieben5.
An Synchrotrons sind klassische (nicht-serielle) Rotationskristallographie-Methoden weit verbreitet, wobei ein einzelner großer Kristall, der in einem Röntgenstrahl mit einem Goniometer gedreht wird, genutzt wird, um einen vollständigen Datensatz für die Strukturlösung6zu sammeln. Um die Lebensdauer von Kristallen zu erhöhen, so dass ein vollständiger Datensatz gesammelt werden kann7,8, und auch um den Versand und den automatisierten Probentransfer zu erleichtern, werden Kristalle zur Datenerfassung auf ~ 100 K kryokooliert. An intensiven Mikrofokus-Beamlines werden häufig Multikristallstrategien eingesetzt, da Strahlenschäden die Erfassung eines vollständigen Datensatzes aus einem Einkristall verhindern können9,10,11. Trotz der Grenzen, die durch Strahlenschäden auferlegt werden, bleibt die Anzahl der verwendeten Kristalle relativ bescheiden und der verwendete Ansatz ist im Wesentlichen identisch mit dem Einkristallexperiment.
SSX hingegen verwendet die serielle Probenabgabe, um einzelne Stillbeugungsmuster aus Tausenden von zufällig orientierten Kristallen zu erhalten, um einen vollständigen Datensatz zu generieren. Es wird darauf hingewiesen, dass serielle Techniken, die Kristallrotationbeinhalten,in der Entwicklung12,13 sind, obwohl wir uns auf stille, Nullrotationsansätze konzentrieren. Es gibt eine Vielzahl von Probenabgabesystemen mit unterschiedlichen Vor- und Nachteilen14, die von der Lieferung eines Kristallstroms in einem strömungsfokussierten/ viskosen Jet15,16,17, mikrofluidischen Chip18,19oder Kristallen auf einem festen Ziel wie einem geätzten Siliziumchip20,21 . Typischerweise werden Kristalle bei Raumtemperatur gehalten, so dass eine größere Konformationsvielfalt beobachtet werden kann und eine physiologisch relevantere Umgebung geschaffen wird22. SSX ermöglicht die Sammlung von Datensätzen mit sehr niedriger Dosis23, da die Gesamtdosis des Datensatzes einer einzelnen kurzen Röntgenexposition eines Kristalls entspricht. Ein weiterer großer Vorteil, den SSX bietet, ist die Untersuchung der Proteindynamik durch zeitaufgelöste Methoden, wobei Reaktionen durch die Exposition gegenüber Laserlicht24,25,26,27oder durch Mischen von Kristallen und Liganden /Substraten 28,29ausgelöst werden. Die Verwendung kleinerer Kristalle bedeutet, dass Laserlicht die Gesamtheit des Kristalls durchdringen kann und die Reaktion ohne Multiphotonenabsorption gleichmäßig einleitet, um gut definierte Reaktionszwischenprodukte für Beugungsdaten bereitzustellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden27. Die Verwendung größerer Kristalle und rotationsbasierter Datenerfassungsmethoden leidet unter einer begrenzten Lasereindringtiefe, ungleichmäßiger oder Multiphotonenaktivierung, Strahlungsschäden und mechanischer Overhead-Zeit innerhalb von Daten-Sweeps, was zu einer Mischung von Reaktionszwischenprodukten führt, die sich bei schnelleren Reaktionsgeschwindigkeiten als schwierig oder unmöglich zu interpretieren erweisen können. Kleinere Kristalle bieten einen ähnlichen Vorteil bei Mischexperimenten, da Liganden schnell und gleichmäßiger durch den Kristall diffundieren können, was wiederum die Aufzeichnung definierter Reaktionszwischenprodukte mit unterschiedlichen Zeitverzögerungen ermöglicht30,31,32.
An Diamonds Mikrofokus-Beamline I24 können sowohl konventionelle Rotations- als auch SSX-Experimente durchgeführt werden. Hier werden ein umfassendes Protokoll für die SSX-Probenvorbereitung und Datenerfassung unter Verwendung fester Ziele bei I24 und Protokolle zur Datenanalyse serieller Daten bei Diamond vorgestellt. Während das Manuskript und die begleitenden Videos es den Benutzern ermöglichen sollten, ein erfolgreiches SSX-Experiment am I24 durchzuführen, sollte beachtet werden, dass dies ein sich schnell entwickelndes Feld ist und sich die Ansätze ständig weiterentwickeln. Es sollte auch beachtet werden, dass serielle Methoden an anderen Synchrotronquellen verfügbar sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI und PXII)34und NSLS (FMX)35. Während sich die Besonderheiten der seriellen Datenerfassung und -verarbeitung zwischen den Quellen unterscheiden, bleiben die Kernprinzipien die gleichen. Die folgenden Protokolle sollten als Ausgangspunkt und Weg zum Basislager und nicht als Höhepunkt dessen, was erreicht werden könnte, angesehen werden.
Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Benutzer ein Protein- oder niedermolekulares Kristallsystem haben, aus dem eine Mikrokristallaufschlämmung in der Größenordnung von 0,5-2,0 ml mit einer guten Dichte an Mikrokristallen pro ml hergestellt wurde. Protokolle zur Gewinnung von Kristallschlämmen wurden zuvor beschrieben 36. Viele verschiedene Arten von festen Zielen sind verfügbar, die am häufigsten verwendeten bei I24 verwenden einen genau definierten Siliziumchip. Um sich von anderen Chip-Layouts zu unterscheiden, wird dies unten und in der Beamline-Schnittstelle als "Oxford-Chip" bezeichnet. Wie bereits beschrieben, besteht das Oxford-Chip-Layout aus 8×8 "Stadtblöcken" mit jeweils 20×20 Blenden für insgesamt 25.600 Blenden20,21.

