Name: 병아리 예 비켜 문화와 예 비켜 CAM 어세이 : 그게 정말로 작동하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 23 s
Description: 배우세요 병아리 CAM 배아 외 배양 기술을 이용한 혈관신생 및 종양 연구 방법. 이 기술은 암 생물학 연구에 필수적인 생체 내 종양 행동 관찰과 실험 조작을 가능하게 합니다.

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저자는 아낌없이 종양 물질을 공급하는 우수한 기술 지원 및 교수 Ruebben에 대한 J. Kueper 및 J. Wittschier 감사하고 싶습니다.

모든 장비와 시약은 멸균 구입해야하거나 열 또는 증기 소독 또는 70 % ETOH와 소독을해야합니다. 동물 실험 기관에 의해 규정된 동물 실험 절차와 규정에 대한 동물의 보호 및 사용에 관한 NIH의 지침에 따라, 유럽 커뮤니티 이사회 지침 (86/609/EEC)에 따라 수행다고 저자 상태 관리 및 뒤스부르크 - 에센 대학 (독일)에서위원회 (IACUC)를 사용합니다. 1 부 : 달걀 부화 <ol><li> 수정된 달걀은 최대 일주일 13 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 계란은 지속적으로 알을에게 12 번 하루를 회전, 이동 트레이로 인큐베이터에서 수평으로 누워, 72 시간 incubated 수 있습니다. 습도는 60 유지됩니다 - 62%, 37.5에서 부화 온도 ° C. 참고 : 부화, 먼지, 깃털과 배설물을 시작하기 전에 신중하게 오히려 부드러운 표면 구조보다 거친를 일반, 회색 지그재그 손 종이 수건과 마른 닦는하여 기계적으로 계란 껍질에서 제거됩니다. 에탄올이나 살균제와 계란을 닦는 그러나, 크게 관계없이 사용되는 액체의 배아의 생존율을 감소. </li></ol> 2 부 : 예 비켜 문화 <ol><li> 72 시간 배양 후, 계란은 인큐베이터에서 제거됩니다. 참고 : 계란은 72 시간 incubated 있습니다 - 알 수없는 이유지만, 동부 표준시 al.1 아우어 바흐 이전의 개발 단계와 계약을 크게 낮은 생존 요금을했다 - 우리의 실험에 따르면. 단계에서 나중에보다 72시간 아직 CAM이 적용되지 않는 노른자의 색이 얇은되고 작은 준수 분야에서 haemorrhages와 노른자 - 자루의 (2) 파열에 (I) 최고의 알 껍질을 준수하는 경향이 막. 따라서 표시 방법 72 시간보다 오래된 태아에게는 적용되지 않습니다. </li><li> 배가 어느 정도 회전을 저항 이후 배아가있는 계란의 상단 측면은, 연필로 표시됩니다. </li><li> 계란은 맨 위에있는 연필 표시가있는 수평 개최와 계란의 긴 축에 직각 방향을 세우고 80mm 삼각형 자기 저어 막대의 가장자리에 금이 있습니다. 참고 : 더 나은 느낌이 들어, 장갑을 사용해야하지만, 손이 70 % EtOH로 소독해야합니다. 알 껍질뿐만 아니라 계란 막 입을 열 것을 중요합니다. 흰자위의 누출 것은 계란 막이 천공되어있는 안전 기호입니다. </li><li> 계란 흰자위의 추가 유출을 피하기 위해 가까운 페트리 접시의 바닥에 보관됩니다. 참고 : 초기 오프닝 절차 동안, 그것은 페트리 접시의 바닥에 흰 계란은 여전히 내부 상단에있는 배 (胚)와 노른자를 보유하고있는 계란 내부에 진공이 결과로 계란 내부의 나머지에 연결하는 것이 중요합니다 계란. 진공 중 계란에 공기의 유입을 제어 손가락의 압력이나 연결된 흰자위 즉 진공의 열을 증가 계란을 운반하여 조정할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 엄지와 가운데 손가락으로 계란의 균열과 적도를 통해 실행되는 자오선에 압력을 적용하여 그것은 진공을 조절할 수 있습니다. 노른자와 계란이 부드럽게 해제하고 껍질의 두 반쪽이 조심스럽게 분리하는 경우 계란의 내용은 다음 손상 페트리 접시로 전송하실 수 있습니다. 배아와 노른자의 혈관이 손상되지 않은 노른자 위에 누워해야합니다. 참고 : 연필 마크가 상단에 보관하지 않으면 쉘을 크래킹 때 배 (胚)가 다칠 수 있습니다. 계란이 충분히 금이 또는 배아는 (위 참조) 72 시간보다 오래된하지 않는 경우, 노른자의 자루는 껍질 자주 파열로 개. 