Name: Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Leer cryo-EM met enkele deeltjes voor structurele biologie van macromoleculaire complexen. Deze methode helpt onderzoekers structuren te bepalen via monsterbereiding en gridscreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de iNEXT-Discovery (Grant 871037) gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie. J B. R. White wordt gefinancierd door de Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). De FEI Titan Krios microscopen werden gefinancierd door de Universiteit van Leeds (UoL ABSL award) en Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). We bedanken M Iadanza voor het gebruik van zijn micrograafanalysescript. We erkennen Diamond Light Source voor toegang tot en ondersteuning van de cryo-EM-faciliteiten in het nationale Electron Bio-imaging Centre (eBIC) van het Verenigd Koninkrijk, gefinancierd door de Wellcome Trust, MRC en BBRSC.

Er worden geen belangenconflicten gemeld.

In dit protocol hebben we een basispijplijn beschreven die van toepassing is op specimens die vatbaar zijn voor routinematige SPA. Hoewel deze filterpapiervlottmethode van dunne filmvorming en vitrificatie ongetwijfeld succesvol is gezien het gebruik ervan in de overgrote meerderheid van SPA-projecten tot nu toe, heeft het een aantal nadelen. Deze omvatten monsterverspilling, de langzame tijdschalen (seconden) die nodig zijn om de dunne film te vormen en het monster te bevriezen, gerapporteerde onreproduceerbaarheid27 en gerapporteerde negatieve effecten van het gebruik van filterpapier om overtollige vloeistof weg te vegen50. Onlangs zijn nieuwe technologieën ontwikkeld om de reproduceerbaarheid van dunnefilmproductie te verbeteren51,52. Er zijn andere technologieën ontwikkeld die de tijd tussen monstertoepassing en vitrificatie verkorten53,54,55. Hoewel op filterpapier gebaseerde methoden voor dunnefilmvorming op het moment van schrijven de meest alomtegenwoordige methode van SPA cryoEM-monstervoorbereiding blijven, kunnen deze nieuwe technologieën een reeks voordelen opleveren in termen van efficiëntie en reproduceerbaarheid van rasterverglazing, evenals het creëren van nieuwe mogelijkheden om extra experimentele dimensies in te brengen, zoals tijdresolutie en snel mengen voorafgaand aan vitrificatie.
Het proces van rasterscreening voor de meeste gebruikers is momenteel een kwalitatief proces waarbij atlassen met een lage vergroting worden verkregen, gevolgd door het maken van afbeeldingen met een hoge vergroting over het raster om de deeltjesverdeling te beoordelen. Hoewel dit een voldoende robuuste benadering is voor sommige soorten specimens, kan het moeilijk zijn om met het oog te beoordelen of het specimen inderdaad is wat de onderzoeker hoopt in beeld te brengen of een voorkeursoriëntatie heeft, bijvoorbeeld met kleine (<200 kDa) monsters of waar de morfologie met lage resolutie het moeilijk maakt om met het oog te identificeren of er een reeks deeltjesverdelingen aanwezig zijn. Voor sommige projecten is het onmogelijk om te bepalen of het monster naar wens is, bijvoorbeeld waar een ligand is gebonden of waar het monster wordt gescreend om te beoordelen of een kleine (bijv. 10 kDa) subeenheid nog steeds aanwezig is in combinatie met een complex. Voor deze projecten zouden volledig geautomatiseerde pijplijnen voor data-analyse in combinatie met een 'korte' 0,5 - 1-uurs collecties, die door beeldverwerkingsstappen naar 2D-classificatie of zelfs 3D-classificatie en verfijning kunnen gaan, helpen om efficiënt te bepalen of een langere verzameling gerechtvaardigd is. Deze pijpleidingen zijn nog in ontwikkeling en worden momenteel niet op grote schaal geïmplementeerd, maar ze hebben het potentieel om de efficiëntie van cryoEM-rasterscreening te verbeteren, vooral voor uitdagende monsters.
Verbeteringen in directe elektronendetectoren, evenals aanpassingen in microscopie in combinatie met vooruitgang in beeldverwerking zoals het verzamelen van beeldverschuivingsgegevens, hebben de doorvoer en kwaliteit van beelden die tijdens gegevensverzameling worden geproduceerd, verhoogd. Deze toename van de snelheid waarmee gegevens worden verzameld, benadrukt de noodzaak van grondige screening van cryoEM-rasters voordat veel TB aan gegevens worden verzameld.
CryoEM SPA is een echt mainstream structurele biologietechniek geworden, en in veel gevallen de 'go to'-benadering voor sommige klassen van specimens, zoals heterogene en labiele macromoleculaire complexen. Hoewel het protocol hier een basisoverzicht van de SPA-pijplijn beschrijft, is elke sectie die hier wordt behandeld (rasterverglazing en -screening, cryoEM en beeldverwerking) een onderwerp op zich en het waard om te verkennen tijdens de ontwikkeling van een SPA-project. Naarmate de technologieën voor monstervoorbereiding en microscopie vorderen en nieuwe beeldverwerkingsalgoritmen en -benaderingen online komen, zal SPA zich blijven ontwikkelen als een pijplijn, waardoor onderzoekers inzicht krijgen in complexe biologische systemen.

