Аортального кольца Пробирной

За день до эксперимента:

1. Разрешить BME (уменьшение фактора роста, Cultrex, Trevigen) таять на льду или при температуре 4 ° С; После оттаивания держать на льду, чтобы предотвратить повторное затвердевание.

День эксперимент:

1. Мыши (6-7 недель) должны быть под наркозом, и кровь из.
2. Удаление грудной аорты в чашку Петри заполнены холодной стерильной PBS.
3. Выполните механическую очистку от окружающей жировой ткани. Обратите внимание, во избежание высыхания аорты в любое время.
4. Использование хирургического лезвия, ломтик аорты равномерно в 1 кольца мм. Срез должен быть однородным и чистым.
5. Передача кольца на свежий холодный PBS и держать на льду во все времена.
6. Использование предварительно охлажденный советы пипетки внести в каждую лунку в 48-луночного планшета округлые капли 150 мл холодной BME. Разрешить BME снизится до затвердевают при 37 ° С в течение 20-30 минут.
7. Место одного кольца аорты в верхней центральной части каждого купола. Инкубируйте в течение 10 минут при температуре 37 ° C.
8. На вершине каждого кольца добавить еще 150 мл BME. Инкубируйте в течение 20-30 минут при температуре 37 ° C.
9. Подготовка среды: человеческих эндотелиальных бессывороточной среде (GIBCO, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 2% FCS, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина (Cellgro).
10. Для каждой лунки добавить 500 мл среды, содержащей либо:
    1. Экспериментальные образцы.
    2. Положительный контроль: Эндотелиальная дополнения рост клеток (ЭКГ, конечной концентрации 200 мкг / мл, BD Biosciences).
    3. Отрицательный контроль: Средний одиночку.
11. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 12 дней, фотографии кольца между днями 6 и 12 по стандарту стереоскоп фазового контраста.
12. Дополнительно: Сбор супернатанты.

Примечания:

1. Держите стерильных условиях в любое время.
2. Избегайте введение пузырьков в BME.

Аортального кольца анализ является полезным инструментом на пути к оценке ангиогенеза, а также анти-ангиогенных факторов. Судов, которые растут из аортального кольца набирать гладкомышечных клеток и перицитов общаться с эндотелиальной трубки клетка, а это означает, что они похожи на анатомически neovessels в естественных условиях. Кроме того, кольца аорты мыши анализа держит преимущество широкий спектр трансгенных инструментов, доступных для данного вида. Тем не менее, Есть несколько недостатков аорты анализа кольцо. Во-первых, суда нарост в естественных условиях происходит из микрососудов, а не от крупных сосудов, таких как аорты. Во-вторых, несогласованность в работе с кольцами и количества окружающих тканей, остающихся на судне могут влиять на результат судна. Кольца из различных возрастов аорты или другую мышь и штаммы могут также столкнуться с ангиогенных ответов. И, наконец, результат ангиогенных судна происходит в трех измерениях, что делает его неидеальной фотографировать и количественно. Взятые вместе, когда они выполняются с достаточной внутреннего контроля и с множеством повторов, этого анализа является относительно простым, не дорого, очень информативный и значительно превосходил эндотелиальных культур в своей биологической сложности и значимости.