인큐베이터의 습도가 낮은 60 % 이상 또는 계란이 부화하는 동안 회전하지 않습니다 때 동일한 문제가 발생합니다. </li><li> 전 비켜 문화가 인큐베이터에 반환하고 37.5 ° 38.2 ° C와 60 %의 습도에서 보관됩니다. 인큐베이터가 밀폐 해결되지 (환기 그리드 부분적으로 오픈!)와 뚜껑과 그릇 사이에 스페이서와 특수 배양 접시를 사용하는 경우에는 CO 2 O 2 공급이 필요하지 않습니다. 참고 : 배아의 이동 것은 부화의 첫 번째 일 동안 최소로 보관해야합니다. 높은 사망률 속도에 너무 많은 교반 결과입니다. 부화 일 9 이후부터 태아는 선동에 덜 민감합니다. 죽은 태아가 감염을 피하기 위해 즉시 제거하여야한다. 세포 배양 incubators을 사용하는 경우에는 밀폐 폐쇄하는, O 2 공급 죽는가 아닌 태아에 대한 의무입니다. CAM가 건조하지 않도록하고 배양 온도가 37보다 낮은 경우 ° C는 배아가 너무 느리게 개발 것이다 습도가 필수적입니다. </li></ol> 파트 3 : angiogenesis의 assays에 대한 물질의 응용 <ol><li> Autoclaved 접힌 여과지 (5직경 0.5 mm)을 구멍에 의해 구멍을 뚫는 펀치와 CAM에 적용되는 액체 물질에 대한 자료 (캐리어)를 지원하는 데 사용됩니다. 참고 : 거의 각 이동 통신사 자료 (아래 표 참조) 그것은 개발 CAM 선박 구조 변경으로 부화 일 10시 이전까지 적용 특히, CAM의 자극을 일으켰습니다. 이것은 또한 히드록시 에틸 셀룰로스 호일과 같은 잠재적으로 불활성 물질을 포함, 테플론 스폰지 (PTFE - pledgets), 콜라겐 스폰지, 콜라겐 포일, 멸균 거즈 (면봉), 둥근 덮개 전표, 그리고 실리콘 링, 모든 거짓 긍정적인 결과가 발생하는. 필터 종이는 최소 자극을 일으킬 것 같았다 따라서 우리 assays에 사용되었다. </li><li> CAM 완전히 개발되면, 6까지 다양한 샘플이 적용될 수 있습니다 그들의 영향은 단일 CAM에 비교할 수 있습니다. </li><li> 필터 추가 접종 (3 μg 기본 angiotropin) 또는 버퍼 (5 μl PBS) 건조 방지하기 위해 매일 다시 적용해야합니다. </li><li> 컨트롤이 주변 혈관의 패턴이 변경되지 않은 반면 신청 후 3 일부터 혈관은 필터에 angiogenic 물질을 향해 동쪽을 향하게하다. 참고 : CAM은 노른자 - 자루에 대한 착각해서는 안됩니다. 난황의 자루가 개발하는 동안 약간의 차이로 고정되는 동안 CAM은 역동적인 발전 구조입니다. 개발 지나고 3의 개발 CAM은 작은 소포로 배아의 꼬리 끝에 처음으로 인식된다. 일 셋 일 열 개에서 초기 소포는 증가 속도 노른자의 자루를 overgrowing 접어 두 계층 멤브레인을 작성, 확장합니다. 응용 프로그램 사이트는 달리 배아가 전송 빛의 효과를 미세 관찰 방해로 배아 및 CAM (국경)의 배 사이에 절반해야합니다. CAM은 늘었 때 또는 angiogenic 물질과 필터 internalized됩니다. </li></ol> 파트 4 : CAM에 세포의 접종 세포의 4.1.Preparation <ol><li> 콘플루앙 세포는 피펫의 원조를 사용하여 살균 25 ML 플라스틱 피펫을 사용하여 문화 플라스크에서 팔콘 튜브로 전송됩니다. </li><li> 휴대폰 번호를 추정하기 위해 세포 현탁액의 15 μl은 노이 바 우어 챔버로 전송되고 세포는 현미경으로 수동으로 계산됩니다. </li><li> 팰컨 튜브는 상온에서 1,000 rpm으로 3 분 centrifuged되고 뜨는가 삭제됩니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라, 그리고 예 PKH26 (시그마), 빨간색 형광 라이브 세포막 라벨 키트 물들일 : 라이브 셀 추적, 세포가 원하는 농도 (2x10 7 셀 / ML 여기)를 PBS로 희석하고 있습니다. 원하는 주사 농도 (10 7 셀 / ML) 또는 접종 (3x10 6 셀 / ML)로, 세포는 세포 배양 매체 (DMEM 우선적으로 Dulbecco의 수정 이글의 중간)에 다시 일시 중지됩니다. 다른 세포 농도는 이미 문학 15-17 우리의 경험에 게시된 농도에 따라 주사 접종에 대한 대 적용됩니다. </li></ol> CAM에 세포의 4.2 접종 <ol><li> 반지 (~ 1mm 두께)은 날카로운 메스를 사용하여 1ml 피펫 팁 또는 말초 정맥 카테터 (PVL) 튜브에서 잘라 E6 - E14 여자는 배아 교양 예 비켜의 CAM에 적용됩니다. 