C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

안녕하세요, 저는 앨라배마 대학교 생물과학과 콜드웰 연구소의 코디 로크입니다. 저는 Kyle Lee이고 탄수화물 및 PTZ 노출 분석을 위해 웜을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 Bernard Tu이고 탄수화물 분석을 수행하는 방법을 시연해 드리겠습니다.

저는 케일린 베리(Kaylin Berry)이고, 바다 엘레강스(Sea Elegance) 비디오를 담당하고 있습니다. 이 프레젠테이션에서는 이 프레젠테이션에 대해 설명하고 PTZ 노출 분석을 시연할 것입니다. 오늘 저와 제 동료들은 PTZ와 Alde 탄수화물에 노출 된 후 간질의 바다 우아함 모델로 시냅스 전달 돌연변이를 특성화하는 방법을 일련의 대표적인 돌연변이 균주와 함께 보여줄 것입니다.

시작하겠습니다. Kyle Lee는 오늘 시술 첫날에 ALD 탄수화물 분석 준비를 보여주면서 저희를 시작하겠습니다. 각 유전자형과 각 복제물의 최소 30마리의 젊은 성묘기 기생충이 둘째 날에 ALD 탄수화물 분석에 사용할 수 있는지 확인합니다.

실험자가 50마리 이상의 L 4단계 지렁이를 선택하여 대장균 OP 50을 식품 공급원으로 사용하는 신선한 살균제가 없는 NGM 플레이트에 올려놓는 것이 가장 좋습니다. 일관되고 허용 된 온도에서 12-24 시간 동안 벌레를 성장시킵니다. 섭씨 20도에서 22도가 가장 좋지만 섭씨 25도도 허용됩니다.

둘째 날에는 100 밀리 몰의 Al Decarb와 70 % 에탄올의 원료 용액을 만들어 적절한 양의 Al Decarb를 NGM 플레이트에 펴 바릅니다. 우리는 37.5 밀리 몰의 100 밀리 몰 알데 탄수화물을 7.5 밀리리터의 60 밀리미터 비 통풍 페트리 플레이트에 도금하여 0.5 밀리 몰 알 Decarb를 일관되게 사용합니다. 알데 탄수화물 플레이트를 실온에서 약 30-60분 동안 건조시킵니다.

접시가 건조 된 후 뚜껑을 깨뜨릴 필요는 없습니다. 각 알데 탄수화물 플레이트의 중앙에 일정한 양의 대장균을 추가하고 30-60분 동안 더 건조시킵니다. 실온에서 일반적으로 25마이크로리터의 대장균 OP 50을 첨가합니다.

이 OP 50의 부피는 과밀하지 않고 접시 중앙의 작은 지점에 벌레를 보관할 수 있는 충분한 크기의 식품 잔디밭을 만듭니다. 식품 잔디가 마르면 알바 탄수화물 분석을 진행하십시오. ALD 탄수화물 분석의 주관적인 특성으로 인해 실험은 맹목적으로 수행하는 것이 좋습니다.

이 작업을 수행합니다. 1차 실험자의 동료가 분석할 웜이 포함된 원래 플레이트에 라벨을 다시 붙이거나, 동료가 타이머를 시작하기 직전에 원래 플레이트의 웜을 사이퍼 알데 탄수화물 플레이트로 옮길 수 있습니다. 이제 플레이트가 사이닝되었으므로 붕소 ABO는 분석을 진행하여 분석을 시작하고 마비된 벌레의 수를 계산합니다.

급성 al decarb 유발 마비를 정의하는 두 가지 주요 접근 방식이 있습니다. 첫 번째 접근법은 인두 펌프의 중단으로 마비를 정의합니다. 이 비디오 노트에서는 화면 오른쪽에 있는 벌레 인두의 내강 내에 위치한 어두운 구조입니다.

이 구조를 그라인더라고 하며 콜린 메커니즘을 통해 리드미컬하게 수축합니다. 이 비디오에서 벌레의 운동은 Al Decarb 노출로 인해 크게 느려졌습니다. 그러나 이 벌레의 인두 분쇄기는 여전히 분명히 움직이고 있습니다.

따라서 이 웜은 펌핑 정의의 중단으로 인해 마비되지 않습니다. 이 비디오에서 화면 오른쪽에 위치한 인두 그라인더가 al Decarb 유도 마비에 대한 작업 정의로 펌핑 중단과 수축하지 않는다는 것을 볼 수 있습니다. 이 웜은 마비된 것으로 점수를 매겨야 합니다.

