Name: Een muismodel voor neovascularisatie van het hoornvlies door alkaliverbranding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Leer een reproduceerbaar muismodel voor hoornvliesneovascularisatie door alkaliverbranding. Deze methode helpt onderzoekers pathologische angiogenese bestuderen en nieuwe anti-angiogene therapieën evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520, en een onbeperkte institutionele subsidie van Research to Prevent Blindness (RPB) aan de afdeling Oogheelkunde, Baylor College of Medicine. W.L. wordt ondersteund door The Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology.

Al het dierwerk, inclusief de experimentele procedures en euthanasie, werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Baylor College of Medicine met protocolnummer AN-8790.
1. Bereiding van 1 N NaOH
<ol><li>Voeg 4 ml steriel gedeïoniseerd water toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Weeg 400 mg natriumhydroxide (NaOH) af en voeg voorzichtig toe aan de tube.</li>
	<li>Los de NaOH op door de oplossing langzaam te roeren met behulp van een glazen staaf. Vul het volume aan tot 10 ml door steriel gedeïoniseerd water aan de buis toe te voegen en meng opnieuw door de buis voorzichtig op en neer te keren. Sluit de dop goed en bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid de verse oplossing elke maand voor, omdat de concentratie van de NaOH-oplossing kan worden verlaagd doordat de oplossing kooldioxide in de lucht absorbeert.</li>
	<li>Meng de NaOH-oplossing altijd voorzichtig voor gebruik. LET OP: Bereid de oplossing in een chemische kap en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).</li>
</ol>2. Bereiding van de 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing
<ol><li>Voeg 30 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan een glazen bekerglas. Weeg 4 g paraformaldehyde (PFA) af en voeg dit toe aan het bekerglas.</li>
	<li>Bewaar het bekerglas al roerend op een hete plaat bij 60 °C. Voeg de 1 N NaOH-oplossing druppelsgewijs toe om de pH te verhogen totdat de oplossing helder is.</li>
	<li>Controleer de pH en stel deze in op 7,4 met behulp van 1 N zoutzuur (HCl). Pas het uiteindelijke volume aan tot 50 ml met 1x PBS.</li>
	<li>Koel en filter de oplossing. Bewaar de oplossing bij 4 °C. LET OP: Bereid de oplossing in een zuurkast terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.</li>
</ol>3. Bereiding van de ketamine/xylazine-cocktail
<ol><li>Bereid de ketamine/xylazinecocktail door 0,8 ml ketamine (voorraadconcentratie: 100 mg/ml) en 0,16 ml xylazine (voorraadconcentratie: 100 mg/ml) toe te voegen aan 9,4 ml zoutoplossing.</li>
	<li>Bewaar de cocktail in steriele injectieflessen bij kamertemperatuur (RT).</li>
</ol>4. Alkalische brandwond op het hoornvlies van de muis
<ol><li>Injecteer meloxicam (4-6 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan 30 minuten voorafgaand aan de ingreep voor pijnverlichting. Verdoof de muizen (C57BL/6J, 6-8 weken oud, mannelijk) met behulp van een i.p. injectie van de ketamine/xylazine-cocktail (ketamine 80 mg/kg en xylazine 16 mg/kg lichaamsgewicht).</li>
	<li>Controleer de reflexrespons (terugtrekking van het pedaal) door de tenen van de muis samen te knijpen en bevestig de afwezigheid van de reflex. Breng een druppel plaatselijke verdoving, 0,5% proparacaïne, aan op het hoornvliesoppervlak van het ene oog en een druppel kunsttranen op het andere oog.</li>
	<li>Gebruik een biopsiepons van 2 mm om de schijven van het Whatman-filterpapier uit te ponsen.</li>
	<li>Voeg 2 μL 1N NaOH toe aan een schone petrischaal. Plaats de schijf van 2 mm filtreerpapier op de 1 N NaOH-druppel en laat deze 15 s weken.</li>
