טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

חישוב טיטרים נגיפיים זיהומיים הוא גישה ניסויית בסיסית. עם זאת, השיטה הקלאסית של שימוש במבחני פלאק אינה האמינה ביותר עבור נגיפים שלא היו להם השפעות ציטופתיות, כמו למשל עבור נגיפי קורונה אנושיים. בסרטון זה, אנו מדגימים שיטה חלופית לזיהוי וטיטרציה של וירוס באמצעות טכניקת זיהוי אנטיגן אנזימטית המכונה בדיקת אימונופרוקסידאז.

כאן נראה לך כיצד לאסוף את הדגימות הנגיפיות שלך, להכין את התאים לבדיקה, ולבסוף, את בדיקת הפרוקסידאז החיסוני באמצעות דילול סדרתי כדי לקבוע את הטיטר הנגיפי. היי, שמי ד"ר פייר אלבו, מנהל המעבדה לנוירואימונולוגיה במכון AM RIP בלאוואל, קוויבק, קנדה. היום נדגים כיצד לכמת זנים OT 43 ושני תשע E, שהם זני אב-טיפוס של וירוסים אלה שאינם מייצרים פלאק בתרבית.

אז פיתחנו מבחן כדי לעקוף את הבעיה הזו. זה נקרא בדיקת אימונופרוקסידאז. כדי להדגים את הפרוטוקול הזה, אציג בפניכם, את התלמידה שלי, גבריאל מרול, את הטכנאי שלי פרנסיס נאדר ואת עמיתי למחקר אלן ג'ייקוב.

אז בואו נתחיל. ראשית, אנו רוצים להכין את דגימות הרקמה שלנו. אנו מתחילים בשקילה מוקדמת של הצינורות הסטריליים בהם נשתמש כדי לאסוף כל איבר.

לאחר שנקבע את המשקל של כל שפופרת ריקה, ננתח במהירות את האיברים המעניינים בתנאים סטריליים, ואז נשמור אותם על קרח. חשוב לזכור לשטוף את המכשירים עם 70% אתנול בין כל דיסקציה. לאחר שאספנו את האיברים, אנו קובעים את המשקל של כל דגימה ביולוגית.

לאחר מכן, נהפוך את דגימות הרקמה להומוגניזציה עם PBS סטרילי של 10% עם הומוגנייזר פוליטרון במכסה זרימה למינרית. הפעל את ההומוגנייזר ולאחר מכן הרם והורד את הצינור כדי לשבש את הרקמה. לאחר הומוגניזציה של כל דגימה, יש לשטוף את המכשיר פעם אחת במים סטריליים, פעם אחת עם אתנול 70%, ולבסוף עם PBS לפני עיבוד דגימת הרקמה הבאה.

לאחר שהדגימות הומוגניות, צנטריפוגה את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ב-1000 Gs אוספים את הסופרנטנטים בצינורות סטריליים חדשים. בשלב זה, ניתן לעבד דגימות נגיפיות לזיהוי אימונופרוקסידאז.

אחרת, אתה יכול להקפיא אותם מיד במינוס 80 מעלות צלזיוס ולאחסן אותם עד שאתה מוכן לבדיקות. לאחר מכן, אנו רוצים להכין את דגימות התאים. ישנן שיטות שונות להכנת תאים דבקים ולא דבקים, אך שתיהן כרוכות באיסוף טיטרים נגיפיים תוך-תאיים וחוץ-תאיים.

על מנת לקבוע את הייצור הנגיפי החוץ-תאי בתאים הדבקים, אנו אוספים סופרנטנטים וצינורות סטריליים מהתאים הנגועים, אשר אמורים להיבדק בזמנים המתאימים לאחר ההדבקה. להערכת טיטרים נגיפיים תוך תאיים, אנו רוצים להסיר תחילה את המדיום, לשטוף את התאים ב-PBS חם וסטרילי, ולאחר מכן להוסיף את אותו נפח או נפח ידוע של מדיום, ולבצע שלושה מחזורי הפשרה חופשית במינוס 80 מעלות צלזיוס. זה יכין את התאים וישחרר חלקיקים נגיפיים לתווך.

עבור תאים שאינם נצמדים, אנו מצנטריפוגות תחילה את התאים באלף Gs למשך חמש דקות. אחרי הכדור של התאים, אנו אוספים את הסופרנטנטים בצינורות סטריליים. זה מייצג את החלק החוץ-תאי של הנגיף הזיהומי.

לאחר מכן, אנו משעים את גלולת התא באותו נפח כמו הסופרנטנט שנאסף או בנפח ידוע של מדיום תרבית. כעת אנו מבצעים שלושה מחזורים של הפשרה חופשית במינוס 80 מעלות צלזיוס לתאים ולשחרר חלקיקים נגיפיים במדיום. זה מייצג את החלק התוך תאי של הנגיף הזיהומי.

לאחר ליזה של תאים דבקים או לא דבקים, צנטריפוגה אותם למשך חמש דקות באלף גרם. כעת ניתן לאסוף את הסופרנטנט בצינורות סטריליים חדשים ולנתח טיטרים באמצעות בדיקת אימונופרוקסידאז. שוב, ניתן גם להקפיא את הדגימה מיד במינוס 80 מעלות צלזיוס ולאחסן עד לבדיקה.

על מנת לבדוק את הפרודוקטיביות של זיהום נגיף הקורונה האנושי שלנו בדגימות הביולוגיות שלנו, אנו רוצים להשתמש בבדיקת פרוקסידאז חיסונית על תאים רגישים לנגיף הקורונה. בעבודה עם נגיף קורונה אנושי, 2 29 EL 1 32 תאים משמשים כתאים רגישים ועבור נגיף קורונה אנושי OC 43, קו התאים HRT 18 משמש לאחר יצירת השעיה של תאים רגישים. הם מצופים בצלחת 96 בארות לתרבית רקמות.

