Name: 조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: 배우세요 조기 칙 태아에서 2색 전체 마운트 현장 하이브리드화 기법을 통한 유전자 발현 시각화 방법을. 고정, 메탄올, 프로테이나제 K 처리 및 특이적 프로브 인큐베이션 단계를 포함하여 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.

1 부 : 배아를 고정 <ol><li> 얼음 추위 depc - PBS로 해부 접시를 채우십시오. 얼음 계속. 포셉로 껍질을 감청하여 계란을 열고 조개 조각을 제거합니다. </li><li> 포셉과 알부민 두꺼운 제거합니다. 그 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉과 난황을 기울이기. </li><li> 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. </li><li> 숟가락 사용, 얼음 추위 depc - PBS에 노른자와 장소에서 배아를 제거합니다. </li><li> 현미경, 세포막과 노른자를 제거하고 고정 요리로 전송할 수 있습니다. </li><li> 아래로 핀 depc - PBS를 제거합니다. depc - PBS에서 4% PFA로 교체하고 4 O / N를 수정 ° C. </li><li> 정착액 제거합니다. 얼음 추위 depc - PBS로 바꿉니다. 뭉툭한 끝 microcapillary 바늘이나 microdissection 나이프를 이용하여 프로브의 트래핑을 방지하기 위해, 신경계와 심장 충치 구멍. </li><li> 0.1 % 트윈 - 20 (PBT)를 2 배 10 MN depc - PBS 씻으십시오. 25 %, 50 %, PBT의 75 % 메탄올의 각 10 MN을 탈수. 100 % 메탄올 두 번 배아를 탈수. 메탄올에서 -20 ° C에 보관하십시오. </li></ol> 2 부 : Prehybridization <ol><li> 75 % 50 % PBT의 25 % 메탄올의 각 배아 10 MN을 Rehydrate. PBT에서 배 10 MN 씻으십시오. </li><li> 한편, 얼음 차가운 정착액 (PBT의 4 % paraformaldehyde)을 준비합니다. proteinase K 용액 (; [? 5g / ML] 마지막 PBT 3 ML / 유리병)와 PBT를 교체하십시오. 전체 유리병이 부드럽게 병을 회전하여 proteinase K 용액에 노출 있는지 확인합니다, 노출 시간에 대한 문제 해결을 참조하십시오. </li><li> RNase 무료 파스퇴르 피펫 제거 proteinase K를 사용하고 정착액 (2 ML)을 추가합니다. 즉시 정확히 20 MN을 위해 얼음에 놓으십시오. </li><li> 모든 RT의 세척은 nutator에서 수행됩니다. 2X PBT 10 미네소타, 그리고 50 %의 하이브리드화 버퍼를 포함하는 PBT에서 1X 10mn 씻으십시오. </li><li> 하이브 리다이 제이션 버퍼 1X 씻으십시오. 65 품어 ° 4-5 시간 2 ML의 하이브리드화 버퍼에 C. </li></ol> 파트 3 : 탐사선과 잡종 배아 <ol><li> 파고 및 FITC 결합 프로브 합성은 부록에 설명되어 있습니다. 강한 신호를 줄 것으로 예상 프로브, FITC 함유 세포핵과 synhesized되어야하며 약한 프로브 발굴 함유 세포핵과 함께 합성한다. </li><li> 2 ML의 약병을 사용하여 하이브 리다이 제이션 버퍼 Prewarm 프로브 (500 NG / ML 각). 즉시 프로브 솔루션 하이브 리다이 제이션 버퍼를 교체하십시오. 배아는 건조시키지 마십시오. 65 16 시간을위한 품어 ° C. </li><li> 하이브리드화 버퍼, 2 세척, 30 MN 65 ° C.와 각각의 프로브를 교체 65 (1 / 1 V / V /) 하이브리드화 버퍼 / MABT 15 MN 와시 ° C. </li></ol> 4 부 : 발굴 항체 보육 및 색상 반응 <ol><li> MABT에서 2x20 MN 씻으십시오. 2퍼센트 BBR / MABT 1 시간 씻으십시오. 2퍼센트에 5 시간을 씻어 BBR/20 % 히스 / MABT (버퍼를 차단). 차단 버퍼 희석 1:2000 파다 항체에 품어, 4 O / N ° nutator에 C. </li><li> MABT에서 배 10 미네소타 각각하고, 배 1 시간 MABT 각 씻으십시오. </li><li> NTMT에서 배 20 MN 씻으십시오. 10 ML의 NTMT에 200ul의 NBT / BCIP 기판을 추가합니다. 즉시 병을에서 NTMT를 제거하고 1-2 ML NBT / BCIP 버퍼로 바꿉니다. 어둠 속에 넣습니다. 20 MN 후 색상 반응을 모니터링, 20 MN의 간격으로 그 이후. </li><li> 색상 반응 (블루 나타납니다)에 따라, 10 MN을 위해 PBS에 세척 PBS로 가득 고정 접시에 아래 핀, 및 PBS의 4% PFA와 솔루션을 바꿉니다. 4 O / N ° C를 수정 </li><li> 새로운 섬광 유리병에 전송. 2x10 MN (1 % 트윈 - 20와 함께 PBS) PBST로 씻으십시오. MABT 2X 10 MN에 씻으십시오. </li><li> 63 ° C.에 MABT 30 MN의 부화 </li></ol> 제 5 부 : FITC 항체 보육 및 색상 반응 <ol><li> MABT에서 배 10 미네소타, 2 %에 1 시간을 씻어 BBR / MABT, 차단 버퍼에 5 시간 </li><li> 알칼리성 인산 가수 분해 효소 - 결합 백신 FITC - 항체 (1:500) 4 O / N ° C.