Name: תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות P0 יילוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למד שיטה לבידוד וגידול נוירונים היפוקמפליים ראשוניים מחולדות P0 יילוד בתנאי תרבית נטולי סרום. גלה כיצד לחקור תפקוד נוירונלי ופיזיולוגיה תאית במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JLN נתמכה על ידי MH 68347.

לפני בידוד בהיפוקמפוס לפני תחילת הבידוד בהיפוקמפוס, לוודא שכל הכלים הם עקרים. תרסיס את מכסה המנוע תרבות עם אתנול 70%, ואת המקום כלים בתוך מכסה המנוע. יהיה עליך 6 - ו 10 ס&quot;מ צלחות פטרי, סטרילי poly-L coverslips זכוכית מצופה, pipettors וטיפים, טפטפות חד פעמיות, וכן pipettor חשמלי. מנקודה זו והלאה, לזכור להשתמש בטכניקה סטרילית הנכון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את האמבטיה במים ולוודא כי הוא מחומם עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרונות הבאים המאוחסנים ב 4 ° C, יהיה צורך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתנה הנשר של בינוני (ממ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurobasal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של שנאגרו מלוחים פתרון (HBSS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Borate פתרון חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pyruvate נתרן פתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון סטרילי גלוקוז פתרון של 20% מים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפידו לרסס את כל הבקבוקים למטה עם אתנול 70% לפני הכנסתם למכסה המנוע. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את אלה פתרונות קפוא מהמקפיא ומניחים אותם באמבט מים חמים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 5 מ&quot;ל של סרום סוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל aliquot של תוסף B-27 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל aliquot של אנטיביוטיקה 100x (הפניצילין בתוספת סטרפטומיצין) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וגם 0.5 מ&quot;ל aliquot של גלוטמין-L </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי פתרונות יש להפשיר, לקחת אותם מתוך האמבטיה מים, ריסוס אותם עם 70% אתנול, ולמקם אותם בשכונה. כעת בינוני ציפוי Neurobasal יכול להיות מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי פתרונות מוכנים, כובע מכולות בחוזקה ומניחים אותם על 37 ° C אמבטיה להתחמם בעת ביצוע הבידוד בהיפוקמפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, לקחת aliquot של טריפסין פרוטאז (2.5%) מן המקפיא ומניחים אותו באמבט מים. טריפסין יהיה לעכל את ההיפוקמפוס גזור, אשר יהיה מבודד לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו צינור חרוטי 15 מ&quot;ל, למלא אותו HBSS, ותווית עם בקבוצת הטיפול. זה המקום שבו מבודדים hippocampi ייאספו בשלב הבא. </li></ol> בהיפוקמפוס בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הבידוד בהיפוקמפוס, ודא לגורים שזה עתה נולדו נקיים היו להקות חלב שלהם, השליות, ואת חבלי הטבור הוסר על ידי אמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הגורים בצלחת פטרי, תרסיס עם אתנול 70% לנקות, ולמקם אותם בשכונה. בעלי חיים מומתים מיד לפני culturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עיקור נוסף לקחת אחד הגור מצלחת, לטבול את הגור לתוך אתנול 70%, ולאחר מכן לשתי שוטף של HBSS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש מן הגוף במספריים. בעזרת מספריים אותו, חותכים דרך העור את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה בסדר, קליפת הגולגולת מן המוח במקום את המוח לתוך צלחת פטרי קטנה המכילה כמות קטנה של HBSS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל האחורי אונות המוח. ההיפוקמפוס הוא קטן, סוסון ים בצורת מבנה באונה הרקתית המדיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ההיפוקמפוס מקום לתוך מ&quot;ל 3 של HBSS בצינור 15 מ&quot;ל. חזור על שלבים אלה עם כל הגור, והמקום כל ההיפוקמפוס מבודדים לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. עכשיו, הגיע הזמן לנתק את רקמות תאים בודדים. </li></ol> תאים בהיפוקמפוס דיסוציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל hippocampi להיות מבודדים, למלא את שפופרת 15 מ&quot;ל עד 4.5 מ&quot;ל עם HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את טריפסין מהאמבטיה מים, ריסוס עם אתנול, ומניחים מכסה המנוע. הוסף 0.5 מ&quot;ל של טריפסין אל הצינור, דגירה במשך 15 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע, הסר את הפתרון HBSS / טריפסין מהצינור עם פיפטה סטרילית, נזהר לא להפריע hippocampi כי התיישבו אל החלק התחתון של הצינור. הוסף 5 מ&quot;ל של HBSS אל הצינור מערבולת בעדינות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו פעמיים, הסרת HBSS הישן ולהחליף עם פתרון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של DNAse אני מהמקפיא. הוסף 0.5 מ&quot;ל של DNase את hippocampi ב 4.5 HBSS מ&quot;ל. DNAse מתווספת לקדם איון האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate הפתרון (או פיפטה למעלה ולמטה) עד שהיא הומוגנית. היזהר לא להכניס בועות לתוך homogenate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת כדאיות התא עם שיטת הרחקה trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 10 ס&quot;מ צלחת פטרי המכילה 6-8 coverslips, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום ציפוי. פיפטה את המספר הרצוי של תאים תבשיל המכיל את coverslips. מערבולת בעדינות כדי לפזר את התאים, ולוודא coverslips אינם חופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לצרף עבור 2-4 שעות humidified 37 ° C חממה עם 5% CO 2. לאחר אישור התאים קיימא יש המצורפת, העברת coverslips למנות אדם המכיל בינוני Neurobasal. מניחים את הכלים האלה לתוך החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם בשבוע, להחליף שליש בינוני עם בינוני Neurobasal טריים טיפולים ניסיוניים, לפי הצורך. עכשיו, את המאפיינים תפקודית של תאים אלה בתרבות מוכנים להיחקר. </li></ol> Fura-2 סידן הדמיה של נוירונים בהיפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי כבר במבחנה במשך 48 שעות (אך לא קודם לכן), הדמיה ניסויים סידן יכולה להתחיל. בשלב הזה, הנוירונים האלה צריך להתחיל להרחיב את התהליכים. טווח הגיל האופטימלי עבור הדמיה סידן מיום במבחנה 3-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות טען עם Fura, 02:00 במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לאחר שהם ניתן הדמיה תחת המטרה 20X באמצעות מנורת קשת קסנון לרגש מחוון סידן צבע ומצלמה CCD 512 ביט, אשר דגימות כל 150ms. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).</li>
</ol>