CryoEM met één deeltje Om het leven op moleculair niveau te onderzoeken, moeten we structuur begrijpen. Er zijn veel technieken beschikbaar om de eiwitstructuur te onderzoeken, zoals NMR, röntgenkristallografie, massaspectrometrie en elektronenmicroscopie (EM). Tot op heden zijn de meeste structuren die zijn gedeponeerd bij de Protein Databank (PDB) opgelost met behulp van röntgenkristallografie. Vanaf ~ 2012 werd cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) echter een reguliere techniek voor het bepalen van de eiwitstructuur en nam het gebruik ervan dramatisch toe. Het totaal aantal EM-kaarten gedeponeerd bij de Electron Microscopy Databank (EMDB) (per dec 2020) was 13.421 vergeleken met 1.566 in 2012 (figuur 1, www.ebi.co.uk). In 2012 was het aantal atoomcoördinaten gemodelleerd in cryoEM-dichtheidskaarten, gedeponeerd bij de PDB, slechts 67, maar vanaf december 2020 zijn er tot nu toe 2.309 structuren afgezet, een 35-voudige toename. Deze onderliggende groei in de kwaliteit en kwantiteit van geproduceerde cryoEM-dichtheidskaarten, ook wel de 'resolutierevolutie' genoemd 1, werd veroorzaakt door een samensmelting van vooruitgang op meerdere gebieden: de ontwikkeling van nieuwe camera's voor beeldvorming die bekend staan als directe elektronendetectoren; nieuwe software; en stabielere microscopen2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> Figuur 1: Cumulatieve indieningen bij het EMDB van 2012 tot december 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Single particle analysis (SPA) is een krachtig hulpmiddel om biologisch inzicht te genereren in een breed scala aan monstertypen door hoge resolutie structuren van geïsoleerde complexen op te helderen5,6 inclusief virussen7,8, membraaneiwitten9,10, spiraalvormige assemblages11 en andere dynamische en heterogene macromoleculaire complexen12,13, waarvan de grootte varieert in ordes van grootte (vanaf 39 kDa 14,15 tot tientallen megadalton). Hier wordt een protocol beschreven voor een standaard pijplijn voor cryoEM SPA van monster tot structuur.
Voordat aan deze pijpleiding wordt begonnen, moet een gezuiverd monster worden onderworpen aan biochemische analyse om de kansen op succes stroomafwaarts te beoordelen. De voorbereiding van een geschikt monster is misschien wel de grootste barrière voor SPA, met name voor voorbijgaande en heterogene (zowel compositorische als conformationele) complexen. Het macromoleculaire complexpreparaat moet zo min mogelijk verontreinigingen bevatten, in voldoende concentratie om veel deeltjes op te leveren in elke cryoEM-micrograaf en in een buffersamenstelling die zeer geschikt is voor cryoEM-analyse. Bepaalde bufferbestanddelen, waaronder sucrose, glycerol en hoge (~ > 350 mM concentraties zouten, afhankelijk van de steekproefgrootte, eigenschappen en andere bufferbestanddelen) kunnen het proces van vitrificatie verstoren of de signaal-ruisverhouding in afbeeldingen verminderen, waardoor de structuurbepaling wordt belemmerd16.
Doorgaans moeten minimaal grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en SDS-PAGE-gelanalyse worden gebruikt om de zuiverheid van het monster te beoordelen17,18, maar circulair dichroïsme, functionele assays, SEC in combinatie met multi-angle lichtverstrooiing en thermische stabiliteitstests zijn allemaal nuttige hulpmiddelen voor kwalitatieve analyse van macromoleculaire complexe preparaten voorafgaand aan cryoEM-analyse. De resultaten van deze biochemische analyses kunnen echter weinig inzicht geven in de structurele heterogeniteit van het monster en het gedrag ervan op een cryoEM-raster. Om deze reden wordt negatieve kleur EM routinematig gebruikt als een snel, goedkoop en krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van compositorische en conformatie heterogeneiteit, en daarom een goede manier om vast te stellen welke elutiedractie van een zuivering het meest veelbelovend is, of om verschillende buffersamenstellingen te screenen19,20. Zodra een veelbelovend monster is geïdentificeerd, kunnen we doorgaan naar de SPA cryoEM-pijplijn. Negatieve vlek komt niet altijd overeen met de daaropvolgende resultaten in cryoEM; soms ziet een monster er slecht uit door negatieve vlekken, maar verbetert het wanneer het wordt gezien in glasachtig ijs in cryoEM. Daarentegen zien monsters er soms uitstekend uit tijdens negatieve vlekstappen, maar vereisen ze aanzienlijke verdere optimalisatie bij het overgaan naar cryoEM. In de meeste gevallen biedt negatieve vlek echter een nuttige kwaliteitscontrolestap.
Vitrificatie De ruwe omgeving in het vacuümsysteem van de elektronenmicroscoop veroorzaakt zowel uitdroging als stralingsschade aan niet-gefixeerde biologische monsters21. Daarom moet het biologische exemplaar vóór beeldvorming worden bewaard om het monster in een inheemse toestand in beeld te brengen. Voor gezuiverde preparaten van macromoleculaire complexen is vitrificatie de voorkeursmethode om de visualisatie ervan door cryoEM mogelijk te maken met behoud van de atomaire details van het complex. De ontdekking van vitrificatie als een methode voor monstervoorbereiding was een fundamentele vooruitgang in elektronenmicroscopie van biologische specimens, waarvoor Dubochet werd erkend in de Nobelprijs voor de Scheikunde in 2017. Monsterverglazing omvat het creëren van een dunne laag oplossing met het monster van belang, meestal tientallen nm dik, gesuspendeerd op een cryoEM-rasterondersteuning. De dunne film wordt vervolgens extreem snel ingevroren in een cryogeen zoals vloeibaar ethaan bij ~-175 °C. De vriessnelheid is ~106 °C/s, snel genoeg dat amorf of glasachtig ijs ontstaat, waarbij het monster in een dunne, vaste film wordt gesuspendeerd22.