그러나 이전 비디오의 벌레와 마찬가지로 이 벌레는 좌우로 약간의 먹이 이동 움직임을 보이고 있습니다. Al Decarb에 의해 운동이 손상되었음에도 불구하고, 이러한 움직임은 실험자가 Al Decarb에 의한 마비, 전신 부동성 및 촉각에 대한 무반응으로 인한 두 번째 접근 방식에 의해 이 벌레가 마비된 것으로 간주하는 것을 방지할 수 있습니다. 알 탈탄수화물 유발 마비를 정의하는 두 번째 접근 방식은 백금 와이어로 각 벌레를 지속적으로 찌르고 반응을 확인하는 것입니다.

육안으로 몸의 움직임을 감지할 수 없는 경우, 우리가 선호하는 접근 방식은 30분마다 총 3시간 동안 머리에 두 번, 꼬리에 두 번씩 벌레를 찌르는 것입니다. 보시다시피 이 비디오의 벌레는 분명히 몸을 움직이지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 이 벌레는 꼬리를 명확하게 움직여서 찌르기에 반응하기 때문에 우리는 이 벌레를 마비되었다고 부르지 않습니다.

al decarb의 두 번째 정의에 의해 마비가 유발되었습니다. 이전 비디오의 웜과 마찬가지로 이 웜은 분명히 몸을 움직이지 않으므로 찌르기 테스트가 필요합니다. 그러나 이전 비디오의 웜과 달리 이 웜은 찌르기에 명확하게 반응하지 않습니다.

그러므로, 이 벌레는 al decarb 유도 마비의 두 번째 정의에 의해 마비됩니다. 알데 탄수화물에 의해 마비된 것과 마비되지 않은 것의 차이는 미묘할 수 있지만, 실험자는 Al Decarb 플레이트에 선택된 직후 Al Decarb에 노출된 많은 수의 대표적인 벌레를 관찰하는 것만으로도 상당한 변화와 시냅스 전달을 식별할 수 있어야 합니다. 야생형 벌레는 여전히 움직일 수 있습니다.

이 비디오에서. Al Decarb에 노출된 지 1시간 후에 이전 비디오와 동일한 야생형 벌레를 볼 수 있습니다. 지렁이는 어느 정도 느려지고 있지만 여전히 분명히 움직이고 있습니다.

야생형 웜과 달리, 이 영상에 등장하는 토마시 원 돌연변이는 1시간 동안 노출된 후 완전히 움직이지 못하거나 거의 움직이지 않습니다. 이 결과는 신경근 접합부에서 신경 전달 물질 방출을 음성으로 조절할 수 없음으로 인한 과도한 아세틸콜린 분비를 갖는 토마신 1 돌연변이체와 일치하며, 신경근 접합부에서 과도한 아세틸콜린 및 시냅스 갈라짐은 아세틸콜린 분해 억제와 결합되며, Bial Decarb는 토마신 1 돌연변이를 과민하게 만들지만, 여기에 나타나지는 않았지만, 유사한 결과가 on 43의 기능 상실을 동반한 알데 탄수화물 분석에서 발생하는 것으로 가정되었습니다. 칼슘 cal Moulin 의존성 단백질 키나아제 2의 C 우아함 ortho log를 암호화합니다. 이 비디오는 억제성 GABAergic 전달이 결핍된 25개의 돌연변이를 보여줍니다.

토마신 1 및 M 43 돌연변이와 유사한 알데 탄수화물에 1시간 노출된 후, 이 돌연변이는 상당한 알데 탄수화물 유발 운동 e 장애를 보이며 동일한 시간 동안 알 데카브에 노출된 야생형 벌레보다 더 영향을 받는 것으로 보입니다. 이 결과는 M 25 돌연변이가 al Decarb 노출과 GABAergic 전달 감소의 조합으로 인해 체벽 근육을 과도하게 자극하여 CL EL 신경근 접합부에서 흥분성 대 억제성 전달 비율이 더 커지고 그에 따른 마비가 발생하는 것과 일치합니다. 그러나 43 및 25 돌연변이의 토마신 1은 이 시점에서 Al Decarb와 유사한 민감성을 나타내기 때문입니다.

체벽 근육의 과도한 자극에 대한 다양한 원인이 있음에도 불구하고, 실험자는 원인 돌연변이의 정체를 먼저 알지 않고는 과민성의 기본 메커니즘을 알 수 없었습니다. 이 비디오의 경우, ALD 탄수화물 분석의 이 말단 지점에서 al Decarb에 3시간 노출된 후 이전 비디오와 동일한 야생형 웜으로 돌아갔으며, 이 웜이 야생형임에도 불구하고 완전히 움직이지 않거나 거의 움직이지 않는다는 것을 분명히 알 수 있습니다. 이 웜은 이제 알데 탄수화물 노출 후 1시간 후에 나타난 TOM 1 및 M 25 돌연변이와 표현형적으로 유사하며, 아마도 흥분성 콜린성 전염이 야생형 웜과 달리 비슷한 수준에 도달했기 때문일 수 있으며, 시냅 브렌 1 돌연변이는 알데 탄수화물에 노출된 지 3시간이 되어도 상당히 이동성을 유지합니다.

