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 JoVE Biology

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

1, 1, 1

1Thermo Scientific NanoDrop Products

Article
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    Summary

    Échantillons microvolume sont quantifiés par un système qui utilise un spectrophotomètre tension de surface naturelle à conserver des échantillons sans l'utilisation des cuvettes ou des capillaires. La gamme dynamique des concentrations de protéines et de la vitesse à laquelle ils peuvent être mesurés sont fortement augmentées avec cette méthode.

    Date Published: 11/04/2009, Issue 33; doi: 10.3791/1610

    Cite this Article

    Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

    Abstract

    Spectrophotométrie classique exige de placer les échantillons dans des cuvettes ou des capillaires. Cela est souvent impraticable en raison des volumes d'échantillon limitée souvent utilisé pour l'analyse des protéines. Le Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotomètre résout ce problème avec un système de rétention d'échantillon innovantes qui détient des échantillons microvolume entre deux surfaces de mesure en utilisant les propriétés de tension superficielle des liquides, permettant la quantification des échantillons dans des volumes aussi faibles que 0,5 à 2 uL. L'élimination des cuvettes ou des capillaires permet de modifier en temps réel dans la longueur du trajet, ce qui réduit le temps de mesure tout en augmentant considérablement la plage dynamique des concentrations de protéines qui peuvent être mesurés. Le besoin de dilutions est également éliminé, et les préparatifs pour la quantification de l'échantillon sont relativement faciles que les surfaces de mesure peut être simplement essuyé avec le laboratoire essuyer. Cet article présente la vidéo de modifications aux méthodes traditionnelles de protéines de concentration de détermination pour la quantification des quantités de protéines en utilisant microvolume A280 lectures d'absorbance ou le dosage colorimétrique BCA

    Protocol

    I. Le NanoDrop 2000c Spectrophotomètre

    La technologie NanoDrop est basé sur un système de rétention d'échantillon innovant qui utilise la tension de surface de détenir et de mesurer des échantillons microvolume entre deux socles optique sans l'utilisation des cuvettes ou des capillaires. Le NanoDrop 2000c spectrophotomètre utilise cette technologie pour mesurer rapidement et facilement de 0,5 à 2 gouttes uL de protéines, ADN, ARN, et d'autres biomolécules. Cette capacité est devenu plus important que les techniques moléculaires évoluent continuellement à utiliser de plus petites quantités de matériel pour l'analyse. L'idéal pour le spectrophotomètre microvolume conditions dans lesquelles l'échantillon est limité. Cependant, la facilité d'utilisation, cycle de mesure rapide et, et gamme de concentration importante aussi faire le spectrophotomètre approprié lorsque des quantités suffisantes de l'échantillon sont disponibles. Le cycle de mesure est également fortement réduite, aidant les scientifiques d'accroître l'efficacité tout au long de leur flux de travail.

    Le microéchantillon est placé directement sur le dessus de la surface de détection et une colonne de liquide est créée entre les extrémités des fibres optiques par la tension de surface. Cette colonne liquide forme un chemin optique vertical. Un flash au xénon lampe fournit la source de lumière et d'un spectromètre utilisant une matrice linéaire CCD est utilisée pour analyser la lumière qui traverse l'échantillon.

    Retrait de dispositifs de confinement traditionnels tels que les cuves du système a plusieurs avantages: très petites quantités d'échantillons sont nécessaires pour la mesure, le nettoyage nécessite simplement en essuyant les surfaces optiques avec un laboratoire essuyer, et la longueur du chemin peuvent être modifiés en temps réel pendant la mesure.

    La 2000c NanoDrop détermine la longueur du chemin optimal automatique (1 mm à 0,05 mm), offrant la gamme la plus étendue possible des mesures de concentration en protéines sans dilutions. En raccourcissant la longueur du chemin, des concentrations plus élevées de la protéine peut être mesurée. Ceci supprime le besoin d'effectuer des dilutions des échantillons de plus de protéines. Par exemple, le 2000c NanoDrop peut mesurer les concentrations de BSA aussi élevées que 400 mg / mL.

