Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

Para iniciar este procedimento, Kumasi Brilliant Blue ou CBG two 50 é dissolvido em um litro de água bidestilada mexendo por duas a quatro horas. O ácido clorídrico é posteriormente adicionado à solução azul escura com agitação por mais um minuto, e a solução é armazenada no escuro para uso posterior. Após a preparação da amostra de proteína e a página STS, o de gel é desmontado e o gel colocado em uma caixa para três etapas de lavagem subsequentes com água bidestilada

Após a terceira etapa de lavagem, a água é substituída por solução de coloração CBB suficiente para cobrir o gel na caixa. A caixa é aquecida no micro-ondas por 10 segundos e a caixa com o gel é colocada em uma coqueteleira. Para completar a coloração, as bandas de proteína podem ser observadas após um minuto.

Olá, sou Amri Lawrence, da instalação de purificação de expressão de proteínas para tosse em Emberin Heidelberg. Hoje mostraremos um protocolo para coloração de proteínas com cooma azul brilhante G cem 50 em géis de cloreto. Ao contrário dos métodos clássicos de coloração, nosso protocolo não usa solventes orgânicos ou ácido acético.

Usamos este protocolo para analisar nossas proteínas após cada etapa de purificação. Então vamos começar. Para preparar a solução de coloração CBB, 60 a 80 miligramas de CBB são dissolvidos em um litro de água destilada por bist mexendo por duas a quatro horas.

Após a dissolução do CBV, transferir a solução para uma hotte. Na hotte, adicione cuidadosamente três mililitros de ácido clorídrico concentrado à solução azul escura. Com agitação por um minuto, luvas devem ser usadas, pois a solução final terá um pH de dois.

Uma vez feita a solução, ela é armazenada no escuro para uso posterior. A solução pode ser armazenada por semanas ou até vários meses sem perder sua eficiência de coloração. Para preparar amostras de proteína para a página SDS, alíquotas apropriadas de amostras de proteína são misturadas com tampão de carregamento até uma concentração final de um x tampão de carregamento e aquecer as amostras de proteína por cerca de cinco minutos antes do carregamento.

Enquanto as amostras estão sendo aquecidas, a câmara de eletroforese em gel é preparada para a execução. Usamos géis pré-moldados em uma mini célula com buffer MES como buffer de corrida. No entanto, qualquer outro sistema de gel e eletroforese pode ser usado.

As amostras de proteína aquecidas são então carregadas no gel e no eletro East por 50 minutos a 220 volts. Quando a página SDS estiver completa, o de gel é desmontado e o gel é colocado em uma caixa com 100 mililitros de água destilada bis. Para as etapas de lavagem subsequentes, a caixa é aquecida no forno de micro-ondas por 30 segundos.

O aquecimento deve ser interrompido antes que ocorra a ebulição. Depois de colocar a caixa no micro-ondas com o gel colocado em uma coqueteleira por três a cinco minutos, repita esta etapa de lavagem duas vezes com água doce. Após as três lavagens com água, adiciona-se uma solução permanente de CBB para cobrir o gel na caixa e a caixa é aquecida no micro-ondas por 10 segundos sem ferver.

Em seguida, a caixa com o gel é colocada em um shaker para finalização da coloração. As bandas de proteína podem ser observadas após um minuto e após 15 a 30 minutos. A coloração geralmente é forte o suficiente.

A solução de coloração é derramada e 50 a 100 mililitros de água bidestilada são adicionados. Para deter ainda mais o fundo azul claro do gel em um shaker, a água pode ser substituída por água doce para posterior descoloração. Se necessário, o gel agora pode ser digitalizado, fotografado ou seco para armazenamento de longo prazo.

Um gel que foi corado após este procedimento deve ficar assim. Neste gel, as bandas de proteína são bem coradas e claramente visíveis. Enquanto o fundo é insignificante.

A primeira faixa indicada pelo asterisco contém marcadores de peso molecular. Em contraste, um gel que não foi lavado o suficiente antes da coloração ficará assim: Neste gel, as etapas de lavagem foram muito curtas, então as bandas de proteína não foram coradas bem o suficiente. Observe que a faixa indicada pelo asterisco contém as mesmas quantidades de proteína de marcadores de peso molecular que um gel anterior, mas mostra uma coloração menos eficiente.

Acabamos de mostrar como corar proteínas com co massive azul brilhante em géis de poliamida sem ter que usar solventes orgânicos tóxicos ou inflamáveis. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as etapas de lavagem são críticas para a coloração eficiente das proteínas. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.