Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Olá, meu nome é Brad Hamilton. Sou cientista aqui no departamento de pesquisa e desenvolvimento aqui no STEM Gen. Hoje mostraremos um procedimento de como reprogramar fibroblastos humanos usando fatores de reprogramação fornecidos por lentivírus.

Este procedimento pode ser usado tanto para gerar células IPS quanto para estudar o processo de reprogramação. As células IPS são semelhantes às células ES na morfologia, proliferação e capacidade de diferenciação e a todos os tipos de tecidos do corpo. As células IPS humanas têm uma vantagem distinta sobre as células ES, pois exibem propriedades-chave das células ES sem o dilema ético de destruir um embrião para obter as células.

A geração de células IPS específicas do paciente contorna um obstáculo importante para terapias de medicina regenerativa personalizadas, eliminando o potencial de rejeição imunológica de células transplantadas não autólogas. Então vamos começar. Em vários pontos deste protocolo, você substitui o meio do IPSC em desenvolvimento ou células-tronco pluripotentes induzidas por meio condicionado por metanfetamina.

A preparação deste meio leva seis dias. Portanto, comece pelo menos uma semana antes de iniciar seu experimento. Para começar a semear cada poço de um seis.

Placa de poço com duas vezes 10 elevado ao quinto cf uma célula alimentadora de metanfetamina em dois mililitros de crescimento de metanfetamina. Incubar médio durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, mude o meio para a cultura de células E-S-I-P-S humanas.

Incubar médio durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Recolha o sobrenadante e substitua-o por meio fresco de 24 em 24 horas durante quatro dias. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 micrómetros.

Suplementar o sobrenadante recolhido com 15 nanogramas por mililitro de factor de crescimento básico de fibroblastos BFGF. Você acabará com cerca de 16 mililitros de metanfetamina em meio condicionado armazenando o sobrenadante coletado de cada dia separadamente a quatro graus SIUs. O meio condicionado com metanfetamina pode ser armazenado por uma a duas semanas a quatro graus Celsius ou por vários meses a menos 20 graus Celsius.

Agora que você garantiu que seu meio condicionado com metanfetamina estará pronto quando você precisar, vamos falar sobre como preparar as células. A primeira tarefa na geração de IPSC é usar lentivírus para transduzir células de fibroblastos do prepúcio humano ou células BJ com quatro características de transcrição de células-tronco. Para se preparar para a transdução, semeie células BJ com uma densidade de uma vez 10 elevado à quinta célula por poço de uma placa de seis poços e cultura.

As células em dois mililitros de crescimento, médio durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no mesmo dia. Comece a preparar as placas alimentadoras de metanfetamina adicionando dois mililitros de gelatina a 0,1% diluída em água a uma placa de seis poços e incubando durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A gelatina reveste os poços e serve como matriz para eles.

Agora as células BJ estão prontas para a transdução lentiviral para preparar o vírus para a transdução. Suplemento dois mililitros de meio fresco com seis microgramas por mililitro de poli cérebro e quatro lentivírus, cada um expressando um dos fatores de transcrição humanos. T quatro, SO dois nanog e lin 28, de modo que cada um esteja na mesma multiplicidade de infecção ou MOI.

Esses lentivírus estão todos incluídos no conjunto de lentivírus do fator de reprogramação humana. Para realizar a transdução, basta substituir o meio de crescimento de células BJ pelo meio contendo vírus. Balance suavemente o prato para que o meio cubra uniformemente o fundo.

Incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no mesmo dia. Remova um frasco de células alimentadoras de metanfetamina do nitrogênio líquido e descongele. Remova a solução de gelatina das placas alimentadoras de metanfetamina, que agora são revestidas com gelatina em cada uma.

Bem, adicione 0,2 vezes 10 às quintas células em dois mililitros de crescimento de metanfetamina. Média. Incube o MES durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, retire as células BJ com 0,05% de tripsina EDTA e centrifugue a 200 Gs por cinco minutos.

Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de crescimento. Remova o meio da placa alimentadora de metanfetamina e adicione dois mililitros por poço da suspensão da célula BJ. A concentração de células BJ deve ser de aproximadamente cinco vezes 10 elevado a quarto de células por poço.

Incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 24 horas após o recuo, as células BJ na placa alimentadora de metanfetamina, substitua o meio por ESIP humano que seja caule embrionário ou cultura de células-tronco pluripotentes induzidas. Média. Continue a trocar o meio a cada 24 horas por sete dias.

No sétimo dia, substitua o meio de cultura de células ES por dois mililitros de meio condicionado com metanfetamina. As células alimentadoras de metanfetamina têm fornecido os fatores solúveis necessários para o crescimento de células IPS. Mas agora precisamos adicionar mais desses fatores para manter a cultura saudável.