	<li>Pak het filtreerpapier met een pincet op en breng het filtreerpapier gedurende 30 seconden aan op het met proparacaïne behandelde oog in het midden van het hoornvlies. NOTITIE: Het filterpapier mag alleen het midden van het hoornvlies raken en er moet voor worden gezorgd dat het filtreerpapier niet beweegt nadat het is geplaatst, omdat het verplaatsen van het filterpapier brandwonden aan de aangrenzende weefsels kan veroorzaken.</li>
	<li>Was het oog door te spoelen met 20 ml steriele zoutoplossing in een steriele spuit. OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat het hoornvlies, samen met de conjunctivale zak, grondig wordt gewassen om verdere schade aan het hoornvlies of het omliggende weefsel te voorkomen. Het wassen van de conjunctivale zak zal symblefaron verder voorkomen.</li>
	<li>Veeg de overtollige zoutoplossing voorzichtig van de ogen en de omgeving met zachte wegwerpdoekjes. Houd de muizen daarna in een herstelkooi op een warm verwarmingskussen tot ze ambulant zijn. OPMERKING: Muizen worden dagelijks gecontroleerd na de alkaliverbranding gedurende 3 dagen. Als symptomen van pijn of stress worden waargenomen, wordt meloxicam (4-6 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan toegediend.</li>
</ol>5. Onderzoek en beoordeling van neovascularisatie en opaciteit
<ol><li>Onderzoek bij verdoofde muizen de ogen onder een dissectiemicroscoop op dag 10 na de verbranding en verkrijg beelden met behulp van een camera die aan de dissectiescoop is bevestigd om de troebelheid en neovascularisatie te scoren. OPMERKING: Een gewone dissectiescoop met een camera eraan is voldoende.</li>
	<li>Terwijl u het hoornvlies door de dissectiemicroscoop observeert, scoort u de troebelheid na de brandwond op basis van de volgende schaal12: 0 = Geen dekking; helder hoornvlies 1 = Lichte opaciteit; lichte wazigheid in de iris- en pupilgebieden; Iris en pupil goed zichtbaar 2 = Matige dekking; Iris en pupil nauwelijks zichtbaar 3 = Ernstige opaciteit; iris of pupil niet zichtbaar 4 = Ondoorzichtig hoornvlies; Iris en pupil niet zichtbaar</li>
	<li>Terwijl u het hoornvlies door de dissectiemicroscoop observeert, scoort u de CoNV op basis van de volgende schaal12: 0 = Geen neovascularisatie; Geen nieuwe vaten uit de limbus 1 = Milde neovascularisatie; nieuwe vaartuigen afkomstig uit de limbus 2 = Matige neovascularisatie; Bloedvaten zijn afkomstig uit de limbus en groeien naar het midden van het hoornvlies 3 = Ernstige neovascularisatie; bloedvaten die afkomstig zijn van de limbus en het midden van het hoornvlies bereiken en/of kruisen</li>
	<li>Gebruik de t-toets van een student om de scores voor opaciteit en neovascularisatie tussen de alkalische brandwonden en gezonde ooggroepen statistisch te vergelijken.</li>
	<li>Euthanaseer de muizen op dag 10 door blootstelling aan isofluraan bij 5% tot 1 minuut na het stoppen van de ademhaling, gevolgd door cervicale dislocatie, en verzamel de hoornvliezen voor flat-mount beeldvorming.</li>
</ol>6. Optische coherentietomografie (OCT) beeldvorming
<ol><li>Maak OCT-beelden van het voorste segment van de ogen bij verdoofde muizen op dag 10 na de verbranding. Voer OCT-beeldacquisitie uit als een volumescan met behulp van de IR + OCT-modus met een gezichtsveld van 30° en 100% IR-intensiteit.</li>
	<li>Kwantificeer de dikte van de hoornvliezen met behulp van ImageJ-software.</li>
	<li>Om de dikte te meten, gebruikt u het gereedschap Lijnselectie in de ImageJ-software om een rechte lijn te maken tussen het voorste en achterste oppervlak van het centrale hoornvlies.</li>