참고 : 여러 번 "을보고"하지 시도 하나와 피펫 팁 또는 카테 테르의 튜브를 통하여 줄일 결과 반지에 날카로운 가장자리를 피하기 위해 매우 날카로운 새로운 메스를 사용 했네요. 마이크로 크랙으로 인한 날카로운 가장자리에 대한 현미경으로 반지를 확인하십시오. </li><li> 고리의 크기에 따라 3x10 6 셀 / ML 세포의 20 μl 한 고리에 또는 여러 개의 반지로 분할 볼륨으로 총 pipetted 있습니다. 참고 : 어떤 경우에는 부드러운 근근이 살아가고하여 CAM의 traumatisation은 세포 이식의 17 capillarisation (아래 참조)의 접종을 촉진하기위한 필수 조건, 예를 들어 있습니다. 그러나, CAM의 traumatisation이 의도하지 않거나 종양 세포의 침투 가능성의 연구 예 contraindicative, 반지가 접종에 사용하지 않아야하지만, 세포가 반지 또는 반지의 응용 프로그램으로 직접 적용해야하는 경우 자신이 마이크로 병변을 일으킬 수 있습니다 . 고리를 사용하는 경우 이러한 중량을 최소화하고 CAM의 들여쓰기를 피하기 위해 가능한 한 얇은 절단해야합니다. </li></ol> 제 5 부 : 세포의 주입 Intravitreous <ol><li> 해밀턴 microliter 주사기가 멸균 PBS로 드디어 70 % EtOH와 함께 여러 번 씻어서입니다. </li><li> 마이크로 주사기는 준비 스테인드이나 흠없는 세포 현탁액 (부 4.1 참조)으로 가득합니다. 참고 : 주사 사이트 조심스럽게 바늘을 통해 침투하여 배아 (brain!)의 CAM 또는 인접 구조물의 혈관을 다치게하지 않는, 선택되어야한다. 주사는 절개의 쌍안경에 따라 수행하여야한다. </li><li> 현미경 제어에서신중하게,하지만 빠르게 주사기 바늘로 CAM과 눈 레이어를 관통하고 지속적으로 최대한 20 μl 세포 현탁액 (우선적으로 PBS에 희석) 여자는 배아 교양 예 비켜의 유리체에 10 주사. 참고 : CAM이 바늘로 뚫고 수없는 경우가 부드럽게 두 집게로 쪼개지는가 거의 또는 전혀 혈관이있는 사이트에서 제거할 수 있습니다. </li><li> 바늘이 누설에 의해 주입된 세포 현탁액의 손실을 피하기 위해 눈을 1-2초 유지됩니다. </li></ol> 6 부 : 치킨 사지 봉오리의 해부 <ol><li> 계란은 인큐베이터에서 제거됩니다 부화 3-4일 후 (E3/E4 = 햄버거 해밀턴 (HH) stage18 - 23) </li><li> 계란은 삼각형 자기 저어 막대의 가장자리에 금이와 페트리 접시 (세부 정보 : 2 부 참조)로 전송되며 배아는 봄 가위를 사용하여 원을 절단하여 연결 노른자 혈관의 해부합니다. </li><li> 태아는 작은 드레인 스푼을 사용하여 차가운, 멸균 PBS로 가득 신선한 페트리 접시에 전송하고 친절한 교반하여 세탁합니다. </li><li> 배아는 신중하게 잘 포셉들과 쪼개지는, 멸균 PBS 가득한 및 주변 점막에서 해방 작은 페트리 접시로 전송됩니다. </li><li> 림브 꽃봉오리는 가능한 한 몸에 가까운 microsurgical의 집게로 분리 파악 및 8 - 10 - 하루 지난 호스트 치킨 교양 예 비켜 (절차를 접목 참조)의 CAM으로 전송됩니다. </li></ol> 7 부 : 마우스 사지 봉오리의 작성 <ol><li> 시간 임신 matings이 설정되고 질 플러그가 암컷의 교미에서 감지되는 하루 아침 회임 일 0 지정되어 있습니다. </li><li> 임신 여성은 태아의 개발 (E) 10 13 일 배아에 도달하고 왁스 보드에 고정 자궁 전위에 의해 희생이다. </li><li> 복벽은 정중선을 따라 잘라 피부 펄럭이 핀에 의해 옆으로 고정되고 70 % ETOH로 moistened있다. </li><li> 자궁 모두 뿔을는 추위 PBS로 분리하여 비커로 전학 복부에서 제거됩니다. </li><li> 배아는 분리 배양 접시와 자궁 벽에 전송 및 배아 세포막은 집게의 사용에 의해 신중하게 제거됩니다. </li><li> 림브 꽃봉오리는 스프링 가위를 이용하여 차단하거나 최대한 신체에 가까운 미세 집게로 분리, 쥐었다과 CAM으로 전송됩니다 8-10 일간 된 호스트 치킨 교양 예 비켜 (절차를 접목 참조). </li></ol> 8 부 : 종양 샘플을 수집 <ol><li> 종양 biopsies는 종양 세포 고유의 문화 매체로 가득한이 ML Eppendorf 튜브 (여기서 : Leibovitz의 중간)에 수집하고 실온에서 보관. </li><li> 종양 biopsies는 무균 scalpels로 1-2 mm3 조각으로 절단됩니다. 