De eerste variabele waarmee rekening moet worden gehouden, is de gekozen cryoEM-rasterondersteuning23. Een EM-raster bestaat meestal uit een amorfe koolstoffilm met perforaties (regelmatig of onregelmatig), over een draagstructuur. De draagstructuur is meestal een cirkelvormig metalen rooster met een diameter van 3,05 mm, meestal gemaakt van koper, maar andere metalen zoals goud of molybdeen (dat de voorkeur heeft aan thermische uitzettingseigenschappen24) kunnen worden gebruikt. Soms wordt een extra dunne, continue ondersteuning over het raster aangebracht, zoals grafeen, grafeenoxide of een dunne (~ 1-2 nm) amorfe koolstoflaag. Terwijl standaard cryoEM-roosters (meestal 400-200 mesh koper met een geperforeerde (1,2 μm ronde gaten gescheiden door 1,3 μm (r1.2 /1.3), of 2 μm gescheiden door 2 μm koolstof (r2 / 2)) koolstofondersteuning - hoewel er veel verschillende patronen beschikbaar zijn) zijn gebruikt in de overgrote meerderheid van de structuren die tot nu toe zijn gerapporteerd, zijn nieuwe rastertechnologieën met verbeterde geleidbaarheid en verminderde monsterbeweging gemeld25 . Geselecteerde roosters worden onderworpen aan een gloeiende ontladings-/plasmareinigingsbehandeling om ze hydrofiel en vatbaar voor monstertoepassing te maken26.
Na gloed-ontlading is de volgende fase dunne filmvorming. Deze dunne film wordt meestal gevormd met behulp van filterpapier om overtollige vloeistof van het rooster te verwijderen. Hoewel dit handmatig kan worden uitgevoerd, zijn er een aantal apparaten voor het invriezen in de handel verkrijgbaar, waaronder de Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) en CP3 (Gatan). Met deze apparaten wordt ~ 3-5 μL monster in oplossing op het EM-rooster aangebracht, gevolgd door het wegvegen van overtollige oplossing met behulp van filterpapier. Het rooster, met een dunne film eroverheen, wordt vervolgens ondergedompeld in vloeibaar ethaan gekoeld door vloeibare stikstof (LN2) tot ~ -175 °C. Eenmaal bevroren, wordt het rooster op een temperatuur onder het devitrificatiepunt (-137 °C) gehouden voorafgaand aan en tijdens de beeldvorming.
Monsterscreening en gegevensverzameling Na vitrificatie van een cryoEM-raster is de volgende fase het screenen van het raster om de kwaliteit ervan te beoordelen en om te bepalen of het raster geschikt is om over te gaan tot gegevensverzameling met hoge resolutie. Een ideaal cryoEM-raster heeft glasachtig ijs (in tegenstelling tot kristallijn ijs) met de ijsdikte net voldoende om de langste afmeting van het monster te accommoderen, zodat het omringende ijs zo min mogelijk ruis bijdraagt aan het resulterende beeld. De deeltjes in het ijs moeten een grootte en (indien bekend) vorm hebben die consistent is met de biochemie, en idealiter monodisperse zijn met een willekeurige verdeling van deeltjesoriëntaties. Ten slotte moet het raster voldoende gebieden van voldoende kwaliteit hebben om aan de gewenste lengte van de gegevensverzameling te voldoen. Afhankelijk van het monster kan dit vele iteraties van vitrificatie en screening vergen totdat optimale rasters zijn geproduceerd. Zowel gelukkig als helaas zijn er een enorm scala aan variabelen die empirisch kunnen worden getest om de deeltjesverdeling op cryoEM-rasters te veranderen (besproken in16,27). In dit manuscript worden representatieve resultaten voor een membraaneiwitproject10 getoond.
Zodra een geschikt raster is geïdentificeerd, kan de gegevensverzameling doorgaan. Verschillende modellen van cryotransmissie-elektronenmicroscopen voor biologische monsters zijn geoptimaliseerd om gegevens met een hoge resolutie op een geautomatiseerde manier te verzamelen. Doorgaans worden gegevens verzameld op 300 kV- of 200 kV-systemen. Geautomatiseerde gegevensverzameling kan worden bereikt met behulp van software zoals EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 en SerialEM31,32. Een geautomatiseerde gegevensverzameling met moderne detectoren resulteert meestal in terabytes (TB) aan onbewerkte gegevens in een periode van 24 uur (gemiddelde datasets zijn ~ 4 TB groot).
Vanwege de COVID-19-beperkingen die op een groot deel van de wereld van kracht zijn (op het moment van schrijven december 2020), zijn veel microscopiefaciliteiten overgestapt op het aanbieden van toegang op afstand. Zodra de roosters in de autoloader van een microscoop zijn geladen, kan gegevensverzameling op afstand worden uitgevoerd.