	<li>Klik op Analyze > Measure in de softwaretools om de waarden over te brengen naar het gegevensvenster.</li>
	<li>Kopieer de waarden naar een spreadsheetbestand en vergelijk statistisch de dikte van het hoornvlies tussen de alkalische verbranding en gezonde ooggroepen met behulp van een t-toets van een student. NOTITIE: De dikte van het hoornvlies is de afstand van een punt op het voorste hoornvliesoppervlak tot het dichtstbijzijnde punt op het achterste hoornvliesoppervlak in het hoornvliescentrum.</li>
</ol>7. Immunokleuring voor CoNV op flat-mount hoornvliezen
<ol><li>Euthanaseer de muizen op dag 10 na alkalische verbranding en verwijder de ogen door stompe dissectie.</li>
	<li>Trek de oogleden uit elkaar met duim en wijsvinger en plaats een pincet onder de oogbol. Sluit de pincet en trek de oogbol voorzichtig uit de baan.</li>
	<li>Plaats de oogbollen in 1x PBS. Verwijder voor elke oogbol het hoornvlies uit de oogbol door eerst een incisie te maken met een naald van 30 G onder het limbusgebied.</li>
	<li>Knip rond het limbusgebied met een microschaar van het hoornvlies, met de incisie als uitgangspunt, en scheid langzaam het hoornvlies en de limbus van de bol.</li>
	<li>Reinig de hoornvliezen voorzichtig met een fijn penseel om de iris te verwijderen. Fixeer de hoornvliezen gedurende 1 uur in 4% paraformaldehyde.</li>
	<li>Was de hoornvliezen drie keer gedurende 20 minuten elk in 1x PBS op kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Incubeer in een blokkerende buffer (1x PBS aangevuld met 0,1% Triton-X 100 en 5% runderserumalbumine [BSA]) gedurende 1 uur bij RT.</li>
	<li>Breng de hoornvliezen over naar een antilichaamoplossing die primaire antilichamen bevat. Bereid de antilichaamoplossing in 1x PBS aangevuld met 1% BSA, 0.1% Triton-X 100, Dylight550-geconjugeerde anti-CD31 mAb (1:100) en Alexa Fluor488-geconjugeerde anti-LYVE-1 mAb (1:100).</li>
	<li>Incubeer gedurende 3 dagen bij 4 °C. Was de hoornvliezen in 1x PBS drie keer gedurende 20 minuten elk.</li>
	<li>Kleuring van de kernen met Hoechst kleurstofoplossing (1:1.000) gedurende 5 minuten in het donker.</li>
	<li>Druk de hoornvliezen plat met radiale sneden en monteer ze op een vooraf gereinigd objectglaasje met behulp van montagemedium en dekglaasjes. Sluit de dekglaasjes af met doorzichtige nagellak en droog de glaasjes een nacht in het donker voordat ze worden geanalyseerd met confocale microscopie.</li>
	<li>Breng de plat gemonteerde hoornvliezen in beeld met behulp van confocale microscopie door individuele Z-stack-afbeeldingen aan elkaar te naaien; Gebruik een 10x objectief, 488 nm en 561 nm lasers en een resolutie van 512 pixels x 512 pixels per plak op niet-resonante galvanoscanners.</li>
	<li>Kwantificeer de dichtheid van CD31+ bloed en LYVE-1+ lymfevaten met behulp van ImageJ-software.</li>
	<li>Om de vasculaire dichtheid te bepalen, converteert u de confocale beelden naar een 8-bits beeld.</li>
	<li>Kies Vasculaire dichtheid uit de plug-ins.</li>
	<li>Kies het interessegebied op de afbeelding en klik op OK. De metingen worden geopend in een nieuw gegevensvenster.</li>
	<li>Kopieer de waarden naar een spreadsheetbestand en vergelijk statistisch de vasculaire dichtheid tussen de alkalische brandwond en gezonde ooggroepen met behulp van een t-toets van een student. OPMERKING: CD31, ook wel bloedplaatjes endotheelceladhesiemolecuul-1 (PECAM-1) genoemd, is een celadhesiemolecuul dat betrokken is bij angiogenese en komt sterk tot expressie in de endotheelcellen van vroege en rijpe bloedvaten13. LYVE-1 (lymfevaat endotheliale hyaluronreceptor-1) is een celoppervlaktemarker op lymfatische endotheelcellen en kan worden gebruikt als lymfangiogenesemarker14.</li>
</ol>

