Name: Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a preparar spreads cromossômicos de células estaminais embrionárias humanas para cariotipagem. Este método permite monitorar alterações genéticas e garantir a integridade cromossômica em pesquisa com células-tronco.

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EQUIPAMENTO <ul><li> Cultura de tecidos incubadora, 37 ° C CO, 5% 2 </li><li> Centrifugador </li><li> Conjunto de micropipettors (100, 100μL) </li><li> Banho-maria 37 ° C </li><li> Banho-maria 90 ° C a ser fonte de vapor de água </li><li> Microscópio de contraste de fase </li></ul> PRIMEIRO PASSO Tratar as células com Colcemid Neste procedimento foi utilizada a linha CTEh H9 cultivadas sobre fibroblastos embrionárias de rato (MEF) inativados com mitomicina C (Sigma) e mantidos em DMEM/F12 (Invitrogen) suplementado com a substituição knockout 20% de soro (KSR, Gibco) e 8ng/mL de fator de crescimento fibroblástico (FGF-2, R &amp; D). A fim de obter um grande número de metáfases se espalha, é recomendado o uso de culturas com alto índice mitótico em que há muitas células em divisão. <ol><li> Pegue o frasco de cultura da incubadora e, no fluxo laminar, adicione Colcemid na concentração final de 0,1 mg / mL. </li><li> Retornar o frasco para a incubadora e esperar 3 horas para que o inibidor pode causar paragem da mitose na metáfase, quando os cromossomos estão bem condensados ​​e podem ser facilmente visualizadas ao microscópio. </li></ol> Fixação das células <ol start="3"><li> Retire e adicione o meio tripsina / EDTA 0,05% suficiente para cobrir a superfície das células. Permitir que as células incubar por 5 minutos em temperatura ambiente e depois inativar a enzima quer pela inclusão de meio de cultura contendo soro ou apenas adicionando soro para as células. NOTA: É importante certificar-se que uma suspensão única célula é conseguido obter bons spreads metáfase. </li><li> Transferência das células para um tubo de centrifugação de 15 mL e centrifugar a 122 g por 5 minutos. </li><li> Desprezar o sobrenadante, deixando cerca de 200 mL, e ressuspender o sedimento delicadamente tocando o tubo, como mostrado no vídeo. Certifique-se que as células estão bem dissociada, então você não pode visualizar qualquer aglomerados na solução. </li><li> Em seguida, você terá que adicionar 5 mL de solução hipotônica (KCl 75mm) pré-aquecido a 37 ° C, lentamente, pela parede do tubo como no seguinte descrição. Primeiro adicione 3 ml, inverter o tubo para a posição horizontal apenas para misturar as células com a solução hipotônica em seguida, adicionar os 2 ml restantes e manter aquecido a 37 ° C por 15 minutos. NOTA: Neste ponto, a solução hipotônica irá causar um aumento no volume celular e ajudam a desembaraçar os cromossomos. O tempo de incubação é importante para adquirir spreads cromossomo bom. Se o tempo é muito longo, a membrana celular pode estourar cedo demais e os cromossomos são perdidos. Se for muito curto, pode ser difícil obter spreads cromossomo porque a membrana celular não pode perturbar. </li><li> Adicionar 3 gotas da solução fixadora (metanol / ácido acético glacial 3:1), inverter o tubo suavemente para misturar a solução fixadora com as células e centrifugar a 122 g por 5 minutos sem intervalo. NOTA: A solução fixadora deve ser preparado. NOTA: É importante o uso de centrifugação, sem interrupção, para evitar o desgaste das células, evitando a perda do material. </li><li> Desprezar o sobrenadante, deixando cerca de 200 mL, e ressuspender o sedimento delicadamente tocando no fundo do tubo. NOTA: Mais uma vez, certifique-se que as células estão bem dissociada, então você não pode visualizar qualquer aglomerados na solução. </li><li> Adicione o primeiro de 3 mL de solução fixadora, lentamente pela parede do tubo, enquanto você gira o tubo. Inverter o tubo para a posição horizontal apenas para misturar as células, e em seguida, adicione mais 2 mL da solução de fixador de parede do tubo para tirar as células para baixo. Estoque a 4 ° C durante a noite. NOTA: As células fixas podem ser armazenados em solução fixadora por meses a 4 ° C. Além de proteger as células em seu estado inchado, a solução fixadora elimina lipídios e proteínas desnatura. Estes eventos fazem a membrana celular frágil e, como resultado, fazer o cromossomo espalhar facilmente. </li></ol> LIMPEZA DO lâminas de vidro