참고 : 종양 샘플을 너무 작게라면 그들이 너무 큰이라면, 그들은, CAM에 연결하지 않을 수도, CAM 부상 수도과 배아가 죽어 있습니다. </li><li> 생검 표본의 핵심의 일부가의 CAM에 이식할 수 있습니다 8-10 일간 된 호스트 치킨 교양 예 비켜 (절차를 접목 참조). 참고 : 생검의 표면에서 자료를 복용하면 근육이나 결합 조직과 오염의 위험을 증가시킵니다. </li></ol> 파트 9 : 절차를 이식 <ol><li> 사지 꽃봉오리 또는 종양 표본, 8 - 10 - 일 된 여자는 배아 교양 전 비켜가 사용의 전체 개발 CAM의 접목을 위해. </li><li> 이식은 이상 혈관의 Y의 분기점 근처 CAM에 표시됩니다. </li><li> 원하는 응용 프로그램을 사이트에서, CAM은 선택적으로 기저 계층은 그대로두고, 부드러운 근근이 살아가고의 해제 (포셉) 이중 상피 층의 위쪽 peridermal 부분에 의해 상처를 입었어요. 참고 : 출혈이나 모세 혈관의 파열 가시를 피하기 위해 필수 좋습니다. </li><li> 이식은 최소한의 PBS 붙어있는 CAM로 ​​전송됩니다. 이식편에 따라, 그것은 접목도 최종이 과도한 PBS를 제거하기위한도하고 마지막으로 준비 충격 CAM 사이트에 이식할 수있는 CAM의 사이트에 한두 번 배치 수 있습니다. </li><li> 이식은 미세 집게로 쥐었다 및 CAM에 계층입니다. 이식편의 민감도에 따라, 빛의 압력 (종양 샘플에 적합) CAM의 결과 들여쓰기에 책략 그래프트를 (사지 꽃봉오리에 적합하지 않음) 적용할 수 있습니다. 참고 : 여자는 면역 시스템이 배아 일 (E) 18 개발로 호스트 여자는 배아가 자주 죽는 등 전 비켜 xenografts 문화가 E17 이상 연장해서는 안됩니다. 그것은 선택의 기증자 조직의 원천과시기가 우연히 일치 한거라 각각 사용 가능한 호스트 카메라, 병아리의 배아 교양 예 비켜을 가지고하는 것이 중요합니다. </li></ol> 부품 10 : 다시 접목 <ol><li> 호스트 여자의 배아가 잘린에 의해 살해됩니다. </li><li> 함께 CAM첨부된 이식은 뾰족한 가위로 원형 절단하여 제거하고 PBS로 가득 페트리 접시로 전송됩니다. </li><li> 과도한 CAM은 이전 첨부 파일 사이트를 제외한 봄 가위로 이식에서 절단됩니다. </li><li> 큰 종양 샘플의 경우, 이식은 반쪽 또는 여러 작은 조각으로 절단하고 두 번째 호스트의 새로운 CAM 직면하고있는 첨단과 함께 다시 이식할. </li></ol> 파트 11 : 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 셸 - 적은 닭고기 문화 배양 접시에 여러 개발 단계 교양 예 비켜의 치킨 배아. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 예 비켜 캠 angiogenesis 분석 수정된 닭고기 달걀은 37 수평 incubated ° C와 60 습도 했어요 - 62%가와 배아 일 4 (E4)에서 배양 접시에 금이​​. 부화는 동일한 조건에서 계속되었다. E10 멸균 여과지 (직경 5.5 mm)의 CAM 위에 겹쳐 있었다 5 μl PBS 또는 angiotropin6 기본 3 μg과 중 절어. 모세 혈관 E14에서 angiotropin 젖었 여과지 대한 명백한 정렬을 보여주었다. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 사지 꽃봉오리의 접목 그림 3. 예 비켜 병아리 (E3/E4)와 마우스 (E13)에서 림브 꽃봉오리는 쉘 적은 닭고기 문화의 CAM에 이식할했다. CAM에서 혈관이 이틀 후에 사지 봉오리를 입력했습니다. 사지 꽃봉오리의 개발이 전 비켜 문화가 여자의 두 지골 단계에 도달하고 murine 사지 꽃봉오리에서 인터 거미줄의 감소를 표시하는 지속. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 종양 샘플의 전 비켜 접종 방광 암종의 생검 샘플은 10 일 된 여자는 배아 교양 예 비켜의 CAM에 주사했다. 문화 이틀 후, 종양 표본은 캠 vasculature에 연결된과 7 일 후에, 그래프트를 입력 여러 혈관이 관찰되었다.

