Name: Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Lernen Sie den Aufbau einer Flusskammer für Zeitraffer-Mikroskopie mit Parafilm und Wärmeversiegelung. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Bildgebung für Neurobiologie-Forschung.

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<ol><li> Konstruieren Sie eine Flusskammer wie im Video gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Parafilm wieder dicht ist und dem Gebrauch gewaschen Deckgläser. </li><li> Inkubieren Aktin-Bindemittel in der Kammer für 5-10 &quot;. </li><li> Block unspezifische Bindungsstellen auf dem Deckglas mit einer hemmenden Proteins. </li><li> Polymerisieren Aktin in der Kammer durch fließendes in G-Aktin-Polymerisation in Puffer. </li><li> Washout polymerisierten Aktin durch fließendes über Puffer. </li></ol>

Überwachung aktin demontage mit zeitraffer-mikroskopie

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Okay, was ich heute zeigen möchte, ist, wie man eine Durchflusskammer, eine Fusionskammer zur Bildgebung an einem aufrechten Mikroskop, konstruiert. Dazu erzeuge ich zwei Bereiche mithilfe von Folie. Dazu nehme ich die Parafolie und schneide sie in kleine Streifen.Danach werde ich im Wesentlichen die Kanäle für die Wände bilden und trockne sie mit schrägem Luftstrom. Ich lege den Deckglaser auf das Para. Hier ist das fertige Präparat. Anschließend erhitze ich es auf einem Heizblock, um das Para zu schmelzen und im Wesentlichen eine Abdichtung zu erzeugen.Das hier ist also das Deckglas, und darauf befinden sich, wie Sie hier sehen, zwei Schichten aus Phim. Darüber liegt erneut ein 22 mal 22 Millimeter großes Deckglas, genau dieses hier, das ich gegen das Param drückte, um die Abdichtung zu erzielen.Okay, die Flüssigkeit wird hier in die eine Richtung eingeführt, und ich kann sie hier mit einem Filterpapier in dieser Richtung abziehen. Ich zeige Ihnen gleich, wie das funktioniert. Was ich gerne mache, ist, es in eine befeuchtete Kammer zu stellen, was sehr einfach ist.Nehmen Sie zwei Arten erhöhter Streifen und legen Sie ein Filterpapier darunter. Und um es geräuschvoll zu halten, le

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mikroskopische Aufnahmen von Live-Endothelzellen exprimieren GFP-Aktin ermöglicht die Charakterisierung der dynamischen Veränderungen in Zytoskelettstrukturen. Im Gegensatz zu Techniken, die fixierten Proben verwenden, bietet diese Methode eine detaillierte Bewertung der zeitlichen Veränderungen in der Aktin-Zytoskelett in den gleichen Zellen vor, während und nach verschiedenen physikalischen, pharmakologischen oder entzündliche Reize.

Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

Mikrotubuli sind Polymere von Natur aus instabil, und deren Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Hier beschreiben wir Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli mit photoablatable stabilisierende Kappen. Depolymerisation von Mikrotubuli segmentiert mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung Analyse der Bewegungen mit den Mikrotubuli-Enden der Demontage.

Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung von ultraschnellen Kraftklemmexperimenten an prozessiven Myosin-5-Motoren vorgestellt, das leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von prozessiven Motoren ausgeweitet werden könnte. Das Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, von der Einrichtung der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zur Datenerfassung und Analyse.

Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Dieser Artikel stellt Protokolle für die Entwicklung und Charakterisierung abstimmbarer dreidimensionaler Verbundnetzwerke aus co-verschränkten Aktinfilamenten und Mikrotubuli vor. Verbundwerkstoffe unterliegen einer aktiven Umstrukturierung und ballistischen Bewegung, die von Myosin II- und Kinesinmotoren angetrieben wird, und werden durch die relativen Konzentrationen von Aktin, Mikrotubuli, Motorproteinen und passiven Vernetzern abgestimmt.

Rekonstitution und Charakterisierung von Aktin-Mikrotubuli-Verbundwerkstoffen mit abstimmbarer motorgetriebener Dynamik und Mechanik

In dieser Arbeit wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Poroelastizität von Aktomyosingelen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Die Dynamik des Aktomyosingels und des eingebetteten Lösungsmittels wird quantifiziert, wodurch die Netzwerkporoelastizität nachgewiesen wird. Wir diskutieren auch die experimentellen Herausforderungen, häufige Fallstricke und die Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Die Mechanik (poro-)elastischer kontraktiler Actomyosin-Netzwerke als Modellsystem des Zellzytoskeletts

Hier stellen wir Methoden zur Herstellung quasi-zweidimensionaler (2D) verschränker, vernetzter und flüssigkristalliner Aktin-Anordnungen aus gereinigten Proteinen vor.

Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

Dieses Protokoll beschreibt einen justierbaren Aktin-Kometenschweif-Bead-Beweglichkeitsassay zur quantitativen Untersuchung, wie die Myosin-Motoraktivität die verzweigte Aktin-Assembly und die Netzwerkarchitektur an einer membranähnlichen Grenzfläche beeinflusst.

Rekonstitution der Myosin-I-vermittelten verzweigten Aktin-Assemblierung in einem Bead-basierten Assay zur Motilität von Aktin-Kometenschweifen

Lernen Sie den Aufbau einer Flusskammer für Zeitraffer-Mikroskopie mit Parafilm und Wärmeversiegelung. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Bildgebung für Neurobiologie-Forschung.

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

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