    Le spectrophotomètre NanoDrop 2000c est un spectrophotomètre spectre complet pour mesurer l'absorbance de l'ADN, ARN, protéines, et d'autres biomolécules. Ce protocole vidéo mettra l'accent sur la mesure des protéines.

    II. Détermination microvolume concentration de protéines utilisant A280 mesures d'absorbance

    a. Principe de Mesures A280

    La méthode A280 protéine purifiée est applicable à des protéines qui contiennent du tryptophane, la tyrosine, phénylalanine ou résidus des liaisons disulfure cystéine-cystéine et l'absorbance d'exposition à 280 nm. Cette méthode utilise la valeur d'absorbance A280 en combinaison avec soit le coefficient d'extinction de masse ou le coefficient d'extinction molaire pour calculer la concentration de la protéine purifiée. L'avantage de mesures directes A280 est que la génération d'une courbe standard n'est pas nécessaire pour déterminer la concentration de protéines. Si l'échantillon est une solution de protéines non caractérisées, lysat cellulaire, ou de l'extrait de protéine brute, puis en utilisant l'une des méthodes pré-configuré colorimétrique disponible sur le 2000/2000c NanoDrop, tels que BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry et des essais, est recommandée.

    b. Microvolume protéines A280 Mesures - Démarrage

    1. Sélectionnez l'application A280 de protéines à partir du menu principal.
    2. Sélectionnez le type d'échantillon à mesurer à partir de la liste déroulante. Le réglage par défaut est recommandé pour la plupart des mélanges de protéines inconnues dans lequel une Abs = 1 mg / mL. Si la mesure d'une protéine purifiée précédemment caractérisé, alors soit le coefficient d'extinction de masse ou le coefficient d'extinction molaire et le poids moléculaire peut être saisi pour déterminer la concentration en protéines, plus précisément.
    3. Choisissez les unités de concentration de la liste déroulante.

    C. Mesures microvolume A280 protéines - Blanking

    1. Établir une vierge à l'aide d'un tampon approprié. Il est important d'utiliser le tampon dans lequel la protéine est suspendu. Le tampon utilisé doit être le même pH et d'une force similaire ioniques comme la solution de l'échantillon. Remarque: tampons RIPA contribuent absorbance trop à 280 nm et sont donc incompatibles avec les mesures directes de protéines A280. Pour les protéines en suspension dans un tampon RIPA, il est recommandé de concentration en protéines est déterminée en utilisant un tampon RIPA test colorimétrique compatibles.
    2. Pipeter 2 ul de la solution appropriée d'obturation sur le socle en bas, abaisser le bras et cliquez sur Blank.
    3. Essuyez la solution à blanc par les piédestaux inférieure et supérieure à l'aide d'un laboratoire chiffon sec.

    d. Mesures microvolume A280 protéines de mesure

    Des considérations importantes: L'homogénéité de l'échantillon est extrêmementimportant, car un si petit volume est mesuré. Afin de s'assurer que les échantillons sont homogènes, doucement mais bien mélanger les échantillons immédiatement avant de prendre une aliquote pour la mesure. Évitez d'introduire des bulles lors du mélange et de pipetage.

    En raison de la variabilité de la tension de surface entre les différentes protéines, nous recommandons de charger 2 ul d'échantillons afin d'assurer la formation de la colonne appropriée. Toujours utiliser des embouts de pipette à faible rétention. Pour charger un échantillon, toucher la pointe de la pipette sur la surface inférieure piédestal optique tout en expulsant la solution pour empêcher la solution d'adhérer à l'extérieur de la pointe de la pipette. Expulser moins que le montant total de l'échantillon afin de prévenir des explosions et l'introduction de bulles dans l'échantillon.

