Name: Ein Mausmodell für Hornhautneovaskularisation durch Alkaliverbrennung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Erfahren Sie ein reproduzierbares Alkaliverbrennungsmodell zur Induktion von Hornhautneovaskularisation bei männlichen C57BL/6J-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung pathologischer Angiogenese und die Evaluation neuer antiangiogener Therapien.

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Diese Arbeit wurde von der SRB Charitable Corporation, dem P30EY002520 der National Institutes of Health (NIH) und einem uneingeschränkten institutionellen Zuschuss von Research to Prevent Blindness (RPB) an die Abteilung für Augenheilkunde des Baylor College of Medicine unterstützt. W.L. wird von der Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology unterstützt.

Alle tierischen Arbeiten, einschließlich der Versuchsverfahren und der Euthanasie, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Baylor College of Medicine mit der Protokollnummer AN-8790 genehmigt.
1. Herstellung von 1 N NaOH
<ol><li>Geben Sie 4 ml steriles deionisiertes Wasser in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. 400 mg Natriumhydroxid (NaOH) abwiegen und vorsichtig in das Röhrchen geben.</li>
	<li>Lösen Sie die NaOH auf, indem Sie die Lösung langsam mit einem Glasstab umrühren. Füllen Sie das Volumen auf 10 ml, indem Sie steriles deionisiertes Wasser in das Röhrchen geben, und mischen Sie es erneut, indem Sie das Röhrchen vorsichtig auf und ab drehen. Verschließen Sie die Kappe fest und lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie die frische Lösung jeden Monat zu, da die Konzentration der NaOH-Lösung dadurch verringert werden kann, dass die Lösung Kohlendioxid in der Luft absorbiert.</li>
	<li>Mischen Sie die NaOH-Lösung vor Gebrauch immer vorsichtig. VORSICHT: Bereiten Sie die Lösung in einer chemischen Haube vor und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA).</li>
</ol>2. Herstellung der 4%igen Paraformaldehyd (PFA)-Lösung
<ol><li>30 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein Glasbecherglas geben. 4 g Paraformaldehyd (PFA) abwiegen und in das Becherglas geben.</li>
	<li>Den Becher auf einer heißen Platte bei 60 °C unter Rühren aufbewahren. Geben Sie die 1 N NaOH-Lösung tropfenweise hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen, bis die Lösung klar ist.</li>
	<li>Prüfen und stellen Sie den pH-Wert mit 1 N Salzsäure (HCl) auf 7,4 ein. Stellen Sie das Endvolumen mit 1x PBS auf 50 ml ein.</li>
	<li>Kühlen Sie die Lösung ab und filtern Sie sie. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C. VORSICHT: Bereiten Sie die Lösung in einem Abzug zu, während Sie geeignete PSA tragen.</li>
</ol>3. Zubereitung des Ketamin/Xylazin-Cocktails
<ol><li>Bereiten Sie den Ketamin/Xylazin-Cocktail zu, indem Sie 0,8 ml Ketamin (Stammkonzentration: 100 mg/ml) und 0,16 ml Xylazin (Stammkonzentration: 100 mg/ml) zu 9,4 ml Kochsalzlösung hinzufügen.</li>
	<li>Bewahren Sie den Cocktail in sterilen Injektionsflaschen bei Raumtemperatur (RT) auf.</li>
</ol>4. Alkalibrand auf der Hornhaut der Maus
<ol><li>Meloxicam (4-6 mg/kg Körpergewicht) 30 Minuten vor dem Eingriff zur Schmerzlinderung subkutan injizieren. Betäubung der Mäuse (C57BL/6J, 6-8 Wochen alt, männlich) mit einer i.p. Injektion des Ketamin/Xylazin-Cocktails (Ketamin 80 mg/kg und Xylazin 16 mg/kg Körpergewicht).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Reflexreaktion (Pedalrückzug), indem Sie die Zehen der Maus zusammendrücken, und bestätigen Sie, dass der Reflex nicht vorhanden ist. Tragen Sie einen Tropfen topisches Anästhetikum, 0,5% Proparacain, auf die Hornhautoberfläche eines Auges und einen Tropfen künstliche Tränen auf das andere Auge auf.</li>
	<li>Stanzen Sie mit einer 2-mm-Biopsiestanze Whatman-Filterpapierscheiben aus.</li>