이 결과는 Synaptive Bren one 돌연변이와 일치하며, 이 돌연변이는 현재 동일한 수준의 알데 탄수화물에 노출된 후 나무 야생형 벌레보다 체벽 근육에서 콜린성 자극이 적고 정상적인 수준의 신경전달물질 분비가 부족합니다. 특히 콜린성 전염이 결핍된 4개의 돌연변이에 대한 포인트는 Synaptive Bren 1 돌연변이와 마찬가지로 Al Decarb와 유사한 민감도를 가져야 합니다. 반대로, 토마시 1과 O 25 과민 돌연변이는 야생형 웜과 다르지 않게 마비 상태를 유지한다.

일부 벌레, 특히 Al Decarb에 내성이 있는 벌레는 접시에서 기어 나오려고 시도할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이 경우, 실험자는 지렁이 운동에 대한 물리적 장벽인 팔미트산을 일정량으로 퍼뜨릴 수 있습니다. Al Decarb 플레이트 주변에는 에탄올 1밀리리터당 10밀리그램의 팔미트산 25마이크로리터를 퍼뜨립니다.

이것으로 Al Decarb 노출 패러다임이 완성되었습니다. 이제 Penta Lean Terazol 노출 패러다임을 시연하겠습니다. Kaylin Berry가 PTZ 분석을 도와줄 것입니다.

PTZ 분석을 위한 웜 준비는 기본적으로 알데 탄수화물 분석을 위한 웜 준비와 동일합니다. 두 분석 간의 유일한 중요한 차이점은 다음과 같습니다. 우리는 70%ethanol 대신에 PTZ 용매로 DDH 2 O를 이용합니다.

또한 ALDE 탄수화물보다 더 많은 양의 PTZ를 플레이트링하는 경우가 많기 때문에 OP 50을 추가하기 전에 플레이트를 최소 1시간 동안 건조시킵니다. 팔미트산은 PTZ와 함께 사용할 수도 있습니다. 또한 PTZ는 알데 탄수화물보다 훨씬 덜 안정적이며 섭씨 영하 20도에서 보관해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

분석을 시작하려면 총 1시간 동안 30분마다 간질성 경련 벌레의 수를 세십시오. 전신 경련, 전방 경련(머리 밥이라고 부르는 전방 경련과 체벽 근육 마비의 조합이라고 함)과 같은 별도의 범주에서 다양한 유형의 경련을 가진 벌레의 수를 점수를 매기는 것이 가장 좋습니다. 이를 강장제-간대성 또는 전신 마비(토닉 토닉이라고 함). 오른쪽에 있는 기생충에서 볼 수 있는 발작과 같은 활동은 종종 왼쪽에 있는 기생충에서 볼 수 있는 강장제-간대성 경련을 뒤따릅니다.

발작과 같은 활동은 단순히 반복적인 강장제-간대성 경련에 따른 근육 피로로 인해 발생할 수 있습니다. 그러나 우리의 미발표 데이터에 따르면 일부 웜은 이전에 강장제 클론 상태가 아니었지만 알 데카브 유도 마비와 유사한 방식으로 PTZ에서 강장제가 될 수 있습니다. 여기에서는 발작 및 간질의 다양한 동물 모델에서 PTZA, GABA 수용체 길항제 및 일반 발작 유도제가 없는 상태에서 크롤링하는 대표적인 시냅스 전달 돌연변이 벌레를 보여줍니다.

벌레의 끝이나 코는 먹이를 찾는 동안 좌우로 흔들리고 있습니다. 이 비디오에서는 이전 비디오에서 사용된 것과 동일한 시냅스 전달 돌연변이 균주의 또 다른 웜을 보여줍니다. 물 1밀리리터당 2.5밀리그램의 PTZ가 있는 이 벌레는 대부분 먹이를 찾는 동안 머리를 좌우로 계속 움직입니다.

그러나 이 벌레는 때때로 좌우로 먹이를 찾는 것을 멈추고 대신 반복적으로 앞쪽을 앞으로 내민다. 마지막으로, 이전 두 비디오의 벌레와 동일한 돌연변이를 가진 벌레가 물 1밀리리터당 10밀리그램의 PTZ가 있는 것을 볼 수 있어야 합니다. 이 벌레는 좌우 먹이 찾기가 줄어들었고 PTZ의 농도가 낮을 때보다 더 큰 빈도와 강도로 앞쪽을 앞으로 밀어내고 있습니다.