Alkali-burn-geïnduceerde neovascularisatie van het hoornvlies bij muizen

<ol><li>Ellenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+aspects+of+corneal+angiogenic+and+lymphangiogenic+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).</li>
<li>Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+angiogenic+privilege%3A+Angiogenic+and+antiangiogenic+factors+in+corneal+avascularity%2C+vasculogenesis%2C+and+wound+healing+%28an+American+Ophthalmological+Society+thesis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Ophthalmological+Society%22%5BJournal%5D)">Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis).</a> Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).</li>
<li>Rolfsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+neovascularization%3A+A+review+of+the+molecular+biology+and+current+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies.</a> Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).</li>
<li>Skobe, M., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+the+path+of+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blocking the path of lymphatic vessels.</a> Nature Medicine. 15 (9), 993-994 (2009).</li>
<li>Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+neovascularization%3A+An+epidemiologic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular neovascularization: An epidemiologic review.</a> Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacious%2C+safe%2C+and+stable+inhibition+of+corneal+neovascularization+by+AAV-vectored+anti-VEGF+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).</li>
<li>Lasagni Vitar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+corneal+neovascularization+and+its+impact+on+visual+acuity+and+sensitivity%3A+A+14-year+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study.</a> Frontiers in Medicine. 8, 733538(2021).</li>
<li>Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+burns+acid+or+alkali%2C+what%27s+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Chemical burns acid or alkali, what's the difference.</a> Eye. 34, 1299-1300 (2020).</li>
<li>Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 2 (4413), 1416-1418 (1979).</li>
<li>Kenyon, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A model of angiogenesis in the mouse cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).</li>
<li>Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis+after+brief+corneal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation.</a> Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).</li>
<li>Yoeruek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((penetration+and+efficacy+of+topically+applied+bevacizumab%3A+Evaluation+of+eyedrops+in+corneal+neovascularization+after+chemical+burn%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn.</a> Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>DeLisser, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+endothelial+PECAM-1%2FCD31+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).</li>
<li>Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+uptake+and+degradation+of+the+lymphatic+endothelial+hyaluronan+receptor+LYVE-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).</li>
<li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li>
<li>Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+corneal+epithelium+following+a+standardized+alkali+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound.</a> Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).</li>
<li>Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Corneal neovascularization.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 12 (4), 242-249 (2001).</li>
<li>Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+human+immune+system+mice+and+their+use+to+study+tolerance+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021(2019).</li>
<li>vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+genetics+toolkit%3A+Revealing+function+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism.</a> Genome Biology. 12 (6), 224(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Het hoornvlies is een uitstekend weefsel voor het bestuderen van angiogenese en ontsteking, omdat het toegankelijk en avasculair is, wat betekent dat neovascularisatie gemakkelijk kan worden gedetecteerd en gedocumenteerd. Hoornvliesverbranding bij konijnen, ratten en muizen is gebruikt om hoornvliesangiogenese, ontsteking en troebelheid, ulceratie, perforatie van het hoornvlies en fibrose te bestuderen15,16,17. Bovendien is het muismodel van hoornvliesverbranding waardevol voor het testen van verschillende therapeutische strategieën voor angiogenese en ontsteking, omdat muizen een immuunsysteem hebben dat nauw verwant is aan dat van mensen. De beschikbaarheid van technieken om het muizengenoom genetisch te manipuleren maakt de soort ook een uitstekende keuze voor dit type onderzoek19. De uitdaging in dit onderzoek was om een methode voor verbranding van het hoornvlies te ontwikkelen die een consistente, reproduceerbare pathofysiologie biedt.
Het alkalische brandwondenmodel is met name nuttig voor de farmacologische screening van geneesmiddelen die angiogenese, ontsteking en fibrose moduleren. De minimale vereisten voor reagentia en middelen, de eenvoud van het uitvoeren van de alkaliverbranding en de voordelen van de korte duur van het protocol en de directe observatie van de resultaten maken alkaliverbranding op het hoornvlies van muizen tot een primaire keuze voor farmacologische screening van geneesmiddelen. Bij het uitvoeren van deze procedure moeten echter enkele voorzorgsmaatregelen worden overwogen om consistentie en reproduceerbaarheid te garanderen. Ten eerste moet het filtreerpapier in het midden van het hoornvlies worden geplaatst om te voorkomen dat andere delen van het oog worden verbrand, met name de limbus, oogleden en bindvlies; ten tweede moeten het volume en de concentratie van NaOH geschikt zijn om consistente resultaten te verkrijgen van de alkalische verbranding op het hoornvlies. Het filter mag niet druipnat zijn, maar moet in de NaOH-oplossing zijn gedrenkt. De filtergrootte en het filtertype en de normaliteit en het volume van de oplossing die bij deze methode wordt gebruikt, zijn geoptimaliseerd om een overloop van NaOH te voorkomen. Het gebruik van een ander formaat filtreerpapier of een hoger of lager volume NaOH zou inconsistenties in de neovascularisatie veroorzaken. Ten derde is het belangrijk om te voorkomen dat de NaOH-oplossing CO2 in de ruimtelucht opneemt door de slangdop van de oplossing na gebruik onmiddellijk vast te draaien en de lucht/oplossingsverhouding te verminderen. Er moet voor worden gezorgd dat verse alkalische oplossingen worden gebruikt om inconsistenties in de neovascularisatie te voorkomen en hoornvlieszweren te voorkomen. Ten slotte is het uitgebreid wassen van alle NaOH-oplossing uit het oog en het bindvlies met zoutoplossing noodzakelijk om verdere schade aan het hoornvlies en de omliggende weefsels van het oog te voorkomen. Het grondig wassen van het hoornvlies en de aangrenzende weefsels zal ook symblefaron voorkomen.
Het hier beschreven protocol is een efficiënte en betrouwbare methode voor het bestuderen van de pathofysiologie van cornea-angiogenese. Dit protocol kan verder worden gebruikt om hoornvliesontsteking, fibrose en wondgenezing te bestuderen.