	<li>2 μl 1N NaOH in eine saubere Petrischale geben. Die 2-mm-Filterpapierscheibe auf den 1 N NaOH-Tropfen legen und 15 s einwirken lassen.</li>
	<li>Nehmen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette auf und tragen Sie das Filterpapier 30 s lang auf das mit Proparacain behandelte Auge in der Mitte der Hornhaut auf. HINWEIS: Das Filterpapier darf nur die Mitte der Hornhaut berühren, und es muss darauf geachtet werden, dass sich das Filterpapier nach dem Einsetzen nicht bewegt, da das Bewegen des Filterpapiers zu Verbrennungen der angrenzenden Gewebe führen kann.</li>
	<li>Waschen Sie das Auge, indem Sie es mit 20 ml steriler Kochsalzlösung in einer sterilen Spritze spülen. HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Hornhaut zusammen mit dem Bindehautsack gründlich gewaschen wird, um sicherzustellen, dass die Hornhaut oder das umgebende Gewebe nicht weiter beschädigt werden. Das Waschen des Bindehautsacks beugt dem Symblepharon weiter vor.</li>
	<li>Wischen Sie die überschüssige Kochsalzlösung vorsichtig mit weichen Einwegtüchern von den Augen und der Umgebung ab. Halten Sie die Mäuse anschließend in einem Erholungskäfig auf einem warmen Heizkissen, bis sie gehfähig sind. HINWEIS: Mäuse werden nach der Alkaliverbrennung 3 Tage lang täglich überwacht. Bei Schmerz- oder Stresssymptomen wird Meloxicam (4-6 mg/kg Körpergewicht) subkutan verabreicht.</li>
</ol>5. Untersuchung und Beurteilung der Neovaskularisation und Trübung
<ol><li>Bei anästhesierten Mäusen werden die Augen am 10. Tag nach der Verbrennung unter einem Seziermikroskop untersucht und Bilder mit einer am Seziergerät befestigten Kamera aufgenommen, um die Trübung und Neovaskularisation zu bewerten. HINWEIS: Ein normales Sezierfernrohr mit angeschlossener Kamera ist ausreichend.</li>
	<li>Während Sie die Hornhaut durch das Präpariermikroskop betrachten, bewerten Sie die Trübung nach der Verbrennung anhand der folgenden Skala12: 0 = Keine Deckkraft; Klare Hornhaut 1 = Leichte Deckkraft; leichte Trübung im Iris- und Pupillenbereich; Iris und Pupille gut sichtbar 2 = Mäßige Deckkraft; Iris und Pupille kaum sichtbar 3 = Starke Deckkraft; Iris oder Pupille nicht sichtbar 4 = Undurchsichtige Hornhaut; Iris und Pupille nicht sichtbar</li>
	<li>Während Sie die Hornhaut durch das Präpariermikroskop betrachten, bewerten Sie die CoNV anhand der folgenden Skala12: 0 = Keine Neovaskularisation; Keine neuen Gefäße aus dem Limbus 1 = Leichte Neovaskularisation; Neue Gefäße, die aus dem Limbus stammen 2 = Moderate Neovaskularisation; Die Blutgefäße entsprangen dem Limbus und wuchsen zum Zentrum der Hornhaut hin 3 = Schwere Neovaskularisation; Blutgefäße, die vom Limbus ausgehen und das Zentrum der Hornhaut erreichen und/oder kreuzen</li>
	<li>Verwenden Sie einen Student's t-Test, um die Trübungs- und Neovaskularisierungswerte zwischen der Alkaliverbrennungs- und der gesunden Augengruppe statistisch zu vergleichen.</li>
	<li>Euthanasieren Sie die Mäuse an Tag 10 durch Isofluran-Exposition bei 5% bis 1 Minute nach Atemstopps, gefolgt von einer Zervixluxation, und sammeln Sie die Hornhäute für die flache Bildgebung.</li>
</ol>6. Optische Kohärenztomographie (OCT)
<ol><li>Nehmen Sie OCT-Bilder des vorderen Augenabschnitts bei anästhesierten Mäusen am 10. Tag nach der Verbrennung an. Führen Sie die OCT-Bildaufnahme als Volumenscan im IR + OCT-Modus mit einem Sichtfeld von 30° und einer IR-Intensität von 100 % durch.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Dicke der Hornhäute mit der ImageJ-Software.</li>
	<li>Um die Dicke zu messen, verwenden Sie das Linienauswahl-Werkzeug in der ImageJ-Software, um eine gerade Linie zwischen der vorderen und der hinteren Fläche an der zentralen Hornhaut zu erstellen.</li>