פרוטוקול זה פותח כשינוי העבודה הזרע של גארי בנקאי וקים Goslin 1. ספר זה הוא משאב חיוני עבור מי שמעוניין תאים culturing - לא רק נוירון מועשר תרבויות המתואר בפרוטוקול הנוכחי. שלושת הגורמים הקריטיים ביותר culturing התא הם: עקרות מהירות, הבחירה של שימוש בינוני. עקרות - זרימה למינרית / ברדס סטרילי, תנאי aseptic, וכן חממה סטרילי נדרשים. זיהום בשלב כלשהו הוא מזיק לא רק בניסוי הנוכחי אתה...

<table><tbody><tr><td>אנטיביוטיקה אנטימיטוטית</td><td>Invitrogen</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>נטול סרום</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM חודר תאים</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>51200038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>12348017</td><td>ללא פנול אדום</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פירובית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טטרaborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, 2.5% (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות p0 יילוד

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

המאפיינים הפיזיולוגיים של נוירונים בהיפוקמפוס נחקרות כלל, בעיקר בגלל מעורבותו של ההיפוקמפוס בלמידה ובזיכרון. תא ראשי culturing בהיפוקמפוס מאפשר מדעני מוח כדי לבחון את פעילות ומאפיינים של הנוירונים בתא הבודד וברמת סינפסה אחת. בסרטון זה נדגים כיצד לבודד ולגדל תאים בהיפוקמפוס של חולדות ראשוני לרך הנולד. ההיפוקמפוס עשוי להיות מבודד כל חיה הנולד בקיצור כמו 2 עד 3 דקות, ואת התרבויות יכול להישמר לתקופה של עד שבועיים. אנו גם בקצרה להדגים כיצד להשתמש אלה נוירונים בהיפוקמפוס הדמיה סידן ratiometric. בעוד פרוטוקול זה מתאר את התהליך עבור בהיפוקמפוס, עם קצת שינוי לא, זה יכול להיות מיושם על אזורים אחרים של המוח.

דיסקציה וצמיחה של תאים מאזור המוח הפרט מאפשר חקירה של פרמטרים פיזיולוגיים הסלולר. אנו מתארים שיטה culturing התא הראשוני שמייצר נוירון מועשר תרבויות בסביבה בסרום חופשי.

תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות P0 יילוד

התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים בהיפוקמפוס נחקרות רבות, במיוחד בשל מעורבותו של ההיפוקמפוס בלמידה ו...