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<li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).</li>
<li>Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
</ol>

혁신 아니면 그냥 다른 아가씨 문화 프로토콜? 전 쉘 적은 문화 프로토콜과 함께 여자는 태아 1-4 전체 생존 요금은, 예를 들어 CA 낮은되었습니다. 30% 1. 이 비디오 문서에 설명되어있는 세련된 전부 비켜 문화 프로토콜은, 대조적으로, 50 % 이상 생존 속도를 허용합니다. 비켜 문화의 고전에 비해 여자는 배아의 전 비켜 문화 크게 CAM과 여자는 배 (胚)의 접근을 용이하게하고 실험 조작 및 지속적인 모니터링이 가능합니다. 이 문화 메소드는, 여자의 배아 아이 7-9의 유리, intravasation의 assays 10-12의 촉진 주사로 향상된 angiogenesis의 assays 5,6,에 이르기까지 응용 프로그램의 광범위한 사용 접목 및 사지 꽃봉오리 13 성장을 향상시킬 수 종양 샘플 1...

<table><tbody><tr><td>수정란</td><td>동물</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스</td><td>동물</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전식 알 트레이가 장착된 Incubator Type 3000</td><td>도구</td><td>Siemens AG</td><td>9503</td><td>37°C로 유지하십시오.&amp;#x00B0;상대 습도가 60% 이상으로 설정된 C</td></tr><tr><td>난각 부화기 BSS 160</td><td>도구</td><td>그룸바흐, 독일</td><td>8101</td><td>37-38°C로 유지하고 상대 습도는 60% 이상으로 설정하십시오.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>PBS는 차가운 상태여야 합니다(&lt;strong&gt;&amp;gt;&lt;/strong&gt; 4&amp;#x00B0;C) 및 멸균된</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;수정된 이글 배지(modified eagle medium)&amp;rsquo;배지</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 6429</td><td>DMEM 배양액</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;L-15 배지</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>31415-029</td><td>여기에: 종양 샘플용 수집 배지</td></tr><tr><td>종양 세포 특이적 배지</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>각 연구 그룹은 종양 세포 배양에 사용하는 배지나 Leibovitz와 같은 일반적인 배양 배지를 사용해야 합니다.&amp;rsquo;배지 또는 Dulbecco&amp;rsquo;수정된 이글 배지(modified Eagle's medium)&amp;rsquo;배지&lt;br/&gt;15% 태아 송아지 혈청(FBS), 4mM L-글루타민 및 50 &amp;#x03BC;M 인슐린</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 스터 바, 삼각형 80 mm</td><td>도구</td><td>VWR international</td><td>442-0391</td><td>삼각형 마그네틱 스터 바를 사용하면 달걀 껍데기에 균열을 내기에 용이합니다.</td></tr><tr><td>포셉 DUMONT #5 </td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>베벨 형태의 매우 가는 샹크(팁 크기 0.05 mm x 0.02 mm)</td></tr><tr><td>포셉 DUMONT #7</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>곡선형 섕크 (팁 크기 0.07 mm x 0.10 mm)</td></tr><tr><td>스프링 가위, 직선형, 8cm</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>미세하고 작은 직선형 칼날</td></tr><tr><td>미세 홍채 가위, 직선형</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>CAM을 절제하는 데 사용하십시오.</td></tr><tr><td>표준 가위, 직선형, 예리한 끝/뭉툭한 끝</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>참수 또는 경추 탈구에 사용</td></tr><tr><td>마이크로리터 시린지 1702 TLLX, 25 &amp;mu;l</td><td>도구</td><td>Hamilton Co</td><td>80222</td><td>유리체 내 주입을 위한 사용</td></tr><tr><td>Hamilton 33-G 바늘 (15 mm)</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>18073-15</td><td>유리체 내 주입을 위한 사용</td></tr><tr><td>멸균 메스</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>종양 샘플 해부를 위해 사용하십시오</td></tr><tr><td>소형 배수 스푼</td><td>도구</td><td>Geuder</td><td>15758</td><td>소형 닭 배아의 이송에 사용함</td></tr><tr><td>고정 핀이 부착된 왁스 보드</td><td>도구</td><td>자체 제작</td><td></td><td>해부용 동물 고정에 사용함</td></tr><tr><td>페트리 접시 60 x 15 mm</td><td>도구</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 92 x 16 mm</td><td>도구</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>82.1472</td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시 100 x 20 mm</td><td>도구</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>매우 깊으며, 통풍을 위한 스페이서가 포함됨</td></tr><tr><td>비커</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>300-600 ml</td></tr><tr><td>FALCON 튜브</td><td>도구</td><td>Falcon BD</td><td></td><td>15 ml 및 50 ml</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>도구</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>1.5 ml 및 2 ml</td></tr><tr><td>1ml 피펫 팁</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>물질 또는 세포 적용을 위한 플라스틱 링 절단 시 사용</td></tr><tr><td>말초 정맥 카테터 (PVL)</td><td>도구</td><td>비고&amp;#174;</td><td></td><td>물질 또는 세포 적용을 위해 튜브에서 실리콘 링을 절단하는 데 사용하십시오.</td></tr><tr><td>피펫 및 팁</td><td>도구</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 처리된 접이식 필터 595 1/2, 직경 110 mm</td><td>도구</td><td>Schleicher Schuell</td><td>311643</td><td>CAM에 가장 적은 자극을 유발한 운반체; 본 논문에 사용됨</td></tr><tr><td>PTFE-Pledget, 비흡수성, 6.3 x 152.4 x 1.6 mm</td><td>도구</td><td>santec-medical</td><td>REF 277, LOT 832/511-1</td><td>운반체; 위양성 결과 유발</td></tr><tr><td>하이드록시에틸셀룰로오스 Tylose H 100000</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>Kollidon 17 PF와 혼합된 담체; 위양성 결과 유발</td></tr><tr><td>Kollidon 17 PF</td><td>시약</td><td>BASF</td><td>S30200</td><td>Hydroxyethylcellulose와 혼합됨; 위양성 결과 유발</td></tr><tr><td>Collagen Biomatrix TissuDura</td><td>도구</td><td>Baxter International Inc.</td><td>참조 B2246000999999</td><td>운반체; 위양성 결과 유발</td></tr><tr><td>원형 유리 커버슬립, 11mm</td><td>도구</td><td>독일 보조원</td><td>1001/0011</td><td>운반체; 위양성 결과의 원인</td></tr><tr><td>우성 콜라겐 스펀지</td><td>도구</td><td>Wyeth Animal Health</td><td></td><td>운반체; 위양성 결과 유발</td></tr><tr><td>Resodont 흡수성 콜라겐 막</td><td>도구</td><td>Resorba Woundcare Germany</td><td>LOT 280303</td><td>캐리어; 위양성 결과 유발</td></tr><tr><td>부직포 면봉</td><td>도구</td><td>Fink Walter GmbH</td><td>참조 328132</td><td>운반체; 위양성 결과 유발</td></tr></tbody></table>