	<li>Klicken Sie in den Software-Tools auf Analyze > Measure , um die Werte in das Datenfenster zu übertragen.</li>
	<li>Kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei, und vergleichen Sie statistisch die Hornhautdicke zwischen der Alkaliverbrennungs- und der gesunden Augengruppe mit einem Schüler-t-Test. HINWEIS: Die Dicke der Hornhaut ist der Abstand von einem Punkt auf der vorderen Hornhautoberfläche zum nächstgelegenen Punkt auf der hinteren Hornhautoberfläche in der Hornhautmitte.</li>
</ol>7. Immunfärbung für CoNV auf flach montierten Hornhäuten
<ol><li>Euthanasieren Sie die Mäuse am 10. Tag nach der Alkaliverbrennung und enukleieren Sie die Augen durch stumpfe Sektion.</li>
	<li>Ziehen Sie die Augenlider mit Daumen und Zeigefinger auseinander und legen Sie eine Pinzette unter die Augenkugel. Schließen Sie die Pinzette und ziehen Sie den Augapfel vorsichtig von der Augenhöhle ab.</li>
	<li>Legen Sie die Augäpfel in 1x PBS. Entfernen Sie für jeden Augapfel die Hornhaut aus der Augenkugel, indem Sie zunächst einen Schnitt mit einer 30-G-Nadel unterhalb des Limbusbereichs machen.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Hornhaut-Mikroschere um den Limbusbereich herum, mit dem Einschnitt als Ausgangspunkt, und trennen Sie langsam die Hornhaut und den Limbus von der Kugel.</li>
	<li>Reinigen Sie die Hornhaut vorsichtig mit einem feinen Pinsel, um die Iris zu entfernen. Fixieren Sie die Hornhäute 1 h lang in 4%igem Paraformaldehyd.</li>
	<li>Waschen Sie die Hornhäute dreimal für jeweils 20 min in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>In einem Blockierungspuffer (1x PBS supplementiert mit 0,1% Triton-X 100 und 5% Rinderserumalbumin [BSA]) für 1 h bei RT inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Hornhäute in eine Antikörperlösung, die primäre Antikörper enthält. Bereiten Sie die Antikörperlösung in 1x PBS mit 1 % BSA, 0,1 % Triton-X 100, Dylight550-konjugiertem Anti-CD31-mAb (1:100) und Alexa Fluor488-konjugiertem Anti-LYVE-1-mAb (1:100) vor.</li>
	<li>3 Tage bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Hornhäute in 1x PBS dreimal für jeweils 20 min.</li>
	<li>Die Zellkerne mit Hoechst-Färbelösung (1:1.000) 5 min im Dunkeln färben.</li>
	<li>Glätten Sie die Hornhäute mit radialen Schnitten und montieren Sie sie mit Eindeckmaterial und Deckgläsern auf einem vorgereinigten Objektträger. Versiegeln Sie die Deckgläser mit klarem Nagellack und trocknen Sie die Objektträger über Nacht im Dunkeln, bevor Sie sie mit konfokaler Mikroskopie analysieren.</li>
	<li>Abbildung der flach montierten Hornhäute mit konfokaler Mikroskopie durch Zusammenfügen einzelner Z-Stapel-Bilder; Verwenden Sie ein 10-fach-Objektiv, 488-nm- und 561-nm-Laser und eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln pro Schicht auf nicht-resonanten Galvano-Scannern.</li>
	<li>Quantifizierung der Dichte von CD31+-Blut- und LYVE-1+-Lymphgefäßen mit der ImageJ-Software.</li>
	<li>Um die Gefäßdichte zu bestimmen, wandeln Sie die konfokalen Bilder in ein 8-Bit-Bild um.</li>
	<li>Wählen Sie Vascular Density aus den Plugins.</li>
	<li>Wählen Sie die gewünschte Region auf dem Bild aus und klicken Sie auf OK. Die Messungen werden in einem neuen Datenfenster geöffnet.</li>
	<li>Kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei, und vergleichen Sie statistisch die Gefäßdichte zwischen der Alkaliverbrennungs- und der gesunden Augengruppe mit einem Schüler-t-Test. HINWEIS: CD31, auch Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1) genannt, ist ein Zelladhäsionsmolekül, das an der Angiogenese beteiligt ist und in den Endothelzellen früher und reifer Blutgefäße stark exprimiert wird13. LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1) ist ein Zelloberflächenmarker auf lymphatischen Endothelzellen und kann als Lymphangiogenese-Marker verwendet werden14.</li>
</ol>