Het hoornvlies is een avasculair weefsel dat zijn transparantie behoudt door een angiogeen privilege vast te stellen 1,2. Schade aan het hoornvlies kan leiden tot ontstekingen en de ontwikkeling van bloed- en lymfevaten, evenals fibrose3. Neovascularisatie van het hoornvlies (CoNV) leidt tot slechtziendheid en is wereldwijd de tweede belangrijkste oorzaak van blindheid4. CoNV treft ongeveer 1,4 miljoen mensen in de Verenigde Staten per jaar5. CoNV kan worden geïnduceerd door verschillende factoren, waaronder chemische brandwonden, infecties, ontstekingen en hypoxie 3,6. Chemische brandwonden zijn een van de meest voorkomende oculaire noodsituaties en zijn verantwoordelijk voor ongeveer 13.2% van het oogtrauma en vereisen onmiddellijke beoordeling en behandeling7. Chemische brandwonden kunnen alkalische of zure brandwonden zijn, maar alkalische brandwonden veroorzaken ernstiger letsel, omdat alkali dieper in het weefsel doordringt8.
Muismodellen van alkalische verbranding worden veel gebruikt om CoNV en wondgenezing te bestuderen. Vergeleken met het cornea pocket angiogenese-model 9,10 zijn alkalische brandwondmodellen relatief eenvoudig te maken en kunnen ze ook worden gebruikt om hoornvliesontsteking, fibrose en epitheliale proliferatie te bestuderen. Deze modellen zijn ook nauwer verwant aan klinische chemische brandwonden dan cornea-hechtdraadmodellen van angiogenese11. Bij alkalische verbranding ontwikkelt het anders avasculaire hoornvlies bloedvaten als gevolg van ontsteking en een onbalans in anti-angiogene en pro-angiogene factoren 1,2. De nadelen van modellen voor alkalische brandwonden van het hoornvlies zijn de moeilijkheden bij het beheersen van het gebied en de ernst van de alkaliverbranding, de variatie in neovascularisatie van het hoornvlies en onbedoelde verbranding van de aangrenzende weefsels als gevolg van een teveel aan alkalische oplossing. Het doel van deze studie is het beschrijven van een gecontroleerd model voor alkalische verbranding van het hoornvlies bij muizen met behulp van filtreerpapier dat vooraf is gedrenkt in natriumhydroxide-oplossing. Dit model kan worden gebruikt om angiogene factoren, anti-angiogene therapeutische reagentia en andere factoren en reagentia te bestuderen die ontstekingen en fibrose kunnen moduleren.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection</td><td>Hospira</td><td>KL-7302</td><td></td></tr><tr><td>30 G Needle</td><td>McKesson</td><td>16-N3005</td><td></td></tr><tr><td>A1R Confocal</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-1642R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LYVE-1</td><td>Life technologies</td><td>53-0443-82</td><td></td></tr><tr><td>ASM Module</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td>Anterior segment objectief</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>McKesson</td><td>16-1309</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermoscientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR International</td><td>22X22-1-601640G</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>AmScope</td><td>SM-4TZ-30WY-10M3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-4905</td><td></td></tr><tr><td>Gonak Hypromellose&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>17478006412</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad Sotware, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>K&amp;H Pet Products</td><td>100213018</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringe</td><td>Mckesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5110</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic Slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone&nbsp;</td><td>Bausch &amp; Lomb</td><td>24208-0795-35</td><td></td></tr><tr><td>Normal Serum</td><td>Jackson Immuno</td><td>008-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaine HCl</td><td>Bausch &amp; Lomb</td><td>24208073006</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Henry Schein</td><td>1531042</td><td></td></tr><tr><td>SMZ125</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 mL</td><td>McKesson</td><td>16-S10C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann Filter Paper</td><td>Cytiva</td><td>WHA1003323</td><td></td></tr></tbody></table>