אם משתמשים בפיפטה רב-ערוצית, יש להוציא מאה מיקרוליטר לבאר של תרחיף תאים באמצעות ריכוז התאים המתאים. מספר התאים הרגישים לבאר יהיה תלוי בסוג התאים המשמשים ומתי יתבצע חיסון התא. לאחר הציפוי, אנא עיין בפרוטוקול Springer שלנו למידע מפורט יותר.

לפני שמתחילים בבדיקת אימונו-פרוקסידאז, תאים רגישים צריכים להיות נגועים בדגימות שהכנו קודם לכן. כאשר התאים הרגישים הגיעו ל-70 עד 80% שטף, הסר את המדיום מכל צלחת של 96 בארות על ידי עטיפת הצלחת בנייר טישו סטרילי והחלקה בעדינות עם הפנים כלפי מטה על דף נייר סטרילי אחר. לאחר מכן, הוסף לכל באר מאה מיקרוליטר אלפא MEM בתוספת 1% FBS.

יש לבדוק כל דגימה בארבע עמודות סמוכות. באותה צלחת, הכניסו מאה מיקרוליטר לבאר של אליקוטים שיש לבדוק בשורה הראשונה. תאים רגישים בדרך כלל מחוסנים בדילול לוגריתמי סדרתי של הדגימות הנגועות.

לשם כך, הוסף 11 מיקרוליטר לבאר מאותה דגימה שוב בארבע בארות. כעת בשורה השנייה של צלחת 96 הבאר ואז מערבבים עם הפיפטה הרב-ערוצית על ידי פיפטה למעלה ולמטה שלוש פעמים ומעבירים 11 מיקרוליטר מכל באר בשורה השלישית וכן הלאה עד לשורה האחרונה של הצלחת. לאחר שחיסנת את התאים, דגרו את הצלחות בתא לח בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לנגיף הקורונה האנושי.

2290 תאים נגועים מודגרים במשך חמישה ימים ועבור נגיף קורונה אנושי. תאים נגועים ב-OC 43 מודגרים במשך ארבעה. לאחר מכן נוכל להמשיך לזיהוי וירוסים.

לאחר הדגירה, אנו מוכנים לזהות את הנגיף. ראשית אנו מתחילים בהסרת המדיום לחלוטין. אנו עושים זאת על ידי החלקת צלחות על מגבות נייר לא סטריליות במכסה המנוע הלמינר.

לאחר מכן אנו שוטפים בעדינות את התאים על ידי מילוי עדין של בארות ב- PBS. באמצעות פיפטה רב ערוצית. הוצא את ה-PBS מהבארות והסר את כל שאריות ה-PBS על ידי עטיפת כל צלחת בממחטת נייר.

לאחר שטיפת התאים, תרצו לתקן אותם עם מאה אחוז מתנול המכיל 0.3% מי חמצן. מוסיפים את תערובת המתנול לתאים ונותנים לצלחת לשבת במשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה של 30 דקות, הקיבוע מוסר על ידי החלקת צלחות מעל הכיור. שאריות קיבוע מוסרות על ידי הטלתו עם הפנים כלפי מטה על מספר מגבות נייר שהונחו על הספסל.

לאחר מכן הניחו לו להתייבש לחלוטין באוויר, עם הפנים כלפי מעלה למשך כ-15 עד 30 דקות בזמן שהתאים מתייבשים. ניתן להכין תמיסת נוגדנים ספציפית לנגיף בדילול המתאים ב-PBS. לאחר מכן, תוסיף מאה מיקרוליטר של הנוגדן הנגיפי הספציפי לכל באר בצלחות דגירה למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, הסר לחלוטין את המדיום על ידי העפתו מעל הכיור. שוטפים את הצלחת על ידי מילוי הבארות ב- PBS. לאחר מכן העבירו את הצלחת לכיור ושטפו עם PBS.

שוב פעמיים. הסר את כל שאריות ה-PBS על ידי החלקה עם הפנים כלפי מטה על מגבות נייר לא סטריליות המונחות על הספסל. לאחר מכן, הוסף מאה מיקרוליטר לכל באר של נוגדן משני באחד עד 1000.

דילול ב-PBS, דגירה של הצלחת למשך שעתיים ב-37 מעלות ללא CO2 30 דקות לפני סיום הדגירה. הכן את מגיב הזיהוי, שהוא תערובת של DAB עם PBS ומי חמצן 0.01%. שטפו את הצלחת שלוש פעמים ב-PBS כפי שנעשה בעבר.

לאחר שטיפת הצלחת, הוסיפו מאה מיקרוליטר של מגיב מתפתח לכל אחד. יש לדגור היטב במשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר או עד שהבקרה החיובית מוכתמת. על מנת לעצור את התגובה, יש לשטוף את הצלחת פעם אחת במים כפי שנעשה בעבר עם PBS ולמלא כל באר במאה מיקרוליטר מים נטולי יונים.

לבסוף קרא את הלוחות במיקרוסקופ האור כדי לכמת את כל הבארות המציגות תאים מוכתמים. עכשיו, סוף סוף, אנחנו יכולים לקבוע את טיטר הנגיף שלנו. ניתן לחשב זאת באמצעות שיטת המכונית, המשוואה שעבורה תוכלו למצוא בפרוטוקול ספרינגר המלווה את הסרטון הזה.

זה עתה הראינו לך כיצד לטטר נגיפי קורונה אנושיים בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור שאתה עובד עם דגימות המכילות את שני הווירוסים ושאתה צריך לעבוד בתנאים סטריליים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.