Durch Alkalibrand induzierte Hornhautneovaskularisation bei Mäusen

<ol><li>Ellenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+aspects+of+corneal+angiogenic+and+lymphangiogenic+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).</li>
<li>Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+angiogenic+privilege%3A+Angiogenic+and+antiangiogenic+factors+in+corneal+avascularity%2C+vasculogenesis%2C+and+wound+healing+%28an+American+Ophthalmological+Society+thesis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Ophthalmological+Society%22%5BJournal%5D)">Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis).</a> Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).</li>
<li>Rolfsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+neovascularization%3A+A+review+of+the+molecular+biology+and+current+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies.</a> Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).</li>
<li>Skobe, M., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+the+path+of+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blocking the path of lymphatic vessels.</a> Nature Medicine. 15 (9), 993-994 (2009).</li>
<li>Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+neovascularization%3A+An+epidemiologic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular neovascularization: An epidemiologic review.</a> Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacious%2C+safe%2C+and+stable+inhibition+of+corneal+neovascularization+by+AAV-vectored+anti-VEGF+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).</li>
<li>Lasagni Vitar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+corneal+neovascularization+and+its+impact+on+visual+acuity+and+sensitivity%3A+A+14-year+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study.</a> Frontiers in Medicine. 8, 733538(2021).</li>
<li>Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+burns+acid+or+alkali%2C+what%27s+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Chemical burns acid or alkali, what's the difference.</a> Eye. 34, 1299-1300 (2020).</li>
<li>Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 2 (4413), 1416-1418 (1979).</li>
<li>Kenyon, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A model of angiogenesis in the mouse cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).</li>
<li>Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis+after+brief+corneal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation.</a> Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).</li>
<li>Yoeruek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((penetration+and+efficacy+of+topically+applied+bevacizumab%3A+Evaluation+of+eyedrops+in+corneal+neovascularization+after+chemical+burn%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn.</a> Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>DeLisser, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+endothelial+PECAM-1%2FCD31+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).</li>
<li>Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+uptake+and+degradation+of+the+lymphatic+endothelial+hyaluronan+receptor+LYVE-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).</li>
<li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li>
<li>Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+corneal+epithelium+following+a+standardized+alkali+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound.</a> Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).</li>
<li>Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Corneal neovascularization.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 12 (4), 242-249 (2001).</li>
