Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

O protocolo de hibridização in situ de fluorescência em núcleos de espermatozoides humanos tem sido amplamente incorporado no campo do diagnóstico clínico. Uma das aplicações desta metodologia é a triagem de ploidia de espermatozóides. Como parte do conselho sobre reprodução dado a machos inférteis, a presença de anormalidades numéricas é maior nesses indivíduos do que na população em geral, e eles geralmente exibem parâmetros seminais anormais.

Isso representa um risco aumentado de transmissão dessas anomalias para qualquer prole. Hoje vamos ilustrar o protocolo de hibridização in situ de fluorescência em núcleos de espermatozóides condensados decon para a análise dos cromossomos 13, 18, 21 x e Y. Uma vez coletada a amostra, ela deve ser deixada em temperatura ambiente por 20 minutos até que ocorra a ação do liqui. Para iniciar o protocolo, a amostra deve ser transferida para um tubo de centrífuga.

As soluções que vamos usar na primeira parte do experimento são hipertônico pré-aquecido a 37 graus C e ácido metanol acético na proporção de três para um. Estes devem ser preparados na hora. Em seguida, a amostra está pronta para centrifugar a mil Gs por cinco minutos.

Agora, remova suavemente o sobrenadante e adicione a solução hipertônica gota a gota até obter um volume de cerca de 10 mililitros. Este tubo deve permanecer a 37 graus C por 30 minutos e, em seguida, a amostra deve ser centrifugada novamente. A centrifugação faz com que os espermatozóides se acumulem no fundo do tubo, permitindo-nos substituir a solução hipotônica pelo metanol.

A centrifugação do ácido acético deve ser repetida para trocar o ácido metanol-acético quantas vezes forem necessárias para obter um pellet branco. Quando isso ocorre, mais ácido acético metanol deve ser adicionado. O volume final deve ser ajustado de acordo com a dispersão celular que você deseja obter em outras extensões.

A etapa final é fazer as extensões soltando a amostra fixa em lâminas de palheta armazenadas em metanol a menos 20 graus C.It é útil para deli a área da lâmina que contém a extensão do esperma para relocalizações de perspectiva. Isso pode ser feito facilmente usando um lápis de diamante do outro lado do slide. Uma vez verificada uma dispersão celular ótima, as lâminas devem ser armazenadas a menos 20 graus C durante um período mínimo de 24 horas.

Antes de prosseguir com o protocolo. Nesta parte do experimento, vamos usar solução salina de citrato de sódio série etanol DRE fatal e fide. Depois de descongeladas as lâminas, as amostras fixas devem ser lavadas e desidratadas submergindo-as em dois frascos de coplan consecutivos contendo duas vezes SSC.

Isso levará três minutos para cada coplan. Em seguida, as lâminas devem ser submersas por dois minutos em cada um dos frascos de coplan de etanol em ordem de concentração aumentada. Neste ponto, para continuar com as etapas seguintes, as lâminas devem ser secas.

Dado que o DNA no núcleo do esperma é altamente compactado, é necessário condensar a cromatina antes de desnaturá-la. Isso pode ser feito usando uma solução de TDT a 37 graus C. Este é um produto que atua quebrando as pontes de sulur da protamina que enrolam o DNA no núcleo do espermatozóide. O tempo de incubação da lâmina em TDT deve ser ajustado de acordo com a reatividade da amostra de sêmen a este produto.

Normalmente isso é em torno de oito minutos, embora possa variar de dois a 15 minutos após esse tempo, as lâminas devem ser transferidas imediatamente para duas vezes SSC por três minutos e novamente por mais três minutos, seguidos de dois minutos em cada um dos potes de coplan de etanol. Para a hibridização da sonda, é essencial trabalhar com fitas de DNA simples. Isso requer um estágio de desnaturação antes da adição das sondas, envolvendo um período de incubação de cinco minutos em uma solução de ácaro anterior a 73 graus C.To concluir o tratamento da lâmina, é necessária uma transferência final na solução de etanol submergindo as lâminas por um minuto por frasco de coplan.

As lâminas estão então prontas para serem hibridizadas nos estudos em peixes realizados para diagnóstico clínico. Os cromossomos mais comumente analisados incluem os cromossomos sexuais e os cromossomos 13, 18 e 21. Para analisar esses cromossomos, usaremos um kit de sonda de DNA multicolorido de vícios.

Este contém um frasco com uma combinação de sondas para a região satélite alfa dos cromossomos, X, Y e 18 rotulados como origem verde e aqua, respectivamente, e outro frasco com uma combinação de sondas para os cromossomos 13 e 21 marcados como verde e laranja, respectivamente. O volume da mistura de sonda adicionada varia de acordo com o tamanho da área que você deseja hibridizar como referência para uma lâmina de cobertura de 15 por 15. Um volume de cinco microlitros é suficiente.