    1. Entrez un ID d'échantillon dans le champ approprié, charge 2 pl de l'échantillon d'abord comme décrit pour la mesure de vide et cliquez sur. Une aliquote fraîche 2μL de l'échantillon doit être utilisé pour chaque mesure.
    2. Retirer l'échantillon de l'socles inférieurs et supérieurs à l'aide d'un laboratoire chiffon sec.

    e. Microvolume protéines A280 Mesures de nettoyage

    Une ordinaires, non pelucheux, essuyez-laboratoire est souvent suffisant pour le nettoyage des socles optiques entre les mesures.

    f. Faire protéines A280 Mesures Reconditionnement

    Solutions et réactifs contenant des tensioactifs peuvent incondition les surfaces piédestal de mesure au fil du temps, la prévention de la colonne liquide de l'échantillon pour former. Un aplatissement de la goutte sur la partie inférieure du socle est indicative de la surface optique de devenir inconditionnée. Si les propriétés de surface ont été compromis, le reconditionnement des socles est important pour assurer la formation de colonne de l'échantillon. Si cela se produit, polir la surface optique énergiquement à l'aide de laboratoire ou de l'utilisation essuyez composé piédestal NanoDrop reconditionnement (PR-1) comme indiqué.

    III. Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant des analyses colorimétriques

    a. Principe de détection colorimétrique

    Le spectrophotomètre NanoDrop 2000c peut également être utilisé pour mesurer les solutions de protéines non caractérisées, des lysats cellulaires, et des extraits de protéines brutes en utilisant des dosages colorimétriques.

    Les méthodes colorimétriques sont des méthodes indirectes qui impliquent une interaction d'un colorant avec le composant protéique de l'échantillon pour produire un nouveau complexe qui absorbe la lumière dans les longueurs d'onde visibles.

    Le spectrophotomètre NanoDrop 2000c a plusieurs pré-configuré essais colorimétriques dont BCA, Pierce 660, Bradford, Lowry et méthodes. Le test BCA sera démontré comme un dosage colorimétrique par exemple à l'aide d'un spectrophotomètre microvolume. (Screenshot)

    Le BCA (acide bicinchoninique) dosage est une méthode commune colorimétrique souvent utilisé pour des solutions de protéines diluées et des protéines dans la présence de composants qui ont UV significative (280 nm) d'absorbance. Contrairement à la méthode A280 protéines, la méthode de protéines BCA nécessite que d'une courbe standard être générés avant concentrations de protéines de l'échantillon peut être mesurée.

    La méthode utilise l'acide bicinchoninique (BCA) comme réactif de détection. Le chélate Cu-BCA formés en présence de la protéine est mesurée à 562 nm et normalisé à 750 nm.

    b. Microvolume dosage BCA Assay Mesures de préparation BCA

    1. Les réactifs nécessaires sont contenues dans le kit agent réducteur compatible (Thermo Scientific Pierce chat ne 23250..): Réactif BCA A, B réactif BCA, réactif compatibilité, le tampon de reconstitution, et l'albumine (BSA) aux normes.
    2. Equilibrer tous les protéines inconnues et les normes de protéines à température ambiante et bien mélanger.
    3. Préparer le réactif de travail assez fraîche pour les normes et les échantillons à être mesurée en utilisant un ratio de 50:1 de réactif A: B
    4. Pour le dosage de micro, utilisez un rapport de 1:1 de réactif de travail à l'échantillon. Ajouter 10 uL de travailler réactif pour chaque tube avec des tubes assez pour couvrir tous les échantillons et les normes. Pour le dosage de haute gamme, utiliser un ratio de 20:1 du réactif de travail à l'échantillon. Ajouter 190 ul de réactif de travail dans chaque tube avec des tubes assez pour couvrir tous les échantillons et les normes. Se référer à la littérature Pierce BCA kit afin de déterminer laquelle le rapport est adapté à vos échantillons.
    5. Ajouter 10 uL d'étalon ou d'échantillon dans chaque tube contenant le réactif. Bien mélanger en douceur vortex.
    6. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 30 minutes.
    7. Autoriser les réactions à s'équilibrer à température ambiante (~ 10 minutes).