Beeldverwerking en modelbouw Wanneer een gegevensverzamelingssessie doorgaans 0,5-4 dagen kan duren, kan de daaropvolgende beeldverwerking vele weken en maanden duren, afhankelijk van de beschikbaarheid van computerbronnen. Het is standaard voor initiële beeldverwerkingsstappen, namelijk bewegingscorrectie en contrastoverdrachtsfunctie (CTF) schatting om 'on the fly' plaats te vinden 33,34. Voor downstream-verwerking zijn er een overvloed aan softwaresuites beschikbaar. Deeltjes worden 'geplukt' en geëxtraheerd uit micrografieën35,36. Zodra deeltjes zijn geëxtraheerd, zou een standaardprotocol zijn om de deeltjes te verwerken door middel van verschillende classificatierondes (in zowel twee dimensies (2D) als drie dimensies (3D) en / of gericht op specifieke interessegebieden) om een homogene deelverzameling van deeltjes te bereiken. Deze homogene deelverzameling van deeltjes wordt vervolgens samen gemiddeld om een 3D-reconstructie te produceren. Op dit punt worden gegevens vaak verder gecorrigeerd om de hoogst mogelijke kwaliteit kaart te produceren, bijvoorbeeld door CTF-verfijning, vervormingscorrecties37 en Bayesiaanse polijsting38 . Het resultaat van deze beeldverwerking is een 3D cryoEM-kaart van het biologische specimen van belang. Het resolutiebereik dat wordt bereikt in een 'standaard' geautomatiseerd enkel deeltjesexperiment van een raster van voldoende kwaliteit, met gegevens verzameld op een 300 kV microscoopsysteem, ligt meestal tussen 10 Å en 2 Å, afhankelijk van de grootte en flexibiliteit van het eiwitcomplex. Met een ideaal exemplaar zijn nu resoluties van ~1,2 Å bereikt met behulp van SPA-workflows5. Hoewel dit protocol stappen beschrijft in de richting van het verkrijgen van een EM-dichtheidskaart, kan dit, zodra dit in de hand is, verder worden geïnterpreteerd door het aanbrengen en verfijnen van een eiwitmodel (als de resolutie < 3,5 Å is) of het bouwen van de novo39. Gegevens in verband met structuurbepalingsexperimenten kunnen worden gedeponeerd in online openbare opslagplaatsen, waaronder EM-dichtheidskaarten (Electron Microscopy Data Bank)40, resulterende atoomcoördinaten (Protein Data Bank)41 en ruwe datasets (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
In dit protocol wordt het buitenmembraaneiwitcomplex RagAB (~340 kDa) uit Porphyromonas gingivalis gebruikt als voorbeeld macromoleculair complex10 (EMPIAR-10543). Voor degenen die nieuw zijn bij cryoEM, is ondersteuning voor monsters via deze pijplijn van monster tot structuur beschikbaar, onder voorbehoud van peer review, via gefinancierde toegangsregelingen zoals iNEXT Discovery en Instruct.

<table><tbody><tr><td>Blunt tweezers</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5022</td><td></td></tr><tr><td>Cryo EM round storage box</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3736</td><td></td></tr><tr><td>CryoEM autogrid boxes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1084591</td><td></td></tr><tr><td>CryoEM grids</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethane gas</td><td>Boc</td><td>270595-F</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; foam dewar</td><td>Agar Scientific</td><td>AG81760-500</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; storage dewar</td><td>Worthington industries</td><td>HC 34</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td>10082012</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Star labs</td><td>s1111-1706</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>BD 300869</td><td></td></tr><tr><td>Type II lab water</td><td>Suez</td><td>select fusion</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot styrophome container assembly</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot tweezers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72882-D</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2.8.1.10REL</td><td></td></tr><tr><td>TEM server</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6.15.3.22415REL</td><td></td></tr><tr><td>Tia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5.0.0.2896REL</td><td></td></tr><tr><td>Titan krios microscope</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Titan Krios G2</td><td></td></tr></tbody></table>

cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) is een krachtige techniek voor structuurbepaling van macromoleculaire complexen, via single particle analysis (SPA). Het totale proces omvat i) het verglaasen van het monster in een dunne film die wordt ondersteund op een cryoEM-raster; ii) het monster te screenen om de deeltjesverdeling en de ijskwaliteit te beoordelen; iii) indien het raster geschikt is, het verzamelen van een enkele deeltjesdataset voor analyse; en iv) beeldverwerking om een EM-dichtheidskaart te verkrijgen. In dit protocol wordt een overzicht gegeven voor elk van deze stappen, met een focus op de variabelen die een gebruiker tijdens de workflow kan wijzigen en het oplossen van veelvoorkomende problemen. Nu microscoopbediening op afstand standaard wordt in veel faciliteiten, zullen variaties op beeldvormingsprotocollen worden beschreven om gebruikers te helpen bij een efficiënte werking en beeldvorming wanneer de fysieke toegang tot de microscoop beperkt is.