een muismodel voor neovascularisatie van het hoornvlies door alkaliverbranding

A Mouse Model for Corneal Neovascularization by Alkali Burn

Neovascularisatie van het hoornvlies (CoNV), een pathologische vorm van angiogenese, omvat de groei van bloed- en lymfevaten in het avasculaire hoornvlies vanuit de limbus en heeft een nadelige invloed op de transparantie en het gezichtsvermogen. Alkalische verbranding is een van de meest voorkomende vormen van oogtrauma dat leidt tot CoNV. In dit protocol wordt CoNV experimenteel geïnduceerd met behulp van natriumhydroxide-oplossing op een gecontroleerde manier om reproduceerbaarheid te garanderen. Het alkalische brandmodel is nuttig voor het begrijpen van de pathologie van CoNV en kan worden uitgebreid om angiogenese in het algemeen te bestuderen vanwege de avasculariteit, transparantie en toegankelijkheid van het hoornvlies. In dit werk werd CoNV geanalyseerd door direct onderzoek onder een ontleedmicroscoop en door immunokleuring van flat-mount hoornvliezen met behulp van anti-CD31 mAb. Lymfangiogenese werd gedetecteerd op flat-mount hoornvliezen door immunokleuring met behulp van anti-LYVE-1 mAb. Hoornvliesoedeem werd gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van optische coherentietomografie (OCT). Samenvattend zal dit model helpen om bestaande neovascularisatietests vooruit te helpen en nieuwe behandelingsstrategieën voor pathologische oculaire en extraoculaire angiogenese te ontdekken.