에 품어 </li><li> MABT에서 배 10 미네소타 각각하고, 배 1 시간 MABT 각 씻으십시오. </li><li> 0.1 % 트윈 - 20 (TBST)으로 TBS 산도 8.45에서 배 20 MN에 씻으십시오. </li><li> TBST이 키트에서 제공하는 시약 1,2와 3를 사용하여 벡터 레드 작업 솔루션 (5 ML)를 준비합니다. 즉시 병을에서 TBST를 제거하고 벡터 레드 버퍼로 바꿉니다. 어둠 속에 넣습니다. 40 MN 후 색 반응, 그리고 이후 30 MN의 간격을 모니터링합니다. </li><li> 다음 색 반응 (적색 나타납니다), PBS로 전송 배아. </li></ol> 6 부 : 고정 및 처리 <ol><li> PBS를 포함하는 고정 접시에 전송하고, 4 RT 또는 O / N 20 MN에 대한 4퍼센트 PFA의 해결 ° C. </li><li> PBS, 2X 10 MN에 씻으십시오. 사진에 대한 처리하기 위해 PBS에 20 % 글리세롤 (이것은 태아가 반투명하게됩니다)을 전송할 수 있습니다. 챔버를 만들려면 슬라이드에 그들을 입력해, PVC 테이프 2 스트립 잘라. 블레이드를 사용하여 중앙에 사각형을 잘라 버릴거야. 광장 사용 포셉를 제거합니다. </li><li> 왁스 sectioning에 대한 처리하기 위해 메탄올의 등급 시리즈 (25 %, 50 %, 75 % 및 PBS 100 %, 10 MN 각)에서 탈수, PBS, 씻지 2X 10 MN로 다시 전송할 수 있습니다. </li><li> 프로파놀, 3mn로 바꿉니다. 1,2,3,4 - tetrahydronaphthalene로 교체, 20 MN은 Histoclear (2X 1 시간)으로 따라갔다. 1 시간에 대한 histoclear / 왁스 1분의 1 (V / V) 60 ° C로 바꿉니다. 왁스 처리로 교체조직학하십시오. </li></ol> 7 부 : 솔루션 -20에서 하이브 리다이 제이션 버퍼 저장 ° 팔콘에서 C, 50 ML : 25 ML의 포름 아미드, 3.25 ML (20xSSC), 0.5 ML (0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 1 ML (10 % 트윈 - 20), 2.5 ML (1 % SDS) ; 125 UL (20mg/ml tRNA). 100ul (50 MG / ML 헤파린) MABT는 100mM maleic 산성을 준비, 산도 7.5 NaOH 알약과 함께. 150mM NaCl 및 0.1 % 트윈 - 20을 추가합니다. NTMT (사용 직전 만든), 50 ML : 1ml (5M NaCl), 2.5 ML (2M 트리스 - HCL pH9.5), 1.25 ML (2M MgCl 2), 5 ML (10 % 트윈 - 20). TBST : 0.1M 트리스 - HCL, 0.15M NaCl, 산도 8.45, 0.1 % 트윈 - 20. 8 부 : 문제 해결 <table border="1"><tbody><tr><th> 문제 </th><th> 원인 </th><th> 치료제 </th></tr><tr><td valign="top"> 태아가 웅크리고있다 </td><td valign="top"> 부족 탈수 / rehydration </td><td valign="top"> 연속 탈수 / rehydration 단계 동안 10 MN 간격을 유지 </td></tr><tr><td valign="top"> 프로브 신호가 없습니다 </td><td valign="top"> 프로브는 병에 강등 RNase 오염입니다 </td><td valign="top"> 전체 유리병이 2 단계에서 Proteinase K 용액에 노출되었는지 확인합니다 1퍼센트 아가로 오스 겔에 프로브를 실행 </td></tr><tr><td valign="top"> 프로브 마음 레이블 충치 신경 튜브입니다 </td><td valign="top"> 프로브가 갇혀있어 </td><td valign="top"> 2 단계에서는 모든 충치가 뇌를 사용 microdissection 나이프 있는지 확인하거나 microcapillary </td></tr><tr><td valign="top"> 배아는 다음과 하이브리드화 (3 단계)를 분해 </td><td valign="top"> Proteinase K 단계가 너무 깁니다 하이브 리다이 제이션 온도가 너무 높습니다 왼쪽 </td><td valign="top"> Proteinase K은 2 MN (단계 5-7), 3 MN (80-10 단계), 4 MN가 (11-13 단계), (단계 3 + 4) 이상 1mn보다 왼쪽해서는 안됩니다 높은 T O에 잡종을하지 마십시오 65 O C 이상 </td></tr></tbody></table> 파트 9 : 대표 결과 대표 배아은 아래와 같습니다 : (A) 엠브료 (무대 HH7)이 파다 - 삭스 프로브 (파란색)와 FITC - 델타 - 1 프로브 (적색)으로 표시됩니다. (B) 엠브료 (무대 HH8)이 파다 - Pax6 프로브 (파란색)와 FITC - 쉬 프로브 (적색)으로 표시됩니다. NF, 신경 폴드, ANP, 앞쪽에 신경 판, PSM, presomitic mesoderm, N, notochord, NT, 신경 튜브). DRS의 실험실에서 프로브 선물. C. Tabin, M. 굴딩스, D. 헨리크, 그리고 J. 브리 스코. <img src="/files/ftp_upload/old/904_2008_10_20_1/904_Figure-01.png" alt="" width="303" height="300" />