Bij het screenen kunnen rasters worden weggegooid in het atlasstadium, waar functies die bij lage vergroting zijn opgelost, het raster markeren als niet geschikt voor gegevensverzameling. Bijvoorbeeld als een raster aanzienlijke mechanische schade heeft opgelopen waarbij de meeste rastervierkanten zijn gebroken (figuur 2A), of als het raster 'droog' lijkt te zijn, zonder glasachtig ijs (figuur 2B). Dergelijke rasters zijn meestal identificeerbaar omdat de randen van de rastervierkanten scherp en duidelijk lijken. Over de meeste roosters die zijn gemaakt met behulp van het plunge freezing-apparaat, wordt een gradiënt van ijs waargenomen (figuur 2C, D). Deeltjesverdeling, afhankelijk van het specimen van belang, kan dramatisch variëren met de ijsdikte en daarom wordt het screenen van een reeks rastervierkanten om de deeltjesverdeling te beoordelen aanbevolen. Tijdens de atlasscreeningstap zijn hulpmiddelen geïmplementeerd in EPU-software om de gebruiker te helpen rastervierkanten van vergelijkbare of verschillende ijsdikte te identificeren, wat vooral handig kan zijn voor gebruikers die nieuw zijn in het onderzoeken van cryoEM-rasters (figuur 2E, F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbeeld lage vergroting 'atlas' montages uit screening sessies. A) Een raster dat aanzienlijke schade heeft opgelopen met de meerderheid van de rastervierkanten gebroken - ongeschikt voor verzameling. B) Een droog rooster zonder glasachtig ijs - ongeschikt voor verzameling. C) Een raster dat een ijsgradiënt aangeeft met ~ 50% van het raster bruikbaar. D) Een ijsgradiënt met ~ 33% van het raster bruikbaar. Zowel C als D zijn geschikt voor gegevensverzameling als de bruikbare rastervierkanten een ijsdikte hebben die geschikt is voor verzameling, en er voldoende acquisitiegebieden zijn om te voldoen aan de minimale duur van een verzameling (bijv. 24 uur) E) Een voorbeeldatlas met bereik van ijsdiktes. F) Dezelfde atlas gepresenteerd in E, maar met rastervierkanten gecategoriseerd en gekleurd door EPU-software op basis van ijsdikte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Zorg er bij het screenen van deeltjesverdeling voor dat beeldvormingsparameters, zoals vergroting en totale elektronendosis, vergelijkbaar zijn met die welke naar verwachting zullen worden gebruikt tijdens gegevensverzameling om een nauwkeurig beeld te geven van de verwachte resultaten. Tijdens de screening is een ideale deeltjesverdeling monodisperse met een reeks deeltjesoriëntaties zichtbaar (afhankelijk van het monster en de bestaande kennis van de morfologie van het deeltje kan dit een uitdaging zijn om vast te stellen) (figuur 3A). Het ijs moet zo dun mogelijk zijn terwijl het de grootste dimensie van de deeltjes herbergt, als het ijs te dun is, kan het smelten wanneer het wordt verlicht met de elektronenbundel. Dit veroorzaakt overmatige beweging in de micrograaf en gebieden die deze eigenschap vertonen, moeten worden vermeden (figuur 3B). Uit collectieve ervaring wordt dit effect het meest waargenomen wanneer er wasmiddel in de buffer zit. Dit kan resulteren in zeer dun ijs in het midden van het gat en dus kunnen deeltjes fysiek worden uitgesloten en naar de rand worden geduwd. Dit effect wordt waargenomen in figuur 3C, maar in dit geval is het geen extreem voorbeeld en zouden deze afbeeldingen nog steeds nuttig bijdragen aan een dataset. Ten slotte moet het ijs glasachtig zijn; gebieden van het raster (of rasters) waar de meerderheid of alle gemaakte beelden kristallijn ijs tonen (figuur 3D) uitsluiten van gegevensverzameling. Vaak wordt niet-glasachtig ijs waargenomen aan de rand van rastervierkanten. Lezers worden verwezen naar gedetailleerde beoordelingen van de variabelen die kunnen worden gewijzigd tijdens rasterverglazing16 en beschrijvingen van deeltjesgedrag in de dunnefilmomgeving46,47 voor meer informatie.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve micrografieën die verschillende deeltjesverdelingen laten zien. A) Een 'ideale' verdeling van monodisperse deeltjes die een reeks oriëntaties aannemen. B) Te dun ijs in het midden van het gat dat het vervormt bij blootstelling aan de elektronenbundel waardoor overmatige beweging in de micrograaf ontstaat. Dit effect wordt meestal waargenomen wanneer wasmiddel aanwezig is in de buffer C) Waar ijs dunner is in het midden van het gat, sluit dit fysiek deeltjes uit het midden uit, waardoor deeltjes naar de rand van het gat worden verdrongen. In dit geval is het niet extreem genoeg om te voorkomen dat deze afbeeldingen nuttig zijn, maar het suggereert dat het de moeite waard is om iets dikkere gebieden te screenen. D) IJs is geen glasachtig, er mogen geen gegevens worden verzameld over gebieden die op deze voorbeeldmicrograaf lijken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
On-the-fly beeldverwerking kan helpen om fouten en problemen met gegevensverzameling op te sporen en wordt daarom altijd aanbevolen waar mogelijk. Overmatige beweging binnen micrografieën kan er bijvoorbeeld op wijzen dat de autoloader turbopomp actief is, of dat gegevens worden verzameld op een gebarsten rastervierkant waar ijs aanzienlijk beweegt in de elektronenbundel, wat aangeeft dat het rastervierkant moet worden overgeslagen. On the fly kan CTF-schatting omstandigheden onthullen waarin een positief focuspunt (in plaats van onscherpte) wordt toegepast (waar CTF-schattingsprogramma's en parameters om deze punten te vinden worden gebruikt) en de faseverschuiving bepalen waar een Volta-faseplaat48 wordt gebruikt. On-the-fly beeldverwerkingspijplijnen bevatten vaak een grafische samenvatting van de gegevens (figuur 4A) om het voor gebruikers gemakkelijker te maken om de kwaliteit van micrografieën snel te beoordelen en te beslissen of wijzigingen in de gegevensverzameling nodig zijn.