Antes de iniciar fazendo espalha o seu cromossomo se certificar de que seus slides estão devidamente limpos, ou você pode perder alguns núcleos e também metáfases. Esta etapa é bem importante se você quiser experimentar qualquer técnica de hibridização 9. <ol><li> Coloque as lâminas num copo contendo HCl 6M por pelo menos 3 h à temperatura ambiente. </li><li> Após este tempo, lavagem das lâminas em água corrente por 10 minutos. </li><li> Enxágüe as lâminas em água destilada e deixar eles secam em temperatura ambiente. </li><li> Agora as lâminas podem ser armazenadas em etanol 96% e secos com um pano imediatamente antes da utilização. </li></ol> NOTA: Para nos métodos de hibridização in situ, as lâminas não pode ser armazenado por mais de dois dias em etanol 96% SEGUNDA ETAPA Lavar as células <ol start="10"><li> No dia seguinte, centrifugar as células em 122 g por 5 minutos sem intervalo. </li><li> Discard o sobrenadante deixando cerca de 200 ml. Ressuspender o sedimento suavemente flicking o tubo, em seguida, adicionar 5 ml de solução fixadora fresco (metanol / ácido acético glacial 3:1), lentamente pela parede do tubo durante a rotação do tubo. Repita este passo de lavagem mais 2 vezes para um total de três lavagens. NOTA: A solução fixadora deve ser preparado. </li></ol> Preparando os slides <ol start="12"><li> Na última etapa de centrifugação deixar quantidade suficiente de solução para homogeneizar o pellet celular e obter uma densidade adequada de células nas lâminas (ver figura 1). </li><li> Adicionar 2-30 mL de suspensão de células sobre uma lâmina limpa e seca, movendo a pipeta muito próximo e paralelo à superfície. Como a evaporação solução fixadora, a superfície da lâmina torna-se granulado. </li><li> Imediatamente, expor o slide, a face para cima, para o vapor de água quente (90 °) por 30 segundos para fazer com que as células explodir. NOTA: Neste momento, o metanol evapora a partir da solução fixadora, resultando em uma concentração de ácido acético aumentou, o que junto com a água estimula o cromossomo se espalhando. </li><li> Olhe para um microscópio de contraste de fase, apenas para verificar se a concentração, bem como a distribuição das células é bom (ver figura 1). </li><li> Agora os slides estão prontos para ser utilizados para verificar o conjunto de cromossomos por citogenética abordagens como bandamento G, SKY FISH (Giemsa), ou CGH. </li></ol> DICAS IMPORTANTES Como escolher uma metáfase adequada a ser analisada Escolhendo metáfases redondo e isolado (figura 2D), você pode evitar considerando aneuploidias falso como o ganho de cromossomos gerados por dois ou mais se espalha misturados entre si ou a perda de cromossomos gerados por um cromossomo lançado. Assim, evitar a escolha de metáfases perto núcleos porque alguns cromossomos pode ser escondida por eles (figura 2A e 2B). Além disso, procurar metáfases redonda e ter certeza de que qualquer cromossomo é separado da metáfase (figura 2C). Células de alimentação e do cariótipo CTEh Para bandamento G e análise SKY, a presença de células alimentadoras na cultura CTEh não interfere com os resultados, porque as células de alimentação não estão sob um estado de divisão (inativados por mitomicina C ou irradiação) e não será uma parte da população metáfase. No entanto, para a aplicação da técnica FISH em núcleos interfásicos, é preferível para separar a população CTEh a partir de células de alimentação por colher as colônias manualmente antes de tripsinização para análise FISH. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Como conhecer a densidade de célula apropriada nos slides. Imagens de microscópio de contraste de fase na objetiva de 10x. (A) A densidade celular é muito alto. As setas apontam para metáfase se espalha muito próximo de núcleos. (B) Um slide com boa densidade celular. Os círculos mostram metáfases spreads isolado de núcleos ou metáfases outros. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Como escolher uma metáfase adequada para ser analisado. Cromossomos são corados com DAPI e as imagens obtidas por um microscópio de fluorescência em objetiva de 100x. (A) (B) Evite metáfases perto núcleos (indicado pelas setas) (C) e metáfases não volta que os cromossomos presentes separados (círculo). (D) A rodada é uma metáfase metáfase bom para ser analisado. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