<ol><li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. 406, 74-78 (2000).</li>
<li>Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+Cer-like+protein+Caronte+mediates+the+establishment+of+embryonic+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry.</a> Nature. 401, 243-251 (1999).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
<li>Kawakami, M., Nakanishi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+an+endogenous+PKA+inhibitor%2C+PKIalpha%2C+in+organizing+left-right+axis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation.</a> Development. 128, 2509-2515 (2001).</li>
<li>Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

현장 하이브리드화 방식의 2 색 전체 마운트는 관심 중 하나 또는 두 개의 유전자를 사용하여 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴 모두를 결정하는 데 사용됩니다. 응용 프로그램은 새로운 유전자의 유전자 발현 패턴의 평가 (예 : 1,2,뿐만 아니라 유전자 발현 다음과 모욕의 변화 (배아 조작 3, 구슬 4 및 RNA 또는 DNA의 electroporation 5 구성)을 포함합니다.

<table><tbody><tr><td>난자</td><td>동물</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5</td><td></td></tr><tr><td>Marsh 자동 배양기</td><td>도구</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>하이브리다이제이션 배양기</td><td>도구</td><td>Hybaid</td><td>Micro-4</td><td></td></tr><tr><td>Adams Nutator 궤도 혼합기</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-062</td><td></td></tr><tr><td>곡선 핀셋 (1)</td><td>도구</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>스푼</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 모세관 피펫</td><td></td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 모세관 튜브</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td>수직 마이크로피펫 풀러를 사용하여 당기고, 미세 핀셋으로 끝을 뭉툭하게 처리함</td></tr><tr><td>마이크로 해부 칼</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>in situ 하이브리다이제이션 전강에 구멍을 뚫는 데 사용</td></tr><tr><td>Minuten 핀 (직경 0.2mm)</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>마그네틱 스터러를 사용하여 핀을 함께 보관함</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화제 및 베이스</td><td>시약</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>경화제 1분량과 베이스 9분량을 혼합하여 37°C에서 밤새 굳힘</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (depc)</td><td>시약</td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>PBS 1L에 depc 1mL를 첨가하고 흔든 후 오토클레이브 처리함</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>시약</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5MG</td><td>depc-H₂O에서 10 mg/mL 농도로 조제하여 10µL씩 분주함. -20°C에서 보관함.</td></tr><tr><td>탈이온 포름아미드</td><td>시약</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA-25 mg</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15401-011</td><td>depc-H₂O에서 20 mg/mL 농도로 조제하여 125µL씩 분주함. -20°C에서 보관함</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨염</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>depc-H₂O에서 50 mg/mL 농도로 조제하여 100µL씩 분주함. -20°C에서 보관함.</td></tr><tr><td>SSC x20 pH5.5</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V4261</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>PR-V4231</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>말레산</td><td>시약</td><td>Fluka</td><td>63189</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#8211;hringer 블로킹 시약</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>MABT 내에서 2% 농도로 사용. 제조 시 MABT와 함께 60°C에서 20분간 가열함. 스톡을 만들어 1-5 mL씩 분주하여 20°C에서 보관 가능함.</td></tr><tr><td>열 불활성화 양 혈청</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>013-000-121</td><td>H₂O 10 mL에 녹여 55°C에서 30분간 가열함. 1mL씩 분주하여 -20°C에서 보관함.</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab 단편</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP 스톡 용액</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-AP, Fab 단편</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>2M Tris</td><td>BP1759-500</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector Red 알칼리성 포스파타아제 기질 키트</td><td>시약</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>1,2,3,4-tetrahydronaphthalene</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429325-100ML</td><td>후드 내에서 사용</td></tr></tbody></table>