<table><tbody><tr><td>Chiphalter</td><td>Sonderanfertigungen</td><td>N/A</td><td>Hauseigene kundenspezifische metallische Chiphalter, bestehend aus 2 magnetischen Grundplatten, 2 Metallringen und einer kinematischen Halterung.</td></tr><tr><td>Chipless Chip Spacers</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>LCP-Klebeplatten erhältlich als Teil des modularen LCP-Sortiments</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&nbsp; Mehrachsiger Controller/Verstärker mit einer kundenspezifischen Hardwarekonfiguration der Diamond Light Source</td></tr><tr><td>Kinematische Halterungen</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>Quadratische Sockel mit 3 Magneten, die in einem Dreieck angeordnet sind und an Chiphaltern befestigt sind.</td></tr><tr><td>KNF Laboport Vakuumpumpe</td><td>Merck</td><td>Z262285-1EA</td><td>Fest-PTFE-Vakuumpumpe, 10 l/min Saugvermögen.</td></tr><tr><td>Mylar Platten 6 & Mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15360562</td><td>300 ft Rolle mit 6 & Mikro; m dicke Mylar-RFA-Folie von SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar Sheets 3 & micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>300 ft Rolle mit 3 & Mikro; m dicke Mylar-RFA-Folie von SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>Ein kompaktes, eigenständiges Glimmentladungssystem zur Herstellung hydrophiler Oberflächen</td></tr><tr><td>Siliziumchips</td><td>University of Southampton</td><td>N/A</td><td>Kundenspezifische geätzte Siliziumchips mit 25.6000 Öffnungen, die in einer Vielzahl von Größen erhältlich sind.</td></tr><tr><td></td><td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ-Probentische sind ein Gemeinschaftsdesign von Diamond Light Source und SmarAct, das von SmarAct speziell für SmarAct unter Verwendung von drei 50-mm-Verfahrtischen mit linearer Verschiebung, präzisen gekreuzten Rollenführungen und einem integrierten Sensor mit einer Auflösung von bis zu 1 nm angefertigt</td></tr> wurde <tr><td>1byOne Luftbefeuchter (701UK-0003 )</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>Handelsüblicher 1,3-Liter-Ultraschall-Luftbefeuchter</td></tr></tbody></table>

feste serielle zieldatenerfassung an der diamond light source

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Die serielle Datenerfassung ist eine relativ neue Technik für Synchrotronbenutzer. Ein Benutzerhandbuch für die Erfassung fester Zieldaten bei I24, Diamond Light Source, wird mit detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitungen, Zahlen und Videos für eine reibungslose Datenerfassung präsentiert.