병아리 예 비켜 문화와 예 비켜 cam 어세이 : 그게 정말로 작동하는 방법

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

번식의 초기 단계에 치킨 계란은 체외에서 생체내 시스템의 사이에 있으며, angiogenesis를 공부뿐만 아니라 tumorigenesis를 공부뿐만 아니라 혈관 테스트 환경을 제공합니다. 여자 chorioallantoic 막 (CAM)가 개발되면, 그 혈관 네트워크는 쉽게 액세스할 수 조작하고 관찰하고 따라서 angiogenesis의 assays에 대한 최적의 설정을 제공합니다. 림프 시스템이 완전히 부화의 늦은 단계까지 개발이 아니므로, 여자의 난자는 종 특정 제한없이 이식할 조직 및 세포를 유지 수있는 자연 immunodeficient 호스트로 제공하고 있습니다. 개발 육성 이외에 allo을하고 xenografts, CAM의 혈관 네트워크는 종양 세포 intravasation, 보급, 그리고 혈관 체포와 체포 세포 마이크로 전이성 foci를 형성 extravasate 저장소를위한 고유 지원 환경을 제공합니다. 실험 목적을 위해, 최근 연구의 대부분의 CAM은 알 껍질을 통해 창문을 절단하고 실험 관찰과 효과의 사진을 문서에 대한 CAM과 가능성의 접근에 상당한 제한의 결과로, 비켜에서 실시되었다하여 노출되었습니다. 전혀 게시된 경우 여자는 배아의 쉘 적은 문화가 1-4 사용했을 때, 어떤 실험 자세한 내용은, 제공하지 않으며 있었다 이러한 문화의 생존 요금이 낮은되었습니다. 우리는 계란 내용의 이성적으로 제어 압출을 도입하여 크게 여자는 배아의 전 비켜 문화의 방법을 정제. 이 전 비켜 문화는 효과의 생체내 문서에 쉽게 활성화 및 배아의 실험 조작을 촉진, CAM 및 여자 태아의 접근을 향상시킵니다. 이것은 과학적인 질문이 다수를 성공적으로 응용 프로그램을 수행할 수 있습니다 (1) 개선 angiogenesis 분석 5,6로, (2) 실험 (3), 여자는 배아 아이 7-9의 유리체에서 촉진 주사에 대한 설정 의 보급과 intravasation위한 테스트 환경 (5 닭고기와 마우스 13은 잘 사지 꽃봉오리의 성공적인 이식과 문화에 대한 개선 유지 시스템으로 CAM 10-12에 주사를 설립 세포 라인에서 종양 세포 (4) 분산으로 )에 대한, 접목 전파 및 CAM 14 표면에 biopsies에서 얻은 탄탄한 기본 종양 조직의 다시 접목. 이 비디오를 문서에서 우리는 세련된 여자는 전 비켜 문화와 50 % 이상 생존 속도 CAM 분석의 설립을 설명합니다. 게다가 우리는 과학 응용 프로그램의 많은에 대한 예 비켜 문화의 성공적인 응용 프로그램의 단계 시범에 의해 단계를 제공합니다. 다니엘 S. 도일, 수잔느 D. 파사, 그리고 세바스찬 Gustmann이 연구에 동등하게 공헌했습니다.

