从MEFs基质胶我的MEFs传代的胚胎干细胞

由于它们在再生医学中的巨大潜力，人们越来越关注人类胚胎干细胞的生物学和作。在本视频中，我们向您展示了如何使用小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞和基质胶上的无饲养层条件，使人胚胎干细胞处于多能状态。您好，我是来自加州大学洛杉矶分校病理学和检验医学系实验室微头衔的 Jinjiang。

今天，我们将向您展示一种在口腔胚胎纤维、血液饲养层细胞和无饲养层条件下在 metri 凝胶上培养人胚胎干细胞的程序。该程序包括制备口腔胚胎成纤维细胞，产生用于在 metri 凝胶上生长的甲基条件培养基，制备 Magel 位置和质量，以便随着时间的推移饲养和培养人 Embry 干细胞。那么让我们开始吧。

为了开始培养程序，将人 emry 样干细胞接种在小鼠胚胎、成纤维细胞或 mes 上，以分裂接种在 mes 上的人胚胎干细胞。我们从汇合的人胚胎干细胞开始，根据特定的胚胎干细胞系，以 1 到 6 到 1 的稀释度进行铺板。这将在分裂后的 5 到 7 天内再次汇合，然后实际分裂细胞 使用 checon 的 0.1% 明胶溶液提前两天准备好的糊化板。

如果您使用的是 6 孔板，请在每个孔中加入两个研磨机，并将其在 37 度 5%CO2 组织培养箱中放置过夜。第二天，将数学盘子放在 Gelatinized 上。如果需要，可以提前三天接种六孔板面罩。

但是，不建议使用超过 3 天的单元格。从液氮中取出一小瓶经辐照或经丝裂霉素 C 处理的 CF OneFS，其中含有 5 至 6 倍 10 到 6 个细胞，并在 37 摄氏度的水浴中解冻 2 分钟。细胞解冻后，在 15 毫升 Falcon 管中用温热的冰毒培养基洗涤一次，总数为 5 至 6 次 10 至 6 个细胞。

可以看到两个或三个 6 孔板，每个板中含有 3 mil 的介质。好吧，确保之后 mes 均匀分布。您可以将板放回培养箱中过夜。

在你要分裂人类胚胎干细胞的那一天。以 1 毫克/密耳浓度制备新鲜的无菌胶原酶 4 溶液。请注意，胶原酶溶液可以在 4 摄氏度下储存，使用时间不超过两周。

从人胚胎干细胞孔中取出所有培养基。您想用两研磨温的 XPDS pH 7.4 分液并观察每个井一次。接下来，加入 1 毫升胶原酶 4 溶液，并在 37 摄氏度下孵育细胞 5 至 10 分钟。

孵育后，向每个孔中加入 1 毫升不含碱性成纤维细胞生长因子或 BFGF 的干细胞培养基，然后只需使用 1 毫升移液器将孔中已有的培养基上下移液，即可将干细胞从孔底部提起每个孔。这大约需要 5 到 10 次重复。然后，将悬浮的人胚胎干细胞转移到 15 毫升的猎鹰管中。

收集细胞后，在室温下以 200 倍 G 离心 5 分钟，使干细胞沉淀。然后在洗涤人胚胎干细胞的同时，用不含 BFGF 的干细胞培养基一次洗涤一个。取出冰毒板。

从孔中取出所有培养基，用无菌温热的 XPBS pH 7.4 洗涤一次。然后加入 2.5 毫升胚胎干细胞培养基。现在每孔补充 10 ng/mil BFGF。

接下来，将沉淀的人胚胎干细胞重悬于适当体积的干细胞培养基中，并补充 10 ng/mil BFGF。重悬体积取决于分流比率。小心地上下移液几次，使悬浮液形成更小的团块，但不要太多，以免出现单个细胞或非常小的菌落。

向冰毒铺板孔中每孔添加 0.5 毫升人胚胎干细胞悬液，以使每个孔的最终体积达到 3 毫升。您可以目视检查以确保干细胞分布均匀，然后将板放回培养箱中过夜，以便在铺板后沉淀。菌落通常需要几天时间才能呈现出其特有的形状和边界外观。