Erfassung und Serie von Niedrigdosisdaten Niedrige Dosis- (Schritt 5.1: Szenario 1) und Dosisreihendaten (Schritt 5.2: Szenario 2) wurden an Kupfernitritreduktase-Mikrokristallen bei I24 gesammelt und zuvor veröffentlicht 42. Alle Proben wurden wie in Schritt 1 beschrieben aufbereitet, Daten gemäß den Schritten 3, 4 und 5 gesammelt und mit Methoden in Schritt 6 verarbeitet. In dieser Arbeit wurde eine schnelle Dosisreihe mit 20 Beugungsbildern gesammelt, die bei jeder Blende aufgenommen wurden (d.h. n= 20 in der oben gezeigten Datenerfassungs-GUI), bevor sie zu einer neuen Probe überging. Aus diesen Daten wurde eine bimodale Verteilung von Einheitszellen in der Raumgruppe P213 identifiziert (a = b = c = 97,25 Å und a = b = c = 96,38 Å). Die Identifizierung und Trennung dieser Unit-Cell-Polymorphe für die Verarbeitung zeigte eine deutliche Verbesserung der Datenqualitätsindikatoren und zeigte zwei verschiedene Strukturen in einer flexiblen Schleife zwischen den Resten 189-193 anstelle des gemischten Zustands, der bei der Verarbeitung aller Daten zusammen beobachtet wurde. Die Identifizierung solcher Polymorphe könnte den Unterschied in einer heiklen, zeitaufgelösten Strukturstudie ausmachen, bei der nur kleine strukturelle Veränderungen zu erwarten sind. Darüber hinaus zeigten die gesammelten Dosisreihen eine dosisabhängige Einheitszellveränderung im Kristall, wobei eine erhöhte Dosis die Population zugunsten der größeren Einheitszelle verlagerte.
Ähnliche Arbeiten wurden von Ebrahim et al( 2019)47durchgeführt, wo eine Dosisreihe (Schritt 5.2: Szenario 2) aus einer Farbstoff-Hämperoxidase aus Streptomyces lividans (DtpAa) gesammelt wurde, um niedrig dosierte Strukturen von SSX (Schritt 5.1: Szenario 1) mit denen zu vergleichen, die im selben festen Zielsystem unter Verwendung von SFX gemessen wurden. SFX-Daten wurden an der SACLA Beamline BL2 EH3 mit einer Pulslänge von 10 Femtosekunden und einer Wiederholrate von 30 Hz gesammelt. Die Pulsdauer von 10 Femtosekunden stellt sicher, dass dosisabhängige Effekte in den SFX-Daten nicht vorhanden sind. SFX-Daten wurden mit SSX-Daten verglichen, die auf der Beamline I24 gesammelt wurden, wo 10 aufeinanderfolgende 10-Millisekunden-Expositionen an jeder Probenposition gemessen wurden (d. h. n= 10). Die dosisabhängige Migration eines hämeisenkoordinierten Wassermoleküls weg vom Eisen wurde beobachtet, ebenso wie eine Konformationsänderung in einer der Hämpropionatgruppen der SSX-Dosisreihe. Obwohl nicht wie die SFX-Struktur schadensfrei, erlaubte die Dosisreihe die Extrapolation der Fe-O-Bindungslänge eines Nulldosis-Datensatzes (Eisenhäm), wobei dies innerhalb des experimentellen Fehlers mit dem aus SFX erhaltenen Wert übereinstimmte.
Die hier beschriebenen Methoden der seriellen Kristallographie-Datenerfassung können auch leicht angepasst werden, um neue Probenumgebungen bereitzustellen, um beispielsweise anaerobe Proteinstrukturen bei Raumtemperatur zu untersuchen. Wie in Rabe et al 2020 48beschrieben, ermöglicht das Laden einer "Sheet-on-Sheet"-Probe oder eines "chiplosen Chips" mit verschiedenen Dichtungsfilmen in einer aneroben Kammer die Erfassung von Strukturdaten aus Sauerstoffempfindlichen Proben bei Raumtemperatur.