Selectie van deeltjes uit micrografieën, terwijl 'valse positieven' zoals verontreiniging of de rasterondersteuningsfilm worden vermeden, kan optimalisatie vereisen. Deeltjeskiezers zoals crYOLO werken echter vaak voldoende goed met behulp van standaardparameters voor een 'first pass' van de gegevens (figuur 4B), waardoor progressie naar 2D-klassegemiddelde mogelijk is, waar het gemakkelijker kan zijn om de kwaliteit van de gegevens en de waarschijnlijkheid van downstream-succes te beoordelen. Voor de meeste projecten zou de 2D-classificatie van ~ > 10k-deeltjes klassen moeten onthullen die secundaire structuurdetails hebben. Om over te gaan tot 3D, moet de 2D-classificatiefase meestal klassen onthullen die een reeks deeltjesoriëntaties vertegenwoordigen. Als een voorkeursoriëntatie wordt onthuld, kunnen meer iteraties van monstervoorbereiding16 of verdere gegevensverzameling met het monster gekanteld nodig zijn49. Alle klassen die secundaire structuurdetails vertonen, moeten worden gekozen om door te gaan naar 3D-analyse, terwijl 'rommel'-deeltjes worden weggegooid (figuur 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> Figuur 4: Eerste beeldverwerkingsstappen. A) Uitvoer van een 'on the fly' beeldverwerkingsscript. B) Voorbeeld micrograaf (links) met correct automatisch geplukte deeltjes geïdentificeerd met behulp van het crYOLO algemene model (rechts, met deeltjes begrensd door rode vierkanten) Schaalbalken (wit) zijn 50 nm. C) Resultaten van 2D-classificatie met klassen die in het rode vierkant zijn weggegooid en klassen waaruit deeltjes zijn geselecteerd voor verdere verwerking in groen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Een kleine subset van deeltjes kan worden gebruikt om een initieel model te genereren (figuur 5A). Dit eerste model kan vervolgens worden gebruikt als startmodel in 3D-classificatie en verfijning. In het geval van RagAB bevatte de dataset drie verschillende conformers die tijdens 3D-classificatie kunnen worden gescheiden (figuur 5B). Deeltjes die bijdragen aan elk van deze klassen kunnen vervolgens onafhankelijk worden behandeld en worden gebruikt om een EM-dichtheidskaart te verfijnen die vervolgens kan worden onderworpen aan verdere interpretatie en modelbouw.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> Figuur 5: Het genereren van 3D EM dichtheidskaart. A) Typisch initieel model gegenereerd met RELION. B) 3D-classificatie over 5 klassen die de scheiding van deeltjes in drie verschillende conformatietoestanden laten zien: open-open (groen), open-gesloten (blauw), gesloten-gesloten (paars). C) Proces van het maken van maskers. De kaart van 3D-verfijning (links) moet worden gevisualiseerd in chimaera. De volumeviewer kan vervolgens worden gebruikt om de laagste drempel te identificeren waarbij de kaart vrij is van onsamenhangende, luidruchtige dichtheid (midden). Deze drempelwaarde wordt ingevoerd als initiële binarisatiedrempel in de relion-maskercreatietaak. Een voorbeeldmaskeruitvoer wordt grijs weergegeven (rechts). D) Hoge resolutie EM-dichtheidskaart van de open-gesloten toestand van RagAB (EMD-10245), gefilterd en gekleurd door lokale resolutie (Å). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Cryo-EM-analyse met één deeltje is een routinetechniek geworden in de gereedschapskist van de structuurbioloog die van toepassing is op een breed scala aan monsters, waaronder membraaneiwitten, amyloïde fibrillen, nucleïnezuurbindende eiwitten en virussen. Zodra de monstervoorbereiding is voltooid en de rasters in de microscoop zijn geladen, kan de gegevensverzameling op afstand worden uitgevoerd in veel cryo-EM-faciliteiten zoals het Astbury Biostructure Laboratory en eBIC. Belangrijke belemmeringen voor een succesvolle structuurbepaling liggen vaak in de monstervoorbereidings- en rasterscreeningfasen met meerdere iteraties die soms nodig zijn door dit proces.Hier zullen we rasterscreening op afstand en gegevensverzameling met één deeltje demonstreren. In het tabblad auto-loader van de gebruikersinterface van de microscoop, tikt u het optiedialoogvenster uit met behulp van de pijl en drukt u op de inventarisknop. Hiermee wordt achtereenvolgens elke positie in de cassette gecontroleerd om te bepalen of er een cartridge aanwezig is.De inventaris wordt achtereenvolgens op elke sleuf uitgevoerd. Wanneer alle bezette slots in kaart zijn gebracht, stopt de inventaris. Markeer het raster dat naar de microscoopkolom moet worden overgebracht en klik op laden.Het slotlabel verandert van blauw naar geel zodra het raster met succes op het podium is geladen. Als u de rasters wilt screenen, opent u de EPU-software. Selecteer op de voorbereidingspagina acquisitieoptiek en -instellingen en selecteer vervolgens de atlasvoorinstelling in het vervolgkeuzemenu.Kies de juiste voorinstellingen voor het instellen van de bundel en druk op set om de parameters naar de microscoop te duwen. Druk hierop om kolomkleppen te openen en plaats het griepscherm. Controleer of een straal zichtbaar en voldoende verspreid en gecentreerd is om de detector te bedekken.Navigeer indien nodig naar een dunner gebied van het raster met behulp van de joystick of virtuele handpanelen om podiumbewegingen in X en Y te regelen.Til het griepscherm op en maak een afbeelding met behulp van de voorbeeldknop in EPU. Ga in EPU naar de atlaspagina en druk op nieuwe sessie. Selecteer de MRC-afbeeldingsindeling en voer een geschikte mapnaam en locatie in voor het opslaan van de screeningsessie en klik vervolgens op Toepassen.Selecteer screening in het menu aan