    C. Mesures microvolume dosage BCA Génération courbe standard

    1. Sélectionnez la méthode BCA protéine à partir du menu principal. Si la fenêtre de vérification de longueur d'onde apparaît, s'assurer que le bras est vers le bas.
    2. Entrez les valeurs pour chaque concentration de l'étalon dans le tableau volet de droite. Le logiciel permet pour la référence et jusqu'à 7 additnormes ional. La référence et / ou des normes devrait être mesuré en répétitions.
      Remarque: L'exigence minimale pour la génération de la courbe standard est la mesure de deux normes ou la mesure de la référence zéro et au moins un standard. Il est recommandé que les normes supplémentaires seront inclus comme nécessaire pour couvrir la fourchette de dosage devrait concentration.
    3. Établir un vide. Le blanc pour les dosages colorimétriques sont généralement déminéralisée H 2 O.
    4. Pipeter 2 pi de dH 2 O sur le socle en bas, abaisser le bras et cliquez sur Blank. Seule une vierge est nécessaire pour couvrir toutes les mesures ultérieures de la référence et les normes.
    5. Établir la référence à la pipette une partie aliquote de 2 pl contenant uniquement un réactif de travail et de tampon avec aucune protéine sur la partie inférieure piédestal. Abaissez le bras et Mesure clic.
    6. Sous l'onglet Standards, sélectionnez le niveau souhaité et la pipette 2 ul de la norme souhaitée sur la partie inférieure piédestal. Abaissez le bras et Mesure clic. Répétez le processus pour toutes les normes. Soyez sûr de mesurer toutes les normes antérieures à des échantillons de mesure. Pour voir la courbe standard cliquez sur Afficher la courbe standard.

    d. Mesures microvolume dosage BCA 2 mesures de protéines uL

    1. Après que toutes les normes ont été mesurées, cliquez sur le bouton échantillons. Entrez l'ID de l'échantillon. Charge 2 uL d'échantillon sur la partie inférieure piédestal et cliquez sur Mesure. Une partie aliquote fraîche 2 uL d'échantillon doit être utilisé pour chaque mesure.
    2. Essuyez l'échantillon à partir du socle inférieure et supérieure à l'aide d'un laboratoire chiffon sec.

    e. Mesures microvolume dosage BCA nettoyage et le reconditionnement

    Effectuer le nettoyage et le reconditionnement comme décrit dans l'A280 directs mesures d'absorbance.

    Les résultats représentatifs:

    La détermination microvolume concentration en protéines est effectué soit par un effet direct A280 mesure ou un dosage indirect colorimétrique. L'exemple le A280 mesure détermine la concentration de protéines basé sur le coefficient d'extinction de la protéine d'intérêt. L'exemple le BCA dosage colorimétrique détermine la concentration de protéines basée sur une courbe standard de concentrations de protéines connues.

    Discussion

    Quantification microvolume utilise les propriétés intrinsèques de tension de surface d'un échantillon pour former une colonne de liquide entre deux surfaces de mesure. L'absence d'un dispositif de confinement, permet la longueur du chemin à changer en temps réel, éliminant la nécessité d'effectuer des dilutions. Cette capacité augmente considérablement la plage dynamique des concentrations de protéines ainsi que la vitesse de mesure. En utilisant des quantités minimes de l'échantillon, un grand nombre d'échantillons peuvent être analysés rapidement et avec précision, permettant aux scientifiques de prendre plus de mesures et d'atteindre un meilleur contrôle de la qualité. En outre, et si nécessaire, de précieux échantillons peuvent être récupérés après la prise d'une mesure. Lorsque ces petits volumes sont mesurés, l'homogénéité de l'échantillon est extrêmement important d'éviter les erreurs d'échantillonnage. Faible embouts de pipette de rétention doit toujours être utilisé pour les échantillons de chargement et les conseils devraient être changés entre l'échantillon répétitions. Les surfaces piédestal doit être correctement nettoyée et conditionnée afin d'assurer des résultats plus précis. Enfin, le spectrophotomètre microvolume est idéal lorsque l'échantillon est limité, cependant, la facilité d'utilisation, la vitesse et une gamme dynamique étendue du spectromètre rendent approprié lorsque l'échantillon est abondante.

    Disclosures

    Les auteurs sont des employés de Thermo Fisher Scientific, qui produit des réactifs et des outils utilisés dans cet article.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
    Laboratory wipes
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
    PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

    References

    1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
    2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
    3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
    4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
    5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
    6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
    7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).