<li>Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+human+immune+system+mice+and+their+use+to+study+tolerance+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021(2019).</li>
<li>vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+genetics+toolkit%3A+Revealing+function+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism.</a> Genome Biology. 12 (6), 224(2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die Hornhaut ist ein hervorragendes Gewebe für die Untersuchung von Angiogenese und Entzündungen, da sie zugänglich und avaskulär ist, was bedeutet, dass Neovaskularisationen bequem erkannt und dokumentiert werden können. Hornhautverbrennungen bei Kaninchen, Ratten und Mäusen wurden verwendet, um Hornhautangiogenese, Entzündung und Trübung, Ulzeration, Perforation der Hornhaut und Fibrose zu untersuchen15,16,17. Darüber hinaus ist das Mausmodell der Hornhautverbrennung wertvoll für die Erprobung verschiedener therapeutischer Strategien für Angiogenese und Entzündung, da Mäuse ein Immunsystem haben, das eng mit dem des Menschen verwandt ist18. Die Verfügbarkeit von Techniken zur genetischen Manipulation des Mausgenoms macht die Spezies auch zu einer ausgezeichneten Wahl für diese Art von Studie19. Die Herausforderung bei dieser Forschung bestand darin, eine Methode zur Hornhautverbrennung zu entwickeln, die eine konsistente, reproduzierbare Pathophysiologie ermöglicht.
Das Alkaliverbrennungsmodell ist besonders nützlich für das pharmakologische Screening von Medikamenten, die Angiogenese, Entzündung und Fibrose modulieren. Die minimalen Anforderungen an Reagenzien und Ressourcen, die Einfachheit der Durchführung der Alkaliverbrennung und die Vorteile der kurzen Dauer des Protokolls und der direkten Beobachtung der Ergebnisse machen die Alkaliverbrennung auf der Hornhaut der Maus zu einer ersten Wahl für das pharmakologische Wirkstoffscreening. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten jedoch einige Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden, um Konsistenz und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Erstens muss das Filterpapier in der Mitte der Hornhaut platziert werden, um zu vermeiden, dass andere Bereiche des Auges verbrannt werden, insbesondere der Limbus, die Augenlider und die Bindehaut. Zweitens sollten das Volumen und die Konzentration von NaOH angemessen sein, um konsistente Ergebnisse aus der Alkaliverbrennung auf der Hornhaut zu erhalten. Der Filter darf nicht tropfnass sein, sollte aber in der NaOH-Lösung getränkt sein. Die Filtergröße und der Filtertyp sowie die Normalität und das Volumen der bei dieser Methode verwendeten Lösung sind optimiert, um einen Überlauf von NaOH zu vermeiden. Die Verwendung eines unterschiedlich großen Filterpapiers oder eines höheren oder niedrigeren NaOH-Volumens würde zu Inkonsistenzen in der Neovaskularisation führen. Drittens ist es wichtig, die Aufnahme von CO2 in der Raumluft durch die NaOH-Lösung zu verhindern, indem die Röhrchenkappe der Lösung nach Gebrauch sofort festgezogen und das Luft-Lösungs-Verhältnis reduziert wird. Es muss darauf geachtet werden, frische Alkalilösungen zu verwenden, um Inkonsistenzen in der Neovaskularisation zu vermeiden und Hornhautulzerationen zu vermeiden. Schließlich ist ein ausgiebiges Waschen der gesamten NaOH-Lösung aus dem Auge und der Bindehaut mit Kochsalzlösung erforderlich, um weitere Schäden an der Hornhaut und dem umgebenden Gewebe des Auges zu verhindern. Das gründliche Waschen der Hornhaut und des angrenzenden Gewebes verhindert ebenfalls ein Symblepharon.
Das hier beschriebene Protokoll ist eine effiziente und zuverlässige Methode zur Untersuchung der Pathophysiologie der Hornhautangiogenese. Dieses Protokoll kann weiter verwendet werden, um Hornhautentzündungen, Fibrose und Wundheilung zu untersuchen.