Pumpensonde Obwohl die folgenden repräsentativen Ergebnisse bei Diamond Beamline I24 nicht gesammelt wurden, wurden diese Methoden in enger Zusammenarbeit zwischen Einrichtungen des iNEXT-Programms entwickelt, um auf Standardmethoden in der entwicklung serieller Kristallographie hinarbeiten zu können. Beamline I24 bietet oder wird in Kürze gleichwertige Sammelmethoden wie die unten beschriebenen anbieten, um solche Experimente mit den in den obigen Protokollen beschriebenen Methoden durchzuführen.
Pumpensonde: Schnelles Mischen Schnelles Mischen von SSX wurde an der Beamline T-REXX bei PETRA III von Mehrabi et al (2019) 28 unter Verwendung eines piezogetriebenen Tröpfcheninjektors durchgeführt, um Reaktionen auf feste Ziele auszulösen. Diese Arbeit präsentiert einen Proof of Principle am Chip-Mischexperiment, das GlcNac3an Lysozym-Mikrokristalle bindet, wobei die Bindung innerhalb von 50 ms nach einem 75-pL-Tropfen auf die Probe erfolgt. Diese Studie wurde mit einer zeitaufgelösten 7-Struktur-Serie von Xylose-Isomerase-Aktivität fortgesetzt, die die Glukosebindung innerhalb von 15 ms und die Bildung einer offenen Ringkonformation im Glukosemolekül nach einer Zeitverzögerung von 60 Sekunden zeigte. Ein gleichwertiger Aufbau für die Tröpfcheninjektion befindet sich derzeit in der Entwicklung für den Einsatz auf I24.
Pump-Probe: Lichtaktivierung Ein lichtaktiviertes Pump-Probe-Serienexperiment wird in Schulz et al (2018) 49vorgestellt. Fluoracetat-Dehydrogenase wurde mit photocagiertem Fluoracetat getränkt und mit 320-360 nm Laserlicht gepumpt, um Strukturen zu 4 Zeitpunkten (t = 0, 30, 752 und 2.052 ms) zu erzeugen. Die Ruhezustandsstruktur (0 ms) zeigt eine leere aktive Stelle, mit Ausnahme einiger Wenigerwassermoleküle, und eine äquivalente Dichte zwischen den Cap-Domänen beider Proteinuntereinheiten. 30 ms und 752 ms nach Lichtaktivierung kann eine signifikante Verringerung der Elektronendichte im Cap-Bereich der Untereinheit B relativ zur Untereinheit A beobachtet werden. Die Verringerung der Elektronendichte im Cap-Bereich der Untereinheit B fällt mit dem Auftreten von Fluoracetat im aktiven Zentrum der Untereinheit A bei 752 ms zusammen. Der endgültige Datensatz bei 2.052 ms zeigt eine weitere strukturelle Umlagerung des Liganden, die im Verdacht steht, die korrekte Geometrie für den SN2-Angriffzu erleichtern, und die potenzielle Bildung eines Zwischenzustands in der Reaktion. Auf I24 kann ein tragbares Pharos-Lasersystem, das von 210-2500 nm abstimmbar ist und Femtosekundenimpulse liefert, zur Lichtaktivierung verwendet werden. Erste Experimente zeigten die erfolgreiche Aktivierung eines Photokäfigs mittels 308 nm Anregung mit Bindung des freigesetzten Liganden an das beobachtete Zielprotein. Zum Zeitpunkt des Schreibens ist die Integration in das Beamline-Personalsicherheitssystem im Gange und routinemäßige Benutzerexperimente werden für Anfang 2021 erwartet. Für Experimente, bei denen weniger intensive Lichtimpulse erforderlich sind, wurde die Lichtaktivierung mit TTL-gesteuerten LEDs erfolgreich durchgeführt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Abbildung 1:Probenladegeräte an der Diamond Light Source. Der Aufbau besteht aus einer Vakuumpumpe ( a ),einemHandschuhfach (b) und einem Luftbefeuchter (c). Innerhalb des Handschuhfachs wird der Vakuumdruck verwendet, um auf einen mit Kristallschlamm beladenen Chip zu wirken, der in einem Probenblock (d) gehalten wird, der an einem Büchnerkolben (e, grüner Pfeil) befestigt ist, über einen Druckregler (f, gelber Pfeil), der an einem Absperrhahn (g, blauer Pfeil) befestigt ist. Feuchte Luft wird über Kunststoffschläuche, die am Luftbefeuchter (h) befestigt sind, in das Zelt