The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 54.224.79.93, User IP: 54.224.79.93, User IP Hex: 920670045
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).
إدارة مرض السكري نوع 1 هو مرهقة ، سواء على الفرد والمجتمع ، وتكلف أكثر من 100 مليار دولار سنويا. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق للرصد الغلوكوز والانسولين صياغات جديدة ، وتطوير العديد من الأفراد لا تزال مضاعفات ثانوية مدمرة. ويمكن زرع البنكرياس جزيرة بالقرب من استعادة السيطرة على مستويات الجلوكوز الطبيعي في مرضى السكري
لبدء إجراءات تنقية جزيرة ، تحميل الحقيبة كوبي ، المشبك جميع الأنابيب عدا أنبوب الخضراء ، وضبط السرعة إلى 1500 والسوبر خارج إلى 0.
هود في إعداد الأكواب المضخة والانحدار وتوصيل أنابيب جمع في أنبوب الخضراء.
الآن يمكن التحميل من ficoll 1،100 تبدأ : دفع "تدور" ثم يضاف 110 مل من Ficoll 1،100 إلى الدورق الجبهة ، وبدء ضخ لتحميل الحقيبة كوبي. كما يتم تحميل Ficoll ، اضغط عظمى خارج ، ووقف ضخ ، unclamp رئيس المضخة وضبط السرعة من السوبر إلى 100.
عندما يصل ficoll الدورق ويطرد كل الهواء من الأنابيب ، المشبك في إعادة رأس المضخة. تعيين سرعة الدوران إلى 3000 ، وسرعة فائقة إلى 0.
الآن التحضير لتحميل التدرجات بصب التدرج الثقيلة في دورق الجبهة. الافراج قليلا المشبك بين الأكواب اثنين إلى إزالة أي الهواء. ثم يسكب الضوء التدرج في الدورق الى الوراء.
بدوره على النمام المغناطيسي ، واضغط على "تدور" على الجهاز كوبي ، إزالة المشبك من الأنبوب الذي يربط بين الأكواب اثنين ، والتحقق بصريا أن التدرجات الثقيلة والخفيفة والاختلاط.
بمجرد أن بدأ خلط التدرجات ، بدوره على جهاز الطرد المركزي. الانتظار دقيقة واحدة ، ثم تشغيل المضخة لتحميل التدرجات الاختلاط.
لتحميل الأنسجة اسمحوا التدرج تشغيل منخفضة في الدورق الجبهة ، لكنه ليس ضعيفا بما يكفي للسماح بدخول الهواء في أنبوب التحميل ، ثم reclamp الأنبوب الذي يربط بين الأكواب وتحميل الأنسجة.
واضاف ان يستمر بقية الأنسجة. ثم يغسل الأنبوب الذي عقد في النسيج مع 50 مل من محلول الغسيل ، واستخدامه لغسل الدورق الجبهة.
وكان آخر من يدخل نسيج كيس ، في وقت واحد وقف ضخ ، unclamp على رأس المضخة ، وأنابيب المشبك فوق الحقيبة. تواصل أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق.
في حين لا يزال الطرد المركزي ، ليصبح أنابيب جمع 12 إلى غطاء محرك السيارة وتخفيف قبعاتهم. إرفاق أنابيب جمع إلى أنبوب الصفراء ، ومكان غيض جمع العقيمة في أنبوب مخروطي الشكل 1. unclamp ثم الأنبوب الأصفر ، والمشبك أنبوب الخضراء.
عندما تدور تنتهي ، ورفع ببطء Superout إلى 100. جمع 150 مل في أنبوب 1. ثم جمع 30 مل في أنابيب 12/02 (200-230 مل).
بمجرد اكتمال جمع ، ودفع "إيقاف" في كوبي. الآن بعد أن انتهت تنقية ، يمكن تقييم الجزر والمثقفين.
2. أخذ العينات والثقافة
بعد جمع الكسور الجزر منقى ، أخذ عينة من كل من أنابيب جمع 12 وصمة عار مع Dithizone. سوف تظهر البقع التي تحتوي على طبقات عالية النقاء الجزر مقابل طبقات مع نقاء الجزر المنخفضة.
جمع الأنسجة النقاوة العالية والمنخفضة وتجمع كل معا.
تدور ويغسل مرتين. بعد غسل الثاني ، جعل حجم كل منها 250 مل مع وسائل الاعلام اغسل النهائي.
لتقييم الكسور المجمعة تبدأ أخذ اثنين من عينات 1 مل من المستوى العالي من الكسور المجمعة وعينة واحدة 1 مل من منخفضة. نقل كل عينة 1ml في أنبوب مخروطي يحتوي على 9 مل من محلول الغسيل.
ثم نقل 1 مل من كل أنبوب 15 مل إلى طبق العد. فحص وفرز الخلايا تحت المجهر.
بعد عد الخلايا حساب عدد القوارير اللازمة لثقافة الجزر باستخدام الصيغة التالية : (EIN الكل / نقاء من الجزر في العشرية) / (30000 EIN في قارورة). على سبيل المثال ، يتم تربيتها 100000 الجزر مع نقاء 90 ٪ في 4 القوارير.
نقل إلى الجزر T175 القوارير والثقافة في 37 ˚ C و 5 ٪ CO 2 الحاضنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
على الرغم من التقدم الكبير في تقنيات العزل جزيرة الإنسان ، جزيرة الغلة يبقى متغير بدرجة كبيرة وغير متوقعة. تنقية نسيج البنكرياس هضمها أمر حاسم لاستعادة جزيرة كتلة كافية بعد الهضم الأنزيمي ناجحة لزرع الأعضاء. ويوصى الأسلوب لأن تنقية UIC وقد تجلى انتعاش متفوقة من الجزر الإنسان نقية للغاية باستخدام هذا الأسلوب. وعلاوة على ذلك ، يمكن تحميل ما يصل الى 50 مل من الأنسجة هضمها في كوب واحد الترشح للتنقية ، والتقليل بالتالي نقص تروية المرتبطة إصابة الجزر الإنسان عن طريق اختصار الوقت الإجمالي المستخدمة في العزل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
بدعم من المؤسسين من جامعة إلينوي في شيكاغو ، وكذلك جزيرة خلية منح مركز الموارد المعاهد الوطنية للصحة (RFA - RR 05-003) ، ومؤسسة كريستوفر ، ومؤسسة Efroymson ، ومؤسسة Tellabs.
Shapiro, A.M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med343, 230-238 (2000).
Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia48, 906-912 (2005).
Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation84, 1200-1203 (2007).
Fridell, J.A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation77, 1304-1306 (2004).
Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant18, 661-665 (2004).
Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation82, 983-985 (2006).
Ricordi, C., Lacy, P.E. & Scharp, D.W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes38 Suppl 1, 140-142 (1989).
Ricordi, C., et al. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat27, 185-195 (1990).
how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol 23%
1
ReplyPosted by: mahvash h.June 22, 2009, 4:44 AM