병아리 chorioallantoic 막 (CAM)은 angiogenesis와 tumorigenesis을 연구하는 독특한 자연 immunodeficient 지원 문화 환경입니다. 이 비디오 기사는 여자의 서로 다른 단계를 보여줍니다<em&gt; 예 비켜</em&gt; 문화, 가능성 angiogenic 물질 및 CAM의 표면에 종양 세포와 조직을 성공적으로 접종의 응용 프로그램입니다.

병아리 예 비켜 문화와 예 비켜 CAM 어세이 : 그게 정말로 작동하는 방법

초기 배아 단계의 닭 달걀은 인비트로(in vitro)와 인비보(in vivo) 시스템의 중간 단계로, ...를 연구할 수 있을 뿐만 아니라 혈관 테스트 환경을 제공합니다.

안녕하세요, 저는 Susan Paa입니다. 독일 Burg Esen 대학교 생화학 내분비학과의 생리화학 연구소 소속입니다. 안녕하세요, 저는 Daniel Ze Basian Dole입니다.저는 Susan과 같은 기관 소속입니다. 안녕하세요, Burg 대학교 신경해부학 연구소의 Mann입니다. 저희가 CH X 배양 및 공동 막 분석법(co membrane assay)의 실제 작동 방식을 보여드리겠습니다.이제 실험실로 가보겠습니다. 대부분의 최근 실험 연구에서는 난각에 창을 내어 CAM(닭의 장막)을 노출시켰으며, 실험은 난내(in ovo)에서 수행되었습니다. 이로 인해 CAM에 대한 접근성이 크게 제한되었고, 효과에 대한 관찰 및 사진 기록 가능성에 한계가 있었습니다. 닭 배아의 난외(ex ovo) 배양은 CAM과 닭 배아에 대한 접근성을 상당히 용이하게 해줍니다.배아가 박동하는 심장을 통해 효과를 쉽게 in vivo로 기록하고 실험적 조작을 수행할 수 있는 모습을 확인하십시오. 본 비디오 논문에서는 다양한 과학적 질문에 X ovo 배양법을 성공적으로 적용하는 과정을 단계별로 시연하겠습니다. 알은 트레이가 움직이는 배양기 내에서 배양됩니다.여기에서 가열 요소와 트레이 이동 장치가 하루에 12회 지속적으로 알을 회전시키는 것을 볼 수 있습니다. 습도는 배양기 바닥의 플라스틱 용기에 물을 추가하여 60%로 유지하며, 배양 온도는 배양 시작 전 37.5 °C로 설정합니다. 알껍질에서 오물, 깃털 및 배설물을 조심스럽게 제거하되, 에탄올이나 소독제로 알을 기계적으로 닦아내면 배아의 생존율이 현저히 낮아집니다.알을 인큐베이터의 이동 트레이 위에 수평으로 배치합니다. 각 알이 자유롭게 회전할 수 있도록 알 사이에 충분한 간격을 유지하십시오. 72시간 동안 배양한 후, 알을 인큐베이터에서 꺼내 배아가 위치한 알의 윗부분을 연필로 표시합니다.배아가 어느 정도 회전에 저항하며 이곳에 위치해 있으므로, 보다 정확한 감각을 위해 알을 깰 때는 장갑을 사용하지 않아야 하며, 대신 손을 70% ethanol로 소독해야 합니다. 알의 윗부분에 연필로 표시를 한 뒤 수평으로 잡고, 삼각 자석 교반바의 가장자리를 이용하여 깹니다. 깨는 과정에서 힘을 최대한 정밀하게 조절하기 위해 팔꿈치를 실험대 위에 올리지 않아야 합니다. 알을 깰 때 난각과 난막이 모두 열리는 것이 중요하며, 흰자가 흘러나오는 것은 난막이 관통되었음을 나타내는 확실한 징후입니