gepumpt und mit einem Hygrometer (i) gemessen. Die Komponenten werden mit Klemmständern (j) an Ort und Stelle gehalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Abbildung 2: Probenhalter. Sie verwenden einen Metall-O-Ring (a), um Polyesterfolie auf eine obere (b) und untere (c) Hälfte zu klemmen, wobei die untere Hälfte magnetische Halterungen (d) trägt, die verwendet werden, um den Probenhalter an den Probentischen zu befestigen. Die Polyesterfolie (6 μm(e) oder 3 μm (f)) sowie Gummi-O-Ringe (weiße Pfeile) verhindern, dass ein kristallbeladener Chip in einem mit Sechskantschrauben dicht verschlossenen Probenhalter (g) schnell austrocknet. Chips werden mit sequentiellen 15-Minuten-Bädern in dH2O, 1 M HCl und dH2O(h)gereinigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Abbildung 3: Datenerfassungs-GUI für die feste Zieldatenerfassung bei I24. (a) Zeigt die Hauptschnittstelle, die zum Ausrichten von Chips und zum Definieren von Datenerfassungsparametern verwendet wird, (b) ist die Mapping-Lite-Schnittstelle, die zur Definition von Teilbereichen eines Chips für die Datenerfassung verwendet wird, und (c) ist eine Schnittstelle zur Definition von Parametern für die Laserbeleuchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Abbildung 4:Der Prozess der Montage eines Chiphalters auf den Bühnen, wie in Schritt 3, Punkt 1 beschrieben. Bitte klicken Sie <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Abbildung 5: Chipausrichtung. Ein Chip wird durch Klicken auf drei Fiducialmarker auf dem in (a) gezeigten Chip ausgerichtet. Ansichten der Fiduciale 0, 1 und 2 durch das Beamline-On-Axis-Betrachtungssystem sind unter (b), (c) und (d) dargestellt . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Abbildung 6: Die Ergebnisse der automatischen Verarbeitung werden wie in Schritt 6.1 beschrieben gestartet. Ein Aktualisierungs-Trefferratendiagramm wird angezeigt (a, inset). Wenn ein 'Treffer' angeklickt wird, wird das entsprechende Beugungsbild im Dials Image Viewer angezeigt. Die Trefferquote für die aktuelle Datenerhebung wird angezeigt (29,6% in diesem Beispiel). Panel (b) zeigt ein Beispiel für ein Fenster, das die aktuellen Indexierungs- und Integrationsraten für Daten anzeigt, die bisher während des Besuchs gesammelt wurden und in Echtzeit aktualisiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Abbildung 7: Eingehendere Datenanalyse. Die Visualisierung von Elementarzellenparametern kann Polymorphe (a) aufdecken. Durchschnittliche Unit-Cell-Parameter werden berechnet; dies erstreckt sich jedoch noch nicht auf einzelne Durchschnittswerte für Polymorphe. Die Visualisierung einer kleinen Teilmenge von Daten (die gezeigten Daten sind eine Teilmenge von 793 Kupfernitritreduktasekristallen aus den in Ebrahim et al 2019 beschriebenen Daten) reicht oft aus, um Trends aufzudecken. 2D-Diagramme nützlicher Parameter können auch erstellt werden, um Variationen aufzudecken, die aufgrund von Belastungs- oder Dehydratisierungseffekten entstehen, die für bevorstehende Datenerhebungen adressiert werden könnten (b). Stereographische Projektionen können das Vorhandensein oder Fehlen bevorzugter Orientierungen aufdecken, die in das Ladeprotokoll zurückfließen (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir präsentieren einen umfassenden Leitfaden für die Vorbereitung, Datenerfassung und Datenverarbeitung von Festnetzproben für die serielle Synchrotronkristallographie an der Diamond Beamline I24.