Die Hornhaut ist ein avaskuläres Gewebe, das seine Transparenz aufrechterhält, indem es ein angiogenes Privileg etabliert 1,2. Eine Schädigung der Hornhaut kann zu Entzündungen und der Entwicklung von Blut- und Lymphgefäßen sowie zu einer Fibroseführen 3. Die Hornhautneovaskularisation (CoNV) führt zu Sehstörungen und ist weltweit die zweithäufigste Erblindungsursache4. CoNV betrifft etwa 1,4 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten pro Jahr5. CoNV kann durch verschiedene Faktoren induziert werden, darunter Verätzungen, Infektionen, Entzündungen und Hypoxie 3,6. Verätzungen sind einer der häufigsten Augennotfälle und machen etwa 13,2 % der Augentraumata aus und erfordern eine sofortige Beurteilung und Behandlung7. Chemische Verbrennungen können Alkali- oder Säureverbrennungen sein, aber Alkaliverbrennungen verursachen schwerere Verletzungen, da Alkali tiefer in das Gewebe eindringt8.
Mausmodelle für Alkaliverbrennungen werden häufig verwendet, um CoNV und Wundheilung zu untersuchen. Im Vergleich zum Hornhauttaschen-Angiogenese-Modell 9,10 sind Alkaliverbrennungsmodelle relativ einfach zu erstellen und können auch zur Untersuchung von Hornhautentzündungen, Fibrose und Epithelproliferation verwendet werden. Diese Modelle sind auch enger mit klinischen Verätzungen verwandt als Hornhautnahtmodelle der Angiogenese11. Bei einer alkalischen Verbrennung entwickelt die ansonsten avaskuläre Hornhaut aufgrund von Entzündungen und einem Ungleichgewicht der anti-angiogenen und pro-angiogenen Faktoren Blutgefäße 1,2. Die Nachteile von Hornhaut-Alkaliverbrennungsmodellen sind die Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Fläche und des Schweregrads der Alkaliverbrennung, die Variation der Hornhautneovaskularisation und das unbeabsichtigte Verbrennen des angrenzenden Gewebes aufgrund überschüssiger Alkalilösung. Der Zweck dieser Studie ist es, ein kontrolliertes Hornhaut-Alkali-Verbrennungsmodell bei Mäusen zu beschreiben, bei denen in Natronlauge vorgetränktes Filterpapier verwendet wird. Dieses Modell könnte verwendet werden, um angiogene Faktoren, anti-angiogene therapeutische Reagenzien und andere Faktoren und Reagenzien zu untersuchen, die Entzündungen und Fibrose modulieren könnten.

<table><tbody><tr><td>0,9 % Natriumchlorid-Injektion</td><td>Hospira</td><td>KL-7302</td><td></td></tr><tr><td>30 g Nadel</td><td>McKesson</td><td>16-N3005</td><td></td></tr><tr><td>A1R Konfokal</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-1642R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LYVE-1</td><td>Life Technologies</td><td>53-0443-82</td><td></td></tr><tr><td>ASM Modul</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td>Vorderabschnittsobjektiv</td></tr><tr><td>Biopsie Stanze</td><td>McKesson</td><td>16-1309</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermoscientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR International</td><td>22X22-1-601640G</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>AmScope</td><td>SM-4TZ-30WY-10M3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-4905</td><td></td></tr><tr><td>Gonak Hypromellose&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>17478006412</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad Sotware, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>K& H Pet Products</td><td>100213018</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>Mckesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5110</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin und Polymyxin B-Sulfate und Dexamethason&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208-0795-35</td><td></td></tr><tr><td>Normales Serum</td><td>Jackson Immuno</td><td>008-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Proparacain HCl</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208073006</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Henry Schein</td><td>1531042</td><td></td></tr><tr><td>SMZ125</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze 10 mL</td><td>McKesson</td><td>16-S10C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann Filterpapier</td><td>Cytiva</td><td>WHA1003323</td><td></td></tr></tbody></table>

ein mausmodell für hornhautneovaskularisation durch alkaliverbrennung

A Mouse Model for Corneal Neovascularization by Alkali Burn

Die Hornhautneovaskularisation (CoNV), eine pathologische Form der Angiogenese, beinhaltet das Wachstum von Blut- und Lymphgefäßen aus dem Limbus in die avaskuläre Hornhaut und beeinträchtigt die Transparenz und das Sehvermögen. Die Alkaliverbrennung ist eine der häufigsten Formen des Augentraumas, die zu CoNV führt. In diesem Protokoll wird CoNV experimentell mit Natronlauge auf kontrollierte Weise induziert, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Das Alkaliverbrennungsmodell ist nützlich für das Verständnis der Pathologie der CoNV und kann aufgrund der Avaskularität, Transparenz und Zugänglichkeit der Hornhaut erweitert werden, um die Angiogenese im Allgemeinen zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde CoNV durch direkte Untersuchung unter einem Präpariermikroskop und durch Immunfärbung von flachen Hornhäuten mit anti-CD31 mAb analysiert. Die Lymphangiogenese wurde auf flach montierten Hornhäuten durch Immunfärbung mit anti-LYVE-1 mAb nachgewiesen. Das Hornhautödem wurde mittels optischer Kohärenztomographie (OCT) sichtbar gemacht und quantifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell dazu beitragen wird, bestehende Neovaskularisationsassays weiterzuentwickeln und neue Behandlungsstrategien für die pathologische okuläre und extraokuläre Angiogenese zu entdecken.