Deze studie beschrijft een methode om cornea-angiogenese in het oog van de muis te induceren door alkalische verbranding. De beelden verkregen met de dissectiemicroscoop (Figuur 1A,B) toonden significant verhoogde neovascularisatie- en opaciteitsscores in de hoornvliezen in de alkalische brandwondengroep (P < 0,05; Figuur 1C,D). De hoornvliezen die op dag 10 werden verzameld, werden verder immunogekleurd met respectievelijk anti-CD31 mAb voor bloedvaten en anti-LYVE-1 mAb voor lymfevaten (Figuur 2A-I). De alkalische brandwondengroep vertoonde significant hogere dichtheden van bloed en lymfevaten na 10 dagen (respectievelijk P < 0,001 en P < 0,05; Figuur 2J,K). De dikte van het hoornvlies, zoals afgebeeld en gekwantificeerd met behulp van OCT (Figuur 3A,B), bleek significant hoger te zijn in de groep met alkaliverbranding (P < 0,01; Figuur 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig01.jpg"> Figuur 1: Door alkaliverbranding geïnduceerde neovascularisatie en troebelheid van het hoornvlies. (A,B) Neovascularisatie van het hoornvlies ontsproten 10 dagen na het letsel uit de limbusvaten naar het hoornvliescentrum in het (B) alkalisch verbrande muizenoog (A), maar niet in een gezond oog. (C,D) Kwantificering van de (C) neovascularisatie van het hoornvlies en (D) opaciteit in panels A en B (± SEM; t-toets; *P < 0,05; n = 3 ogen, 1 oog/muis). De rode pijlen vertegenwoordigen de limbus en de gele pijl geeft de ontkiemende nieuwe vaten aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig02.jpg"> Figuur 2: Neovascularisatie van het hoornvlies en lymfangiogenese veroorzaakt door alkalische verbranding. Immunohistochemie onthulde (A,D,G) bloed en (B,E,H) lymfevaten met behulp van respectievelijk de anti-CD31 en anti-LYVE-1 mAbs. (A-C) Het gezonde hoornvlies van muizen. (D-I) Het alkalisch verbrande hoornvlies 10 dagen na het letsel. (C,F,I) Gesuperponeerde beelden van CD31- en LYVE-1-signalen. (G-I) Ingezoomde afbeeldingen voor panelen D-F. Schaalbalken = (A-F) 200 μm en (G-I) 500 μm. (J,K) Kwantificering van de bloed- en lymfevatendichtheid in panelen A-F, zoals aangegeven (± SEM; t-toets; *P < 0,05; ***P < 0,001; n = 3 ogen, 1 oog/muis). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig03.jpg"> Figuur 3: Toename van de dikte van het hoornvlies veroorzaakt door alkalische verbranding . (A) Een OCT-afbeelding van een gezond muizenoog. (B) Een OCT-opname van het hoornvlies van de muis 10 dagen na alkalische verbranding. (C) Kwantificering van de dikte van het hoornvlies in panelen A en B, zoals gemeten in het midden van het hoornvlies (± SEM; t-toets; **P < 0,01; n = 3 ogen, 1 oog/muis). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol richt zich op alkalische brandwonden geïnduceerde neovascularisatie van het hoornvlies bij muizen. De methode genereert een reproduceerbaar en controleerbaar model voor hoornvliesaandoeningen om pathologische angiogenese en de bijbehorende moleculaire mechanismen te bestuderen en om nieuwe farmacologische middelen te testen om neovascularisatie van het hoornvlies te voorkomen.

Een muismodel voor neovascularisatie van het hoornvlies door alkaliverbranding

Corneal neovascularization (CoNV), a pathological form of angiogenesis, involves the growth of blood and lymph vessels into the avascular cornea from the ...

We proberen een zeer reproduceerbaar model te ontwikkelen voor het induceren van neovascularisatie van het hoornvlies en om de meest relevante histologische en immunokleuringsmethoden te identificeren om therapieën te monitoren om neovascularisatie te voorkomen en te verminderen. De nadelen van modellen voor alkalische brandwonden van het hoornvlies zijn moeilijkheden bij het beheersen van het gebied en de ernst van alkaliverbranding, variatie van neovascularisatie van het hoornvlies en onbedoelde verbranding van randen en weefsels als gevolg van een teveel aan alkalische oplossing. Neovascularisatie van het hoornvlies is een plaatsbedreigende aandoening.De pathogenese van deze aandoening wordt slecht begrepen. Dit model zal worden gebruikt om nieuw inzicht te krijgen in de aandoening en om relevante therapeutische doelen te identificeren Vergeleken met het cornea pocket angiogenese-model zijn alkalische brandwondmodellen relatief eenvoudig te maken en kunnen ze ook worden gebruikt om hoornvliesontsteking, fibrose en epitheliale proliferatie te bestuderen. Deze modellen zijn ook nauwer verwant aan klinische chemische brandwonden dan hoornvlieshechtingsmodellen van angiogenese.We zullen alkali burn cornea gebruiken als ziektemodel om een nieuwe anti-angiogene therapie te onderzoeken om neovascularisatie en troebelheid van het hoornvlies te behandelen.