de linkerkant. Vink de selectievakjes naast elk raster aan om een atlasmontage te verkrijgen en start vervolgens de screeningsessie in EPU. Voor elk gecontroleerd raster wordt een atlas verkregen en de beschikbare rastervierkanten worden na voltooiing vermeld.Elke atlas kan worden bekeken door deze te markeren op de screeningspagina. Als u klaar bent, bekijkt u de verzamelde atlassen en identificeert u de rasters die geschikt zijn voor het beoordelen van de monsterkwaliteit bij hogere vergrotingen. Markeer het gekozen raster in het EPU-screeningsmenu en klik op voorbeeld laden.Selecteer in het atlasscreeningmenu het raster dat momenteel is geladen en verplaats het werkgebied naar een rastervierkant met de opgevulde gaten door met de rechtermuisknop op de gewenste locatie op de rasterafbeelding te klikken en hier het werkgebied verplaatsen te selecteren. Ga terug naar de EPU-voorbereidingspagina en selecteer de rastervakvoorinstelling. Open de pagina met automatische functies van de EPU en voer auto-eucentrisch uit door fasekanteling met de rastervierkantvoorinstelling om het monster naar eucentrische hoogte te verplaatsen.Maak in de EPU-voorbereiding een nieuwe raster vierkante voorbeeldafbeelding. Let op de grijswaarden over verschillende gaten die verschillende ijsdiktes aangeven. Verplaats het werkgebied over een gat met de rechtermuisknop en verplaats het werkgebied hierheen.Selecteer de vooraf ingestelde opening of eucentrische hoogte en klik vervolgens op Voorbeeld. Selecteer de voorinstelling voor gegevensverzameling en stel een vergroting in waarmee de deeltjes eenvoudig kunnen worden geïdentificeerd. Stel de onscherpteverschuiving in op negatief drie tot vijf micrometer.Herhaal stappen om een reeks ijsdiktes opnieuw te beoordelen voor deeltjesverdeling, oriëntatie en verontreiniging over het raster. Afhankelijk van de beschikbaarheid van de microscoop, gaat u rechtstreeks door naar de gegevensverzameling of kunnen rasters uit de microscoop worden verwijderd voor toekomstige verzameling, ook op andere locaties. Verzamel een atlas als er geen beschikbaar is voor screening door atlasinstellingen in te stellen en raster te selecteren om atlas te verkrijgen.Verkrijg atlas en klik op rasterlocatie om de uitvoer te zien. Zodra de atlas is voltooid, definieert u elk van de voorinstellingen voor bundelinstellingen op basis van de experimentele behoeften van het project. Voer kalibraties voor beeldverschuivingen uit.Stel de EPU-sessie in door de sessie-instelling van de EPU-pagina te selecteren en vervolgens een nieuwe sessie of een nieuwe te selecteren in de voorkeuren. Na het selecteren van een nieuwe sessie verschijnt er een pop-up met een optie om eerdere instellingen te gebruiken. De instellingen worden automatisch geladen van de vorige naar de huidige EPU-sessie.U kunt ook nieuw selecteren in voorkeuren en een bestand met opgeslagen voorkeuren kiezen om deze informatie vooraf in de huidige EPU te laden. Vul de naam van de sessie in met iets informatiefs. Selecteer in tekst handmatig.Selecteer voor de acquisitiemodus nauwkeurige gatcentrering of snellere acquisitie als aberratievrije beeldverschuivingsverzameling beschikbaar en gewenst is. Selecteer het gewenste afbeeldingsformaat en selecteer vervolgens de opslagmap en EPU maakt een map met de sessienaam. Selecteer het juiste raster op basis van de afstand tussen de rastergaten en druk op toepassen.Selecteer een eerste rastervierkant en stel een acquisitiesjabloon in. Ga naar vierkante selectie. Als alle vierkanten groen zijn, klikt u linksboven op Alles opheffen.Open tegels door met de rechtermuisknop te klikken en vervolgens tegel openen te selecteren. Voeg een rastervierkant toe of kies dit door op selecteren te klikken, vervolgens met de rechtermuisknop te klikken en werkgebied naar rastervierkant te verplaatsen. Ga naar hole selection en druk op auto-eucentric.Wacht totdat een vierkante rasterafbeelding is gemaakt. Als de automatische functie uitvalt, kan dit zijn omdat de hoogte aanzienlijk is uitgeschakeld. Het kan handmatig worden aangepast met behulp van het griepscherm bij raster vierkante vergroting.Om de grootte van het gat te meten, verplaatst en past u de gele cirkels aan zodat ze over de gaten met de juiste grootte en afstand zijn. Druk op zoek gaten. Controleer of de gaten correct zijn gevonden.Zo niet, verander dan de grootte van het gat en druk opnieuw op zoekgaten. Als dit proces consequent mislukt, overweeg dan om over te gaan naar een lager getal of een helderdere vlekgrootte bij rastervierkantvergroting. Gebruik het histogram van filterijskwaliteit aan de rechterkant om de selectie van gaten aan te passen.Dit kan handig zijn om gebieden met dik ijs en dun ijs uit te sluiten. Dit zal worden onthouden voor toekomstige rastervierkanten die tijdens de sessie worden geselecteerd. Optimaliseer de gatselectie met de gereedschappen in het selectiemenu bovenaan.Klik bijvoorbeeld op gaten dicht bij de rasterbalk verwijderen. Ga naar sjabloondefinitie en druk op acquire. Klik op zoeken en centreer het gat.Wijzig de vertraging na faseverschuiving en vertraging na beeldverschuivingstijden in één tot vijf seconden, controleer vervolgens of de maximale beeldverschuivingswaarde naar wens is. Klik op acquisitiegebied toevoegen en klik ergens op de afbeelding. Verplaats het acquisitiegebied naar de gewenste locatie.Voeg het onscherpbereik rechtsboven toe. Een typische onscherptelijst voor een membraaneiwitproject is negatief 0,8 tot negatief drie micrometer onscherpte, voeg vervolgens andere acquisitiegebieden