O meio condicionado com metanfetamina contém todos os fatores solúveis secretados pelas células alimentadoras de metanfetamina incubadas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Examinando o escopo, selecione uma colônia de células. Distinguido por uma pequena cúpula compacta como aparência em uma placa fresca de 24 poços que você precedeu 24 horas anteriormente com ccf uma célula alimentadora de metanfetamina recua a colônia selecionada na cultura humana de ESIP.

Meio suplementado com 10 moléculas-tronco micromolares Y 2 7 6 3 2. Um inibidor dependente de quinase. Mudar o meio de cultura sem suplementar com a molécula-tronco Y 2 7 6 3 2 de 24 em 24 horas durante os primeiros sete dias.

Após sete dias, mude o meio para metanfetamina. A condição para o meio continua a passar pelas células até que elas mostrem a morfologia típica das células ES humanas. Procure por colônias pequenas e compactas que tenham uma borda afiada.

As colônias devem ser uniformes e ter uma alta proporção de núcleo para citoplasma. Neste ponto, você desenvolveu colônias que têm a morfologia das células ES, mas elas também expressam genes característicos das células ES? Para descobrir corar as colônias para marcadores de pluripotência, como TRA 180 1 TRA um 60 SSEA quatro s, SE, um três T quatro sox, dois nanog e SSEA um Para começar a lavar suavemente as células três vezes com PBS.

Em seguida, fixe as células com 500 microlitros de 4%paraform, aldeído ou outro fixador por 20 minutos em temperatura ambiente. Após 20 minutos, lave as células com PB S3 mais vezes para remover o excesso de fixador. Em seguida, bloqueie a ligação inespecífica incubando as células em 500 microlitros de tampão de bloqueio por poço por uma hora em temperatura ambiente Após a etapa de bloqueio, adicione 250 microlitros de anticorpo primário diluído de um a 100 em tampão de bloqueio a cada um.

Bem, incube as células no anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave as células três vezes com PBS para remover o anticorpo primário não ligado. Incubar as células com 250 microlitros de anticorpo secundário diluído de um a 300 e bloquear o tampão por uma hora em temperatura ambiente, mantendo-se longe da luz para evitar o fotobranqueamento após a incubação com o anticorpo secundário.

Lave as células três vezes com PBS até a terceira lavagem. Adicione DPI a um micrograma por mililitro para corar os núcleos. Por fim, analise a expressão gênica de suas células IPS.

Sob os resultados da morfologia do microscópio, quatro células de fibroblastos da pele humana onde o coto transduzido com T quatro SOX dois nanog e lin 28 alterações morfológicas foram observadas já no quarto dia após a transdução e o aglomerado de células tornou-se mais compactado no dia 17 expressão de marcadores de potência plurry. Para caracterizar ainda mais as colônias de células IPS isoladas, procuramos a presença de marcadores de pluripotência comuns expressos em células ES. As colônias exibiram forte atividade de fosfatase alcalina.

Além disso, a imunoquímica ou ICC foi realizada nas colônias de células IPS com um painel de anticorpos específicos para marcadores de pluripotência, incluindo marcadores de superfície TA 180 1, TRA um, 60, SSEA quatro e SS EEA três, bem como marcadores nucleares, T quatro, SOX dois e Nanog. As colônias isoladas de IPS foram positivas para todos os marcadores. Os resultados do ICC mostram que as células IPS exibiram o padrão de expressão de marcadores de pluripotência apropriado, demonstrando que essas células IPS se assemelham muito às células E es humanas indiferenciadas.

Acabamos de mostrar como gerar células IPS reprogramando fibroblastos humanos com células-tronco. Conjunto de lentivírus de fator de reprogramação humana. Ao fazer este procedimento, é importante levar vários fatores em consideração.

Primeiro, a proporção de vírus ativo para alvo pode precisar ser modificada durante a etapa de transdução primária para atingir a eficiência de transdução ideal. Em segundo lugar, a condição de crescimento das células-alvo pode afetar. A reprogramação de células saudáveis e proliferativas é mais passível de reprogramação.

Em terceiro lugar, ao modificar o protocolo para diferentes números de células, recomenda-se que os números das células-alvo sejam ajustados proporcionalmente à área de superfície da placa de cultura. Por fim, a aplicação de inibidores de rochas como Y 2 7 6 3 2 deve ser considerada para ajudar a garantir uma reprogramação bem-sucedida, pois estudos recentes demonstraram sua utilidade em aumentar a sobrevivência humana da colônia yes. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.