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 새로운 문화, 병아리의 배아는 최대 24 시간까지 계란 이외의 양식하는가하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 초기 개발 (14 솜으로 원시적인 승리.) 마우스 E7 - 9에 해당하는 기간 동안 공부를 하나 있습니다. 이 기술의 응용은 현장 하이브리드화과 immunohistochemistry에 electroporation을 포함합니다.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

이 문서에서는, 우리는 장기 사용하는 간단한 방법을...

전 비켜</em이미징 및 미세 애플 리케이션에 적합> 치킨의 배아 문화 시스템

<em&gt; OVO에서</em육종을위한 Xenograftmodel으로&gt; CAM-분석

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

발달 중에 닭 배아를 보고 접근하는 것은 어려울 수 있습니다. 우리는 간단하고 비용 효율적이며 교실이나 연구 환경에서 쉽게 사용할 수 있는 ex ovo 방법을 개발했습니다. 이 방법은 배아가 배아 발달의 후기 단계로 들어갈 수 있도록 합니다(HH 40).

최적화 전 비켜 개발의 고급 단계에 병아리 배아의 배양

병아리 융모대질막(CAM)은 면역결핍이며 혈관화가 심하여 종양 성장 및 혈관 신생의 자연스러운 생체 내 모델입니다. 이 프로토콜에서는 CAM 분석을 사용하여 3차원, 혈관화된 간세포 암종(HCC) 종양을 성장시키는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

여기서는 입체적 정상 조직 절편에 살아있는 종양 세포의 침윤을 연구 프로토콜을 제시한다. 이 기관 배양 기술은 주로 시험 관내에서 잠재적으로 항 - 침습 약물을 시험에 적용된다.

테스트를위한 병아리 심장 침략 분석 암 세포의 침윤과 잠재적 안티 침략 화합물의 활동

여기에서는 투과광과 형광 현미경을 사용하여 타임 랩스 이미징을 위해 병아리 배아를 배양하는 새로운 기술을 소개합니다. 수중 여과지 샌드위치는 액체 배양 배지에 완전히 잠긴 병아리 배아를 배양할 수 있는 잘 정립된 여과지 운반 기법1의 변형입니다.

장기를위한 잠수 필터 종이 샌드위치 예 비켜 시간 경과 영상

조류 배아의 융모막 막 (CAM)은 다양한 연구 분야에 매우 유용하고 적용 가능한 도구입니다. 일본 메추라기 CAM의 특수 ex ovo 모델은 광 역학 치료 조사에 적합합니다.

메추라기 융모막 막 - 광 역학 진단 및 치료를위한 도구

여기에서는 인간 난소 조직을 위한 병아리 융모막 이식(CAM) 이종 이식 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명하고 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술 기간 및 6일 이식 기간 동안 조직 생존력을 입증합니다.

난소 조직 이식을 연구하기 위한 도구로서의 병아리 맥락막 막(CAM) 모델

배우세요 병아리 CAM 배아 외 배양 기술을 이용한 혈관신생 및 종양 연구 방법. 이 기술은 암 생물학 연구에 필수적인 생체 내 종양 행동 관찰과 실험 조작을 가능하게 합니다.

병아리 예 비켜 문화와 예 비켜 CAM 어세이 : 그게 정말로 작동하는 방법

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