0, 0, 0 0. פרוצדורה זו מתחילה בבידוד ההיפוקמפוס מעכברי P0 ניו born. בכל מוח ישנם שניים ממבנים אלו, אחד בכל אונה טמפורלית מדיאלית.מספר אזורי היפוקמפוס של היפופוטמוס נאספים לפרועת 15 מיליליטר ומורגשים עם trypsin למצב של תרחיף תאים בודדים. ספירת התאים והחיוניות נקבעות באמצעות המוציטומטר ושיטת הדחייה של tripan blue. הנוירונים ההיפוקמפליים הראשוניים נזרעים לאחר מכן על כיסויי זכוכית בודדים בתוך צלחת פטרי.שלום, שמי ג'וזף נונייז. אני חבר סגל בתוכנית למדעי העצבים באוניברסיטת מישיגן סטייט. היום אדגים פרוטוקול טיפוסי לתרבית היפוקמפוס.לפני שנתחיל בבידוד ההיפוקמפוס, עלינו לוודא שכל הכלים סטריליים. רססו את מנדף התרביות ב-70% ethanol והניחו את הכלים בתוך המנדף. תזדקקו לצלחות פטרי בקטרים של 6 ו-10 סנטימטרים.לוחיות כיסוי מזכוכית מצופות poly, L סטריליות, פיפטות וטיפים, פיפטות חד-פעמיות ופיפטור חשמלי. מהשלב הזה ואילך, זכרו להשתמש בטכניקה סטרילית נכונה, הדליקו את אמבט המים וודאו שהיא מחוממת ל-37 °C. נזדקק גם לתמיסות הבאות המאוחסנות ב-4 °C: מצע modified eagles medium, או MEM neuro basal, תמיסת hank's buffered saline, תמיסת bore buffer, תמיסת sodium pyruvate ותמיסת glucose בריכוז 20% מסוננת בסטריליות במים מזוקקים.הוציאו את התמיסות הקפואות הללו מהמקפיא והניחו אותן במקלחית. אליקוויטה של 5 mL של סרום סוס.

primary-culture-of-hippocampal-neurons-from-p0-newborn-rats

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מספקים פרוטוקול תרבות מטוהרים מאוד נוירונים בהיפוקמפוס של המוח עכבר טרום לידתי ללא שימוש שכבת תא גלייה מזין.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

הסרטון מדגים שיטה לגידול תאי עצב מהיפוקמפי. בתחילה, ההיפוקמפוס עובר עיכול אנזימטי כדי לפרק את מטריצת הרקמה החוץ תאית. לאחר מכן, הרקמה המעוכלת משובשת מכנית כדי לבודד נוירונים בודדים. לבסוף, תאי עצב אלה מגודלים בתרבית על תאי הזנת גלייה.

טכניקה לתרבית תאי עצב בהיפוקמפוס עכבר

מקור: Calvo-Rodríguez,  et al. דימות פלואורסצנטי וביו-לומינסנציה של Ca תת-תאי2+ בנוירונים היפוקמפוס מזדקנים. J. Vis. exp.} (2015).  סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיה פלואורסצנטית למדידת רמות סידן ציטוזולי בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך. על ידי השוואה בין נוירונים צעירים ומבוגרים, הוא מדגיש כיצד צפיפות מוגברת של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג L והפעלה ממושכת בתאי עצב מזדקנים גורמים לעומס יתר של סידן, סימן היכר של הזדקנות עצבית. אינדיקטורים לסידן פלואורסצנטי חושפים את ההבדלים הללו באמצעות...

הדמיית סידן במבחנה בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

תרביות בצפיפות נמוכה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס דורשות בדרך כלל שכבת הזנה גליה כדי לספק גורמים נוירוטרופיים ולשמור על אריכות ימים. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לתרבית נוירונים בצפיפות נמוכה במיוחד על כיסויי זכוכית בנוכחות שכבת הזנה עצבית בצפיפות גבוהה, המאפשרת חקירה של מנגנונים עצביים-אוטונומיים ספציפיים.

שיטה פשוטה עבור צפיפות Ultra-Low, לטווח ארוך ראשית בהיפוקמפוס Neuron תרבות

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים בצפיפות נמוכה גדלו על coverslips הזכוכית הפוך מעל בשכבת גליה. שכבות הנוירון גליה מופרדות חרוזי פראפין. הנוירונים גדלו על ידי שיטה זו מתאימים הדמיה אופטית מבחנים תפקודיים ברזולוציה גבוהה.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

כאן, תיארנו פרוטוקול כדי לחקור כמותית את ההרכבה והמבנה של קטעים ראשוניים אקסון (AIS) של נוירונים היפוקמפוס חסר AIS מורכב מראש בשל היעדר ankyrin-G ענק.

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון

מלאי קפוא מוכן לשימוש של נוירונים הוא כלי רב עוצמה להערכת תפקודים סינפטיים. כאן, אנו מציגים תרבית ראשונית קלה בצפיפות נמוכה ממלאי קפוא באמצעות צלחת של 96 בארות.

תרבית ראשונית קלה וניתנת לשחזור בצפיפות נמוכה באמצעות מלאי קפוא של נוירונים עובריים בהיפוקמפוס

למד שיטה לבידוד וגידול נוירונים היפוקמפליים ראשוניים מחולדות P0 יילוד בתנאי תרבית נטולי סרום. גלה כיצד לחקור תפקוד נוירונלי ופיזיולוגיה תאית במעבדה.

תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות P0 יילוד

גלה סרטונים נוספים