    Comments

    12 Comments

    Hi,
    Could you please tell me how to measure enzyme kinetics in this nanodrop ²000c spec. ?
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 26, 2009, 2:38 PM

    Hi Hemalatha,
    The NanoDrop ²000c software has a kinetics module that allows users to make time-based kinetic measurements with a cuvette. In this module it will output absorbance vs. time data that is easily exported into microsoft excel. For specific questions about enzyme kinetics please contact info@nanodrop.com. Thank you for your interest.
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 28, 2009, 12:58 PM

    Hi,
    Could you please send/publish the graph chart obtained/ or that represents the RNA/DNA/ Protein measured from a sample?
    It would be very helpful for our protein purity.
    And how can we assess that our protein's purity from nanodrop? Is there any graph for those pure protein samples?
    Waiting for your response.
    Reply

    Posted by: Tirth G.November 19, 2010, 12:01 PM

    The user's manuals for each NanoDrop instrument show representative spectra for the chromophores mentioned in the inquiry. These manuals may be accessed via the following links:

    NanoDrop ²000c: www.nanodrop.com/Library/NanoDrop ²000 User Manual.pdf
    NanoDrop 8000: www.nanodrop.com/Library/nd-8000-v².² -users-manual-8.5 x 11.pdf
    NanoDrop 3300: www.nanodrop.com/Library/nd-3300 ².7-users-manual-8.5x11.pdf

    Thank you
    Reply

    Posted by: Philippe D.November 23, 2010, 10:56 AM

    Could you provide details regarding the limit of detection for each protocol, please?
    The time is impoved and it is possible to detect higher amounts of proteins without dilution. However is the nanodrops system suitable for detecting very low amounts of total proteins? One cannot exclude the possibility that this system is more sensitive than classcial ones...
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 12, 2011, 10:27 PM

    Paul,
    The limit of detection for the A²80 protein measurement will ultimately depend on the E1% value of your specific protein. In addition, it will also depend on if you use the microvolume pedestal or a 10 mm cuvette. For example, the lower detection limit for BSA will be 0.1 mg/mL for the pedestal and approximately 0.0² mg/mL when using a 10 mm quartz cuvette.Please note that the Nanodrop ²000c is the model which has the feature for using conventional cuvettes in addition to the microvolume pedestal.

    The BCA colorimetric assay uses either a ²0:1 reagent to sample ratio or a 1:1 reagent to sample ratio which have detection limits of ²00 ug/mL and 10 ug/mL respectively. If you have any further questions please go to http://www.nanodrop.com for more information or contact us at info@nanodrop.com and we will be glad to assist you.
    Reply

    Posted by: Liz G.June 16, 2011, 11:42 AM

    Can the nanodrop also be used for determination of a proteins molar extinction cŒfficient, if a protein solution with known concentration is provided? The protein amino acid sequence and Mw is known, and the protein amount/concentration is known from amino acid analysis. Is this application described in the manual or in an application not?
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 27, 2011, 8:25 AM

    Indeed a wonderful post. I have been studying the chromatography, spectroscopy etc. and do look over the web for latest and informative stuff and just landed on your blog. Thanks for writing such good posts and as I have subscribed to your blog, I do expect that you will be posting nice stuff like this on a regular basis.
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    Posted by: AnonymousDecember 6, 2011, 3:34 AM

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    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 15, 2011, 8:13 AM

    Hi,
    can the nanodrop also be used for determination of a protein concentration at wavelengths: A²15, A²²5, A3²0 nm or another UV- and visible wavelengths?
    Waiting for your response.
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 27, 2012, 8:37 AM

    The NanoDrop ²000/²000c has the capability to measure absorbance at any wavelength between 190 ²11; 840 nm.

    Using a NanoDrop ²000/²000c you could use the UV-Vis module to select the specific wavelength you would like to measure, but we have found that defining a custom method would be a much better way to proceed, especially for samples that may have a large salt concentration at a wavelength other than the wavelengths of interest.

    A technical note that describes using custom methods for protein quantification can be found here: http://www.nanodrop.com/Library/A²05%²0Proteins%²0&%²0Peptides%²0Custom%²0Method.pdf
    Please contact our technical support with any questions at ²11; info@nanodrop.com
    Reply

    Posted by: Russell D.May 21, 2012, 11:12 AM

    How dŒs this instrument account for stray light?
    Reply

    Posted by: Kenneth W.September 25, 2012, 11:06 AM

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