toe en rangschik ze zo dat acquisitiegebieden niet dubbel worden blootgesteld met de bundel. Klik op autofocusgebied toevoegen en klik ergens op de afbeelding.Verplaats het autofocusgebied naar de koolstof rond een gat. Standaardpraktijk is om automatisch scherp te stellen na centreren bij gebruik van AFIS of om de vijf tot 15 micrometer, afhankelijk van de Z-hoogtevariatie over het vierkant. Klik op Driftmeetgebied toevoegen.Driftmeting eenmaal per rastervierkant uitgevoerd met een ingestelde drempel van 0,05 nanometer per seconde als standaardinstelling. Het driftmeetgebied kan direct overlappen met het autofocusgebied. Zorg ervoor dat drift- of autofocusgebied niet overlappen met een acquisitiegebied.Ga terug naar vierkante selectie en selecteer de vierkanten voor acquisitie op het raster. Gebruik het aantal acquisitiegebieden en de verwachte data-acquisitiesnelheid om te voorspellen hoeveel acquisitiegebieden nodig zijn. Wanneer alle gewenste vierkanten zijn geselecteerd, drukt u op alle vierkanten voorbereiden.Zodra elk vierkant is verzameld, navigeert u tussen de rastervierkanten en stemt u de gaten af met het selectiepenseel. Ga naar een podiumlocatie boven het monster en gebruik automatische functies om de eucentrische hoogte in te stellen. Voer microscoopuitlijningen uit met behulp van microscoopsoftware zoals eerder beschreven en in de tekst.Voer coma-vrije uitlijning uit binnen de automatische functies voordat u het objectiefopening opnieuw plaatst en centreert en het astigmatisme van de objectieflens corrigeert met EPU. Zorg ervoor dat beide uitlijningen convergeren naar geschikte waarden. Voordat u de geautomatiseerde acquisitierun start, moet u ervoor zorgen dat de turbopomp met automatische lader is uitgeschakeld en dat de objectiefopening indien nodig is geplaatst.Bij geautomatiseerde acquisitie, druk start run om te beginnen met geautomatiseerde data-acquisitie. Met behulp van dit protocol kunnen gebroken of droge roosters worden gescreend en weggegooid in de atlasfase. Een gradiënt van ijs wordt waargenomen over de meeste rasters.Tijdens het screenen wordt een ideale deeltjesverdeling monodispersed met een reeks deeltjesoriëntaties zichtbaar. Als ijs te dun is, kan het smelten wanneer het wordt verlicht met de elektronenbundel, waardoor overmatige beweging in micrografie ontstaat. Dit wordt meestal waargenomen wanneer er wasmiddel in de buffer zit.Het ijs moet glasachtig zijn, dus delen van het raster waar de meerderheid van de beelden kristallijn ijs laat zien, werden uitgesloten. Grafische samenvatting van de gegevens werd opgenomen om de kwaliteit van micrografen te beoordelen en om te beslissen of wijzigingen in de gegevensverzameling nodig zijn. Deeltjeskiezers zoals crYOLO werken voldoende goed voor een eerste doorgang van de gegevens, waardoor progressie naar 2D-klassegemiddelden mogelijk is.Klassen die secundaire structuurdetails tonen, moeten worden gekozen voor 3D-analyse, terwijl rommeldeeltjes moeten worden weggegooid. Een subset van deeltjes kan worden gebruikt om een eerste model voor 3D-classificatie en verfijning te genereren. In het geval van RagAB bevatte de dataset drie verschillende conformers die tijdens 3D-classificatie kunnen worden gescheiden.Het is belangrijk om te onthouden dat succes bij de gegevensverzameling en de daaropvolgende beeldanalysestappen afhankelijk is van het verkrijgen en identificeren van goed geoptimaliseerde rasters tijdens de screeningsfase. Zodra een 3D EM-dichtheidskaart is verkregen, kan deze verder worden geïnterpreteerd door een eiwitmodel aan te passen en te verfijnen of een atoommodel de novo te bouwen. Cryo-EM single-particle analyse maakt gestructureerde bepaling van vele doelen mogelijk die voorheen niet mogelijk waren.Met name zijn deze workflows onlangs gebruikt om structuren van COVID-19-gerelateerde macromoleculen op te lossen.

single-particle-cryo-electron-microscopy-from-sample-to-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Analyse van één deeltje in cryo-elektronenmicroscopie is een van de belangrijkste technieken die worden gebruikt om de structuur van biologische ensembles met hoge resolutie te bepalen. Scipion biedt de tools om de hele pijplijn te creëren om de informatie die door de microscoop wordt verkregen te verwerken en een 3D-reconstructie van het biologische specimen te bereiken.

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Cryo-EM-kaarten met hoge resolutie van macromoleculen kunnen ook worden bereikt met behulp van 200 kV TEM-microscopen. Dit protocol toont de best practices voor het instellen van nauwkeurige optische uitlijningen, data-acquisitieschema's en selectie van beeldvormingsgebieden die allemaal essentieel zijn voor het succesvol verzamelen van datasets met hoge resolutie met behulp van een 200 kV TEM.

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Het huidige protocol beschrijft een gegeneraliseerd en eenvoudig te implementeren schema voor het verzamelen van gekantelde gegevens met één deeltje in cryo-EM-experimenten. Een dergelijke procedure is vooral nuttig voor het verkrijgen van een hoogwaardige EM-kaart voor monsters die lijden aan preferentiële oriëntatiebias als gevolg van de naleving van de lucht-waterinterface.

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Leer cryo-EM met enkele deeltjes voor structurele biologie van macromoleculaire complexen. Deze methode helpt onderzoekers structuren te bepalen via monsterbereiding en gridscreening.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Meer video's verkennen