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브, 체절과 심장 primordia 형성에 유전자 발현을 연구를위한 이상적인 도구가합니다. 이 비디오는 현장 하이브리드화 2 색 전체 마운트에있는 다른 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 배아는 prehybridization에 대한 처리됩니다. 배아는 다음 두 가지 프로브, 팔 결합 하나와 FITC에 결합하여 하나 hybridized입니다. 하룻밤 하이브리드화 다음, 배 (胚)가 발굴 결합 항체와 incubated입니다. 발굴 기판에 대한 컬러 반응이 수행하고, 관심 지역은 파란색으로 나타납니다. 배아는 다음 FITC 항체와 결합 incubated입니다. 배아는 FITC와 색상 반응을 처리하고, 관심 지역은 빨간색으로 나타납니다. 마지막으로, 배아는 고정 및 처리 phtograph과 sectioning입니다. 문제 해결 가이드도 제공됩니다.

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

닭 배아는 초기 배아 발달 연구에 있어 매우 가치 있는 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작의 용이성 덕분에 닭 배아는...

이 절차는 배아의 고정, 메탄올 처리 및 proteinase K 처리로 시작하며, 이어서 probe one diggen in or dig 및 probe와 함께 하룻밤 동안 배양합니다. FITC 또는 ZI 배아를 dig 항체와 함께 배양한 후 dig alkaline phosphatase를 사용하여 발색 반응을 유도합니다. 활성을 불활성화하고 배아를 배양합니다.FSE 항체와 함께 발색 반응을 수행하고 배아를 고정합니다. 안녕하세요, 저는 휴스턴 텍사스 A&M 대학교 환경 및 게놈 의학 센터의 Rick Finnel 교수님 연구실의 Delphine입니다. 오늘은 닭 배아에서 이중 색상 인시츄 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다.본 연구실에서는 항경련제가 위 및 신경 유전자에 미치는 영향을 분석하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 닭 배아의 in situ hybridization을 수행하려면, 먼저 핀셋으로 껍질을 두드려 조각을 제거함으로써 알을 엽니다. 핀셋으로 두꺼운 알부민을 제거하고, 미세 가위를 사용하여 배아가 위를 향하도록 거친 핀셋으로 난황낭을 기울입니다.배아 주변의 난황낭을 정사각형 모양으로 절개합니다. 스푼을 사용하여 난황에서 배아를 분리한 후, 얼음이 담긴 접시에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 차가운 PBS로 세척합니다. 막과 난황을 조심스럽게 제거하고 배아를 얼음이 담긴 새 접시로 옮깁니다.차가운 dey PBS 상태에서 포셉으로 배아를 고정하고 흄 후드 내에서 dey PBS를 흡입하여 제거합니다. 이를 4% paraform aldehyde가 포함된 dey PBS로 교체하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배아를 고정시킵니다. 배아가 고정되면 고정액을 흡입하여 제거하고 화학 폐기물로 적절히 처리합니다.뭉툭한 끝의 마이크로 모세관 바늘이나 마이크로 해부용 칼을 사용하여 디쉬를 얼음처럼 차가운 dey PBS로 채우고 머리와 심장강을 천공합니다. 프로브가 갇히는 것을 방지하기 위함입니다. 배아를 0.1% tween 20이 함유된 DEP CPBS에 넣은 후, PBT 내의 25%, 50%, 75% 및 100% 메탄올 시리즈 세척액으로 각각 10분씩 배아를 탈수시킵니다.100% methanol 세척 과정을 반복합니다. 이제 배아를 methanol이 담긴 20 milliliter 유리 신틸레이션 바이알에 넣어 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.인시

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