<ol><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li>
<li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li>
<li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li>
<li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li>
<li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li>
<li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li>
<li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li>
<li>Robin-Wesselschmidt, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobin-Wesselschmidt%2C+JL+%22Human+Stem+Cell+Manual%22">Human Stem Cell Manual</a>. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).</li>
<li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRooney%2C+DE+%22Human+Cytogenetics%22">Human Cytogenetics</a>. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeslop-Harrison%2C+P+%22Practical+in+situ+hybridization%22">Practical in situ hybridization</a>. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

A preparação dos spreads cromossomo é um passo crítico para uma análise bem sucedida do estado genético das células-tronco embrionárias pelo rotineiramente técnicas como bandamento G, e as técnicas mais sofisticadas, como FISH, SKY e CGH. Este procedimento pode ser aplicado para vários tipos de células, variando o período de incubação Colcemid, que depende da duração do ciclo celular. Para colônias de células-tronco embrionárias, vamos esperar três horas enquanto que para corpos embrióides (...

<table><tbody><tr><td>Tubo cônico de 15 ml</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid Karyo MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Isofar</td><td>721</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Isofar</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Isofar</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>104.931.000</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina</td><td>Bioslide</td><td>7105-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para cariotipagem

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Apesar de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) foram mostrados para apresentar um cariótipo diplóide estável 1, muitos estudos têm relatado que dependendo das condições de cultura torna-se propenso a adquirir anomalias cromossômicas, como adição de conjunto ou de partes de cromossomos. Com efeito, durante longo prazo de cultura, alterações cariotípicas são observadas quando enzimática ou química de dissociação são usados ​​2,3,4, enquanto dissecção manual de colônias para passaging mantém um cariótipo estável 5. Além disso, as mudanças no ambiente, tais como a remoção de células de alimentação também parecem comprometer a integridade genética das CTEh 3,6. Uma vez que alterações cromossômicas podem afetar a fisiologia celular, a caracterização da integridade genética das CTEh in vitro é CTEh considerando crucial como uma ferramenta essencial em estudos de embriogênese e testes de drogas. Além disso, para o futuro fins terapêuticos alterações cromossômicas são uma preocupação real como ele é freqüentemente associada à carcinogênese. Aqui nós mostramos um método simples e útil para obter spreads cromossomo de alta qualidade para posterior análise do cromossomo definido pelo G-banding, FISH SKY, ou técnicas de CGH 7,8. Recomendamos que verifique o estado cromossômicas rotineiramente com intervalos de 5 passagens a fim de monitorar o aparecimento de translocações e aneuploidias Priscila Britto e Rafaela Sartore contribuíram igualmente para o papel.

Cariótipo é uma técnica simples e útil amplamente utilizado para detectar alterações genéticas. Descrevemos aqui um passo a passo protocolo para a preparação cromossomo disseminação de células estaminais embrionárias humanas para monitorar o estado cromossômica dessas células mantidas em cultura.

Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

Embora tenha sido demonstrado que as células-tronco embrionárias humanas (hESC) apresentam um cariótipo diploide estável 1, muitos estudos relataram que, dependendo do cultivo...

Introdução. Olá. Somos do Instituto de Ciências Biométricas da Universidade Federal de Faja, no Brasil. Neste vídeo, prepararemos espalhamentos cromossômicos de células-tronco embrionárias humanas para detectar possíveis alterações cromossômicas miraculosas. Embora se tenha demonstrado que as células-tronco embrionárias humanas apresentam um cariótipo estável e mantido, muitos estudos relataram que, dependendo das condições de cultivo, elas tornam-se propensas a adquirir anomalias cromossômicas, como a adição de cromossomos inteiros ou partes de cromossomos.A caracterização da integridade genética de HASS in vitro é crucial considerando estudos essenciais de embriogênese e testes de fármacos. Além disso, para propostas terapêuticas futuras, alterações cromossômicas são uma preocupação real, pois estão frequentemente associadas à carcinogênese. Então, vamos começar.Tratando as células com ate Neste procedimento, nós o utilizamos. Oito a nove linhas curadas no F 12 suplementado com 20% de substituição de soro sem contagem e 80 a nove gramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos. Comece removendo o frasco de cultura do incubador e, sob uma capela de fluxo laminar, adic

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Biologia

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica avançada citogenética para identificar as aberrações cromossômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas cromossômicas de pintura, que permitem a classificação de todos os cromossomos. SKY também pode identificar aberrações cromossômicas e defeitos complexos de segregação em camundongos e humanos, com várias doenças, incluindo doença renal policística.

Cariotipagem espectral para o Estudo de Anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

Embora as células poliplóides proliferativas sejam necessárias para analisar a instabilidade cromossômica das células poliplóides, não é fácil criar essas células a partir de células humanas não transformadas. O presente relato descreve procedimentos relativamente simples para estabelecer células tetraplóides proliferativas livres de uma população diplóide de fibroblastos humanos normais.

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Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

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Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

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Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

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