이러한 결과는 모든 PTZ에 민감한 시냅스 전달 돌연변이에서 관찰되는 PTZ의 용량 의존성을 보여줍니다. 중요한 것은 PTZ에 대한 노출이 야생형 기생충에서 경련과 같은 간질을 유발하기에 충분하지 않다는 것입니다. 마찬가지로, 우리는 4와 같이 콜린성 전염에 특이적 결핍이 있는 벌레 또는 토마신 1과 같은 과도한 콜린성 전염을 가진 벌레에서 경련과 같은 PTZ 유도 간질을 시도했지만 관찰되지 않았습니다.

그러므로, PTZ에 대한 상대적 민감도를 기반으로 일반적인 시냅스 기능의 결핍 또는 콜린성 전염의 특정 결핍으로부터 알데 탄수화물 저항성을 가진 시냅스 전달 돌연변이를 추가로 특성화하는 것이 가능해야 합니다. 어쩌면 놀랍게도, 기능 ONC 25 돌연변이의 강력한 감소, C 우아함에서 검출 가능한 GABA 발현이 부족합니다. 억제성 운동 뉴런은 이 비디오에서 볼 수 있는 것처럼 자발적인 간질성 가벼운 경련을 나타내지 않습니다.

물 1밀리리터당 10밀리그램의 PTZ를 사용하는 ONC 25 돌연변이. 그러나, 강력한 강장제-간대성 경련을 나타내지는 않지만, ONC 25 관련 강장-간대성 경련에 선행하는 약간의 움직임과 함께 전방에만 경련이 나타나지는 않았으며 시냅 브렌 1 돌연변이의 경련을 모방했습니다. 그러므로, 실험자는 모든 억제성 GABA 돌연변이가 PTZ가 있는 상태에서 강장제-간대성 경련 또는 밀접하게 연관된 긴장성 발작과 같은 활성을 나타낼 것이라고 가정해서는 안 되며, 특히 저형성 돌연변이 대립유전자를 얻을 가능성을 고려해서는 안 됩니다.

이제 우리는 억제성 GABA 돌연변이에 의해 알데 탄수화물과 PTZ에 대한 과민성을 입증했지만, 콜린성 전염의 음성 조절이 결여된 돌연변이에 의한 알데 탄수화물과 PTZ에 대한 정상적인 민감성만 입증되었습니다. UNC 43 기능 상실 돌연변이는 PTZ에서 어떻게 보이는지 궁금할 수 있습니다. 43 돌연변이의 다른 시냅스 전달 돌연변이와 마찬가지로 Alda 탄수화물에 과민하기 때문에 PTZ가 없을 때 경련과 같은 명백한 간질을 나타내지 않지만, 이러한 돌연변이는 드물게 비반복적이지만 여전히 자발적인 전신 수축을 가지고 있지만 43에서 물 1밀리리터당 PTZ에 노출된 후에도 여전히 자발적입니다. 기능 상실 돌연변이가 존재하고, 견고하고, 반복적이며, 용량 의존적 전신 경련이 있습니다. 현재로서는 이러한 결과가 모호하지만, ON 43이 GABAergic 전달을 억제하는 특정 역할을 하거나 신경전달물질 방출을 부정적 조절하는 역할만 해서는 안 된다는 것을 시사하는 것으로 보인다.

C 엘레강스 신경계에서 우리는 방금 CL 엘간 시냅스 전달 돌연변이를 상보 신경 자극제, 알데 탄수화물, 콜린에스테라제 억제제 및 PTZA GABA 수용체 길항제로 특성화하는 방법을 보여주었습니다. 보완적인 약리학적 패러다임을 따를 때, 하나의 신경 자극제에 대한 민감도의 정도가 다른 신경 자극제에 대한 민감도의 정도를 예측할 수 없다는 것을 기억하십시오.알데 탄수화물 분석의 활용은 PTZ에서 Bob을 이끌지만 Alde 탄수화물에 과민한 억제성 GABA 돌연변이와 일반적인 시냅스 기능 결핍 돌연변이를 구별하는 데 도움이 됩니다. 또한 PTZ에서 Bob을 향하지만 alde 탄수화물에 내성이 있습니다. 또한, 억제성 GABA 돌연변이는 PTZ에서 Bob을 향하는 반면, 콜린성 전염에 대한 음성 조절이 없는 웜은 PTZ에서 야생형으로 나타난다는 것을 깨달아야 합니다.

따라서 PTZ 분석은 Alde 탄수화물에 과민한 이러한 종류의 시냅스 전달 돌연변이를 구별하는 데에도 사용될 수 있습니다. 요약하면, PTZ 및 Alde 탄수화물 분석을 통한 보완적 접근 방식을 통해 실험자는 두 약물 단독으로는 불가능한 방식으로 C의 우아한 시냅스 전달 돌연변이를 특성화할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.