Diese Studie beschreibt eine Methode, um die Hornhautangiogenese im Mausauge durch Alkaliverbrennung zu induzieren. Die mit dem Dissektionsmikroskop aufgenommenen Bilder (Abbildung 1A,B) zeigten signifikant erhöhte Neovaskularisations- und Trübungswerte in den Hornhäuten in der Alkaliverbrennungsgruppe (P &lt; 0,05; Abbildung 1C,D). Die Hornhäute, die an Tag 10 entnommen wurden, wurden weiter mit anti-CD31 mAb für Blutgefäße bzw. anti-LYVE-1 mAb für Lymphgefäße immungefärbt (Abbildung 2A-I). Die Alkaliverbrennungsgruppe zeigte nach 10 Tagen signifikant höhere Dichten von Blut- und Lymphgefäßen (P &lt; 0,001 bzw. P &lt; 0,05; Abbildung 2J,K). Die Dicke der Hornhaut, wie sie mit OCT abgebildet und quantifiziert wurde (Abbildung 3A,B), war in der Gruppe mit Alkalibrand signifikant höher (P &lt; 0,01; Abbildung 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig01.jpg"> Abbildung 1: Alkaliverbrennung-induzierte Hornhautneovaskularisation und Trübung. (A,B) 10 Tage nach der Verletzung sprossen Hornhautneovaskularisationen aus den Limbusgefäßen in Richtung Hornhautzentrum im (B) alkalisch verbrannten Mausauge (A), aber nicht im gesunden Auge. (C,D) Quantifizierung der (C) Hornhautneovaskularisation und (D) Opazität in den Panels A und B (± REM; t-Test; *P &lt; 0,05; n = 3 Augen, 1 Auge/Maus). Die roten Pfeile stellen den Limbus dar, und der gelbe Pfeil zeigt die sprießenden neuen Gefäße an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig02.jpg"> Abbildung 2: Hornhautneovaskularisation und Lymphangiogenese durch Alkaliverbrennung. Die Immunhistochemie ergab (A,D,G)-Blut- und (B,E,H)-LYMPHGEFÄẞE UNTER VERWENDUNG DER ANTI-CD31- bzw. Anti-LYVE-1-mAbs. (A-C) Die gesunde Hornhaut der Maus. (D-I) Die alkalisch verbrannte Hornhaut 10 Tage nach der Verletzung. (C,F,I) Überlagerte Bilder von CD31- und LYVE-1-Signalen. (G-I) Vergrößerte Bilder für die Panels D-F. Maßstäbe = (A-F) 200 μm und (G-I) 500 μm. (J,K) Quantifizierung der Blut- und Lymphgefäßdichte in den Panels A-F, wie angegeben (± REM; t-Test; *P &lt; 0,05; ***P &lt; 0,001; n = 3 Augen, 1 Auge/Maus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65289/65289fig03.jpg"> Abbildung 3: Zunahme der Hornhautdicke durch Alkaliverbrennung . (A) Ein OCT-Bild eines gesunden Mausauges. (B) Ein OCT-Bild der Hornhaut der Maus 10 Tage nach der Alkaliverbrennung. (C) Quantifizierung der Hornhautdicke in den Panels A und B, gemessen in der Mitte der Hornhaut (± REM; t-Test; **P &lt; 0,01; n = 3 Augen, 1 Auge/Maus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65289/65289fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die durch Alkaliverbrennungen induzierte Hornhautneovaskularisation bei Mäusen. Die Methode generiert ein reproduzierbares und kontrollierbares Hornhauterkrankungsmodell, um die pathologische Angiogenese und die damit verbundenen molekularen Mechanismen zu untersuchen und neue pharmakologische Wirkstoffe zur Verhinderung der Hornhautneovaskularisation zu testen.