a-mouse-model-for-corneal-neovascularization-by-alkali-burn

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies kan compliceren meerdere visuele pathologieën. Met behulp van een gecontroleerde, alkali-brandwonden-model, kan een kwantificeerbare niveau van de cornea NV worden geproduceerd voor mechanistische studie van het hoornvlies NV en evaluatie van potentiële therapieën voor neovascular aandoeningen.

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

Dit protocol beschrijft een methode om een slijtage aan de oculaire oppervlakte van de muis toebrengen, en volgen de wond genezingsproces daarna. Het protocol maakt gebruik van een oogbeschadigingen en/of burr gedeeltelijk verwijderen van de oppervlakte-epitheel van het oog bij verdoofde muizen.

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

Dit protocol beschrijft een methode om een nauwkeurig en reproduceerbaar hoornvlies- en limbaal alkalisch letsel te induceren in een muismodel. Het protocol is voordelig omdat het een gelijkmatig verdeelde verwonding van het sterk gekromde hoornvlies en de limbus van de muis mogelijk maakt.

Inductie van hoornvlies- en limbale alkalische letsels met behulp van een punch-trephine-techniek in een muismodel

Orthotope diermodellen van kanker van de eierstokken te repliceren beter mens-en vaatziekten en daardoor meer inzicht in de progressie van kanker en tumor respons op therapie. Een muis model krijgt een intrabursale injectie van luciferase-expressie ovarium tumorcellen. De behandeling wordt toegediend via orale sondevoeding. Tumorgroei wordt bewaakt...

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Niermergactiviteit kan bij paardachtigen worden beoordeeld door analyse van corticosteron-metabolieten in de ontlasting. De methode biedt een niet-invasieve optie om langetermijnpatronen bij zowel gedomesticeerde als vrijlevende paarden te beoordelen. Dit protocol beschrijft de betrokken enzymgekoppelde immunossay en de bijbehorende biochemische validatie.

Fecale Glucocorticoïd Analyse: Niet-invasieve bijnier Toezicht op Equids

Dit manuscript biedt een gedetailleerde chirurgische procedure voor het uitvoeren van muis 5/6th gedeeltelijke Nefrectomie (PNx) met pool afbinding. Vier weken na de operatie, in vergelijking met sham bediende muizen, de PNx muizen ontwikkeld nierfunctiestoornissen, bloedarmoede, hypertrofie van het hart, cardiale fibrose en daalde van systolische en diastolische hartfunctie.

Een 5/6th Nefrectomie muismodel dat experimentele uremisch cardiomyopathie induceert

Hier presenteren we een protocol ter verhoging van de productie van de chimera zonder het gebruik van nieuwe apparatuur. Een verandering van de eenvoudige oriëntatie van het embryo voor injectie kan verhogen van het aantal embryo's geproduceerd, en potentieel het reduceren van de tijdlijn tot germline transmissie.

Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt

Dit protocol beschrijft een methode voor te bereiden van verrijkte stomatal guard cellen die nuttig is voor fysiologische en andere biologische studies.

Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel

Leer een reproduceerbaar muismodel voor hoornvliesneovascularisatie door alkaliverbranding. Deze methode helpt onderzoekers pathologische angiogenese bestuderen en nieuwe anti-angiogene therapieën evalueren.

Een muismodel voor neovascularisatie van het hoornvlies door alkaliverbranding

Meer video's verkennen