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Die serielle Synchrotronkristallographie oder SSX ist ein relativ neues und sich schnell entwickelndes Gebiet der MX.Es eignet sich sehr gut für Experimente mit niedriger Dosis und Raumtemperatur, aber vielleicht am wichtigsten ist, dass es wirklich gut geeignet ist, der Dynamik zu folgen. So können Stop-Motion-Filme von Proteinen in Aktion gedreht werden. Bei I24 stehen mehrere Modi von SSX zur Verfügung.Dieses Protokoll konzentriert sich auf SSX mit festem Ziel, das eine breite Palette von seriellen Experimenten mit begrenzten Probenmengen ermöglicht. Die Silikonchips können beim Laden und Reinigen beschädigt werden, wenn Sie mit ihnen nicht vertraut sind. Außerdem ist das Chip-Alignment-Protokoll für viele Kristallographen völlig neu, und die Datenverarbeitung unterscheidet sich geringfügig von Ihren Standard-Rotationsdaten.Um einen Chiphalter vorzubereiten, schneiden Sie zwei Blätter Polyesterfolie in etwa 6 x 6 Zentimeter große Quadrate und legen Sie die Blätter über die beiden Grundplatten. Befestigen Sie die Bleche mit Metalldichtungsringen an Ort und Stelle und ziehen Sie dann vorsichtig an der überschüssigen Folie, um Falten zu entfernen. Wählen Sie als Nächstes einen Siliziumchip mit entsprechend großen Aperturen relativ zur Größe der zu analysierenden Kristalle aus.Glow entladen den Chip für 25 Sekunden bei 0,39 Millibar, mit einem Strom von 15 Milliampere. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Siliziumchip auf die Chipladestufe zu legen, wobei die erhöhten Stäbe nach unten zeigen. Tragen Sie dann mit einer Pipette 200 Mikroliter der Mikrokristallschlämme auf die flache Seite des Chips auf und verteilen Sie die Aufschlämmung, um alle Stadtblöcke des Chips abzudecken.Wenn der Chip beschädigt ist, bedecken Sie alle Löcher mit einem kleinen Stück Polyesterfolie, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Vakuum angewendet werden kann. Wenden Sie dann ein sanftes Vakuum an, um die gesamte überschüssige Flüssigkeit durch den Chip abzusaugen. Entfernen Sie den Chip aus der Chip-Ladestufe und tupfen Sie die Unterseite des Chips vorsichtig mit Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.Legen Sie den geladenen Chip auf die größere Hälfte des Chiphalters zwischen den Führungsmarken, flach mit der Seite nach unten. Legen Sie die kleine Hälfte des Chiphalters auf den Chip, um ihn zu versiegeln. Die beiden Hälften des Chiphalters sollten einrasten.Befestigen Sie den Chip dann mit Sechskantschrauben sicher an Ort und Stelle. Um den Chip auszurichten, halten Sie den Chiphalter in einem Winkel von 30 Grad, während Sie sich der Halterung nähern. Verwenden Sie dann die kinematischen Halterungen, um den geladenen Chip auf die XYZ-Stufe an der Strahllinie zu legen.Wenn die Magnete Kontakt aufnehmen, lassen Sie den Chiphalter parallel zur Strömung drehen und klicken Sie ein. Sobald der Chip platziert ist, verwenden Sie das Beamline-On-Axis-Betrachtungssystem und die grafische Benutzeroberfläche für die Chipausrichtung, um den oberen linken Fiducial des Chips zu lokalisieren. Um in X, Y und Z auf das Fiducial 0 zu zentrieren, bewegen Sie sich in und aus dem Fokus, um Z auszurichten, nach oben und unten, um Y auszurichten, und nach links und rechts, um X auszurichten.Klicken Sie dann auf Set Fiducial 0"Nachdem Sie Fiducial 1 und 2 auf die gleiche Weise mit dem Röntgenstrahl ausgerichtet haben, klicken Sie auf Koordinatensystem erstellen", um eine Koordinatenmatrix zu generieren.Klicken Sie dann auf "Block Check", um die XYZ-Stufe in die erste Vertiefung jedes Stadtblocks zu verschieben. Wenn das Röntgenkreuz mit den Blenden übereinstimmt, wird der Chip ausgerichtet. In dieser grafischen Darstellung der Spotfindungsergebnisse von DIALS kann ein aktualisierendes Trefferratendiagramm beobachtet werden.Wenn ein Treffer angeklickt wird, wird das entsprechende Beugungsbild im DIALS-Bildbetrachter angezeigt. In dieser Tabelle können aktuelle Indizierungs- und Integrationsraten visualisiert werden, die in Echtzeit aktualisiert werden, wenn die Daten während des Besuchs gesammelt werden. Die Visualisierung der Unit-Cell-Parameter kann Polymorphe aufdecken.Zweidimensionale Diagramme nützlicher Parameter können ebenfalls erstellt werden, um Variationen aufzudecken, die aufgrund von Belastungs- oder Dehydrationseffekten entstehen. Stereographische Projektionen können das Vorhandensein oder Fehlen bevorzugter Orientierungen aufdecken, die in das Ladeprotokoll zurückgeführt werden können. In dieser Projektion können beispielsweise die Auswirkungen der Überlastung eines Chips mit Lysozymkristallen beobachtet werden.Wenn Sie den Chip einlegen, pipettieren Sie langsam und verwenden Sie Ihren Finger, um die Pipette über dem Chip abzustützen. Dies verhindert, dass Sie den Chip berühren und versehentlich Löcher in das Silizium stechen. Nutzen Sie bei der Verarbeitung von Daten die verfügbaren automatisierten Pipelines.Dies gibt Ihnen eine gute Vorstellung davon, wie Ihr Experiment voranschreitet und ob Sie etwas variieren müssen. Diese Methode kann auf jedes Proteinsystem angewendet werden, das in signifikanten Mengen kristallisiert werden kann. Und die Reaktion kann durch leichte Röntgenstrahlen oder schnelles Mischen ausgelöst werden.Dynamische Studien an einer Reihe von Strukturen können Aufschluss darüber geben, wie Proteine funktionieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Digitale Mikrospiegel-Geräte (DMD) generieren können komplexe Muster in Raum und Zeit, mit der neuronalen Erregbarkeit zu steuern. Fragen, die für die Planung, den Bau und Betrieb von DMD Systeme diskutiert. Ein solches System ermöglicht den Nachweis von nicht-linearen Integration in distalen dendritischen Verzweigungen.