Ein Mausmodell für Hornhautneovaskularisation durch Alkaliverbrennung

Corneal neovascularization (CoNV), a pathological form of angiogenesis, involves the growth of blood and lymph vessels into the avascular cornea from the ...

Wir versuchen, ein hochgradig reproduzierbares Modell zur Induktion von Hornhautneovaskularisation zu entwickeln und die relevantesten histologischen und immunfärbenden Methoden zur Überwachung von Therapien zur Vorbeugung und Reduzierung von Neovaskularisation zu identifizieren. Die Nachteile von Hornhaut-Alkaliverbrennungsmodellen sind Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Fläche und des Schweregrads der Alkaliverbrennung, Variationen der Hornhautneovaskularisation und unbeabsichtigte Verbrennungen von Kanten und Geweben aufgrund überschüssiger Alkalilösung. Die Hornhautneovaskularisation ist eine stellenbedrohliche Erkrankung.Die Pathogenese dieser Erkrankung ist nur unzureichend verstanden. Dieses Modell wird verwendet, um neue Einblicke in die Erkrankung zu gewinnen und relevante therapeutische Ziele zu identifizieren. Im Vergleich zum Hornhauttaschen-Angiogenese-Modell sind Alkaliverbrennungsmodelle relativ einfach zu erstellen und können auch zur Untersuchung von Hornhautentzündungen, Fibrose und Epithelproliferation verwendet werden. Diese Modelle sind auch enger mit klinischen Verätzungen verwandt als Hornhautnahtmodelle der Angiogenese.Wir werden die Hornhaut mit Alkaliverbrennung als Krankheitsmodell verwenden, um eine neuartige anti-angiogene Therapie zur Behandlung von Hornhautneovaskularisation und Trübung zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden.

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, einen Abrieb auf der Augenoberfläche der Maus zuzufügen und die Wundheilung danach zu folgen. Das Protokoll nutzt eine augenfällige Grat, teilweise das oberflächenepithel des Auges in narkotisierter Mäuse zu entfernen.

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.

Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Induktion einer genauen und reproduzierbaren Hornhaut- und Limbusalkaliverletzung in einem Mausmodell. Das Protokoll ist vorteilhaft, da es eine gleichmäßig verteilte Verletzung der stark gekrümmten Hornhaut und des Limbus der Maus ermöglicht.

Induktion von Hornhaut- und Limbusalkaliverletzungen mit einer Stanz-Trephin-Technik in einem Mausmodell

Orthotopen Tiermodellen von Eierstockkrebs zu replizieren besser menschlicher Erkrankungen und damit zu unserem Verständnis der Tumorprogression und Ansprechen des Tumors auf die Therapie. Ein Maus-Modell erhält eine intrabursalen Injektion von Luciferase-exprimierenden Eierstock-Tumorzellen. Die Behandlung erfolgt über eine orale Sonde verabreicht. Das Tumorwachstum wird durch...

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Die Nebennierenaktivität kann bei Pferden durch Analyse des Kots auf Corticosteron-Metaboliten beurteilt werden. Die Methode bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, langfristige Muster sowohl bei Haus- als auch bei Freilandpferden zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt den beteiligten enzymgekoppelten Immunoassay und die damit verbundene biochemische Validierung.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Diese Handschrift enthält eine detaillierte zweistufigen chirurgische Prozedur zum Maus 5/6th partiellen Nephrektomie (PNx) mit Pol Ligatur durchzuführen. Vier Wochen nach der Operation im Vergleich zu Schein betrieben Mäuse, die PNx Mäuse entwickelt, eingeschränkter Nierenfunktion, Anämie, Herzhypertrophie, kardialer Fibrose und sank der systolische und der diastolische Herzfunktion.

5/6th Nephrektomie Mausmodell, die experimentelle urämischen Kardiomyopathie induziert

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Vorbereitens angereicherten Stomata Schließzellen, die nützlich für physiologische und andere biologische Studien.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

Erfahren Sie ein reproduzierbares Alkaliverbrennungsmodell zur Induktion von Hornhautneovaskularisation bei männlichen C57BL/6J-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung pathologischer Angiogenese und die Evaluation neuer antiangiogener Therapien.

Ein Mausmodell für Hornhautneovaskularisation durch Alkaliverbrennung

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