使用光遗传TAEL/C120系统在斑马鱼胚胎中的光诱导GFP表达

此协议意义重大，因为它是一种光遗传学或光激活方法，用于在完整的生物体中诱导基因表达。在我们的例子中，斑马鱼胚胎。这种技术的优点是，它使用光，作为诱导剂，这允许非常精确，空间和时间控制感应。

此协议对于任何诱导基因表达有用的情况都很有用。这包括血统追踪、功能获取分析或救援实验等。首先，LED 面板相对于含有胚胎的 Petri 盘，可以同时向多个胚胎提供每平方厘米 1.5 毫瓦的光功率。

为了降低照片损坏尾部转录激活器的风险，如果照明超过三小时，则使用定时器继电器每隔一小时发布一小时。取出培养皿盖，以尽量减少凝结产生的光散射。放置含有控制胚胎的培养皿和用于深色控制的防光盒。

在所需的激活持续时间后，从照明中取出胚胎。对于完全 RNA 提取，请使用 RNA 提取套件。将胚胎转移到1.5毫升的微型离心机管中，并去除多余的卵水。

添加裂解缓冲后，将胚胎与塑料害虫同质化。将解酯转移到提供的试剂盒中，并按照制造商的指示净化RNA。将纯RNA储存在零下20至零下80摄氏度，直到使用或立即合成CDNA从一微克，总RNA使用cDNA合成套件，按照制造商的指示。

将一微克RNA加入薄壁0.2毫升，PCR管，含有4微升，5倍cDNA反应主混合物，然后加入1微升，20倍反向转录酶溶液。接下来，用无核酸酶水组成20微升的最终体积。将管子放入编程的热循环器中，以便 cDNA 合成。

将合成的 cDNA 存储在零下 20 摄氏度，直到使用或立即用于定量评估。设置包含网络绿色酶主混合物的定量 PCR 反应。五倍稀释cDNA和GFP引物在325纳米摩尔浓度的三叶虫和进行反应在编程的实时PCR机。

反应完成后，分析熔化曲线以确定反应特异性。使用双三角洲 CT 方法计算光激活感应，作为相对于对照胚胎的折叠变化。并使用统计软件来确定其重要性。

从照明中取出胚胎后，将胚胎固定在3%甲基纤维素中成像，其中含有0.01%的三甲基苯在玻璃抑郁症幻灯片中。使用标准 GFP 滤镜设置，在连接到数码相机的荧光立体显微镜上获取荧光和亮场图像。收购后，将亮场和荧光图像与图像处理软件合并。

GFP 表达的量化表示在蓝光照射后 30 分钟就感应了表情。然后，GFP 表达水平继续增加，长达 6 小时，激活后稳步上升。GFP 诱导还通过在激活后的同一时间点检查荧光强度进行定性评估。

GFP 荧光高于背景水平首先在激活后三小时观察到，并在激活后六小时明显变亮。相比之下，控制胚胎的所有时间点，保持在黑暗中，没有表现出任何明显的GFP荧光。激活光必须在可见光谱的蓝色范围内。

房间的光线和阳光都包含一些蓝光。因此，请注意保护您的负控制免受任何环境光源的照射。TAEL C120 系统采用基因编码和模块化，可驱动任何感兴趣的基因表达。

因此，结合其他技术，它可以用来回答一系列生物问题。