Gemusterte Photostimulation mit Digital Micromirror Devices auf Dendritische Integration über Verzweigungspunkte Untersuchen

Drosophila-Larven sind lichtempfindlich und reagieren auf Veränderungen des Umgebungslichts. Dieses Video beschreibt einen Assay, der ihre Fähigkeit testet, Licht zu vermeiden, den sogenannten Lichtfleck-Assay. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie der Assay mit einer Blaulicht-LED eingerichtet wird, und zeigt, wie das Verhalten des Tieres als Reaktion auf die Lichtbegegnung aufgezeichnet wird.

Light Spot Assay: Eine Methode zur Untersuchung des phototaktischen Verhaltens von Drosophila

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten von Drosophila larval zu untersuchen. In diesem Test wird ein Lichtfleck als Lichtstimulation erzeugt, und der Prozess der Larvenlichtvermeidung wird durch ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem aufgezeichnet.

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis

Für die automatisierte Bestrahlung dünner Goldfolien mit hochintensiven Laserpulsen wird ein Protokoll vorgelegt. Das Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung des Mikrobearbeitungszielfertigungsprozesses und eine detaillierte Anleitung, wie Ziele mit einer Geschwindigkeit von 0,2 Hz in den Fokus des Lasers gebracht werden.

Automatisierte Lieferung von mikrofabrizierten Targets für intensive Laserbestrahlungsexperimente

Hier stellen wir ein Protokoll für die kryogene Probenvorbereitung und den Transfer von Kristallen in die Vakuumendstation auf der Beamline I23 an der Diamond Light Source für langwellige makromolekulare Röntgenkristallographie-Experimente vor.

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond.  Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.

Kristallisations- und In-situ-Raumtemperatur-Datenerfassung mit der Kristallisationsanlage in Harwell und der Beamline VMXi, Diamantlichtquelle

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Wir beschreiben Verfahren zur Herstellung und Abgabe von Membranprotein-Mikrokristallen in lipidischer kubischer Phase für die serielle Kristallographie an Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern und Synchrotronquellen. Diese Protokolle können auch für die Einarbeitung und Abgabe von löslichen Proteinmikrokristallen verwendet werden, was zu einem erheblich reduzierten Probenverbrauch im Vergleich zur Flüssiginjektion führt.

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Erfahren Sie die serielle Synchrotron-Kristallographie mit Festziel-Chips an der Diamond Light Source. Diese Methode ermöglicht dynamische Proteinstudien bei Raumtemperatur mit minimalem Probenverbrauch und Echtzeit-Datenvisualisierung.

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

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