Ambas as misturas de sonda são pré-desnaturadas em um tampão de hibridização para facilitar o uso, para que você possa adicioná-las diretamente às lâminas condensadas e desnaturadas do diácono. Existem também outras sondas comerciais disponíveis para uma ampla gama de cromossomos e Loki que podem ser usadas nesses experimentos. Normalmente, no entanto, essas sondas requerem um tratamento pré-desnaturante antes da adição da mistura à amostra alvo.

Nessas situações, basta seguir as instruções do fabricante. A região alvo deve ser coberta com uma corrediça de cobertura e selada com cimento de borracha. Em seguida, as lâminas estão prontas para serem colocadas na câmara de hibridização, pré-aquecidas a 37 graus C e incubadas nessa temperatura por seis a 24 horas.

Na parte final do protocolo, vamos usar essas duas soluções de lavagem compostas por diferentes concentrações de solução salina de citrato de sódio e o detergente NP 40. Após o tempo de incubação, as lâminas podem ser removidas da câmara de hibridização para eliminar o cimento de borracha. Em seguida, retire cuidadosamente a lâmina de cobertura.

Como mostrado, as lâminas são submersas por dois minutos na primeira solução de lavagem, pré-avisadas a 73 graus C. Em seguida, são transferidas para a segunda solução de lavagem à temperatura ambiente por mais um minuto. Essas duas lavagens nos ajudarão a eliminar quaisquer sinais de hibridização inespecíficos. Após essas duas lavagens, temos que esperar que as lâminas sequem para concluir a última etapa do protocolo.

Neste ponto, um produto de contracoloração é adicionado para facilitar a visualização do núcleo das células. Um dos produtos mais comuns usados para esse fim é o dpi. O volume adicionado também deve ser ajustado ao tamanho da área hibridizada como referência para uma lâmina de cobertura de 18 por 18.

Um volume de oito microlitros de DPI é suficiente. A lâmina de cobertura pode ser selada com esmalte e agora os preparativos estão prontos para serem visualizados. Caso contrário, eles podem ser armazenados a menos 20 graus C até a análise do prospecto.

O microscópio que vamos usar para a visualização é um Olympus BX 60 epi fluorescente equipado com um filtro de banda tripla para dpi, Texas Red, FITC e filtros de banda única para aqua FITC e Texas Red através do filtro de banda tripla, a preparação hibridizada com x, Y e 18 sinais de exibição para esses três cromossomos. Usando o filtro de banda única para aqua, só podemos visualizar sinais fluorescentes para o cromossomo 18. Devemos esperar um desses sinais em todos os espermatozóides normais.

No entanto, ao usar o filtro de banda única apenas para FITC, alguns espermatozóides mostram um sinal verde fluorescente correspondente ao cromossomo X. Os espermatozóides que não possuem o sinal verde devem exibir um sinal vermelho para o cromossomo Y, que pode ser visualizado especificamente através do filtro para o vermelho do Texas Visualizando a hibridização 1321 através do filtro de banda tripla. Podemos distinguir sinais para esses dois cromossomos.

O sinal verde corresponde ao cromossomo 13 e pode ser visualizado especificamente usando o filtro de banda única para FITC. O filtro de banda única para Texas Red nos permite visualizar especificamente os sinais do cromossomo 21. Todos os espermatozóides normais devem exibir um sinal para cada uma dessas duas sondas.

Então, para resumir, aqui estão as principais etapas do protocolo. Novamente, o processo de fixação deve ser realizado com precisão para obter extensões de boa qualidade com uma adição gota a gota do ácido acético metol. Para evitar a formação de agregados de espermatozoides no processo de descondensação, o tempo de incubação em solução de TDT deve ser ajustado de acordo com a reatividade da amostra de sêmen a este produto.

A exposição excessiva dos espermatozóides à TDT resultaria em sinais dispersos no final do protocolo, enquanto a exposição insuficiente resultaria em hibridização de sonda zero e falta de alguns sinais. Enquanto a desnaturação da amostra de esperma é obrigatória, a desnaturação da sonda deve ser adaptada às indicações do fabricante. É importante manter um controle rigoroso sobre o tempo e a temperatura das duas lavagens pós-hibridização.

Uma temperatura mais alta ou um tempo de lavagem excessivo podem resultar na eliminação de alguns sinais, enquanto o contrário não eliminaria sinais inespecíficos. Por fim, o uso de um microscópio epifluorescente equipado com filtros específicos adequados é essencial para uma boa visualização e interpretação do sinal. E é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.