Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2

1Department of Hematology and Oncology, Children’s Hospital Boston, 2Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School, 3Department of Medical Oncology, Dana Farber Cancer Institute

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 50.19.155.235, User IP: 50.19.155.235, User IP Hex: 840145899

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645, doi:10.3791/1645 (2009).

Abstract: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

العلاج من تعاطي المخدرات من الحيوانات كله هو أداة أساسية في أي نظام نموذجي للدراسات الجينية الدوائية والكيميائية. الوريد (IV) الحقن وغالبا ما يكون الوسيلة الأكثر فعالية وموسع للتسليم وكيلا للاهتمام. في الزرد (

Protocol: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

الجزء 1. إعداد مواد الحقن

  1. TG (غلوبين : GFP) الخلايا :
  2. تنزف الكبار الأسماك باستخدام المانحة 10ul غيض ماصة المغلفة في الهيبارين (1unit/ul) للأسماك وراء ثقب الخيشومية.
  3. نضح خلايا الدم الحمراء والاستغناء العازلة في الخلية (PBS 0.9X + 5 ٪ + FBS القلم 1 ٪ / بكتيريا).
  4. التعليق على تصفية خلية شبكة 40uM وتحديد تركيز الخلايا باستخدام عدادة الكريات كما هو موضح سابقا لوبلان وآخرون.
  5. تدور في أسفل وresuspend العازلة التركيز المطلوب في الخلية بحيث النهائي حجم الحقن ليست أكثر من 5ul. نحن هنا حقن الخلايا 1،5-2٬000٬000 / المتلقي.
  6. ل، ديكستران ® الأحمر ولاية تكساس ، في إذابة الصبغة DPBS لحقن تركيز النهائي من 10-12 ملغ / مل. خطة لضخ 4 UL في الأسماك.

الجزء 2. حقن

  1. تخدير الأسماك في tricaine (4.2ml الأسماك tricaine/100ml (4mg/ml) الماء).
  2. غسل هاميلتون حقنة 3-4 مرات قبل الحقن باستخدام الايثانول 70 ٪. شطف 3-4 مرات مع DPBS 0.9X.
  3. مكان الأسماك الجانب الظهري صعودا وتواجه الحق على اسفنجة رطبة.
  4. عقد المحقنة هاميلتون مع يدك اليمنى ومع السبابة الخاص بك على المكبس. استقرار الجسم بلطف من الاسماك مع يدك اليسرى.
  5. موقف إبرة مع شطبة مواجهة بحيث لو عين السمكة ليالي كانت مدار الساعة ، والإبرة سيكون لافتا في موقف 7:00 و بزاوية 45 درجة للأسماك (الشكل 1).
  6. ادخال الإبرة بلطف 1-2 ملم في 7:00 الموقف وتخفض ببطء الغطاس.
  7. السماح للأسماك في المياه لاسترداد E3 الطازجة.
  8. غسل الإبرة ، على النحو الموصوف أعلاه ، وبين حقنا من الكواشف المختلفة.
  9. نفض الغبار حل الخلية إلى الخلايا resuspend كل بضع دقائق لمنع تكتل الخلية.
  10. إبقاء الأسماك قبالة تدفق لل1 الاسبوع مع تغيير الماء يوميا لتجنب العدوى. واصلنا الأسماك في المياه وحدة العناية المركزة لهذه الفترة (10ML معطف الإجهاد + + pemafix 5mL melafix 5mL لكل لتر ماء 38 E3).

الجزء 3. ممثل النتائج

عندما يقوم بشكل صحيح ، فمن الممكن تصور المادة إذا كان قد تم حقنه تسميته في بعض الطريق. على سبيل المثال ، تيراغرام (غلوبين : GFP) ينبغي أن ينظر إلى خلايا الدم الحمراء تحت المجهر تشريح الفلورسنت المتداولة في الأوعية الدموية للأسماك كاسبر المتلقي قريبا بعد الحقن كما هو مبين في الشكل 2. وبالمثل ، يمكن حقن ديكستران 70kDa ، مترافق الى تكساس الأحمر ® يمكن تصور في الأوعية الدموية للأسماك شفافة مباشرة بعد الحقن الرجعية المدارية (الشكل 3). خلايا الكلى من الفلورسنت تيراغرام (β - أكتين : GFP) ويمكن أيضا أن تحقن الأسماك المانحة الرجعية orbitally المشع في كاسبر الأسماك المستفيدة. وهذه الخلايا في نهاية المطاف إلى المنزل نخاع المتلقي (الشكل 4A) ، وربما يذهب بعد ذلك الى اعد اسكان الكلى بعد عدة أسابيع (الشكل 4B).

إذا كان الحقن ضحل جدا أو زاوية الإبرة يتجاوز الجيب الوريدي الرجعية جوف الحجاج ، قد حقن المواد يمكن تصور تجمع حول العين او تدفق للخروج منه. بدلا من ذلك ، إذا كان الحقن العميق جدا ، قد الأسماك تجربة تلف الأنسجة أو النزيف ، على الرغم من أنها قد لا يزال يتعافى. عندما يقوم بشكل صحيح ، يجب أن معدل وفيات بعد الرجعية المدارية الحقن يكون أقل من 5 ٪ من مجموع السمك حقن ونجاح التسليم إلى مجرى الدم يجب أن تكون أكبر من 90 ٪ من مجموع السمك حقن.

الشكل 1
الشكل 1 : رسم توضيحي للتقنية الحقن الرجعية المداري. ويمثل العين اليمنى من الاسماك كساعة التماثلي الذي كرامي seven موقف يتوافق مع البقعة الحقن الصحيح.

الشكل 2
الشكل 2 : تيراغرام (غلوبين : GFP) خلايا الدم الحمراء في الأوعية الدموية المنتشرة في ذيل سمكة كاسبر الكبار بعد ثلاثة أيام من الرجعية المدارية الحقن.

الشكل 3
الشكل 3 : حقن الناجح لديكستران 70kDa مترافق الأحمر إلى ولاية تكساس ® تستخدم صبغة الفلورسنت تنتج الأوعية الدموية في الأسماك البالغة شفافة ، كاسبر وينظر بسهولة باستخدام معيار المجهري مضان كل الحيوانات.

الشكل 4A
الشكل 4A : ثلاثة أيام التالية الرجعية المدارية حقن خلايا نخاع الكلى كله من تيراغرام (β - أكتين : GFP) الأسماك المانحة ، وخلايا يمكن تصور صاروخ موجه للنخاع الكلى المشع الكبار كاسبر الأسماك المستفيدة.

الشكل 4B
شخصية4B : أربعة أسابيع بعد الرجعية المدارية حقن خلايا نخاع الكلى كله من تيراغرام (β - أكتين : GFP) الأسماك المانحة ، وإعادة تعمير الكلى المتلقي مع الجهات المانحة كلها خضراء خلايا نخاع الكلى يمكن تصور أخلاقي المشع في كاسبر الأسماك المستفيدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

الرجعية المدارية الحقن في الزرد الكبار يعطي أعلى كفاءة تسليم المواد الى مجرى الدم حقن مع أدنى معدل للوفيات. نظرا لطبيعة المكان الحقن ، وثقب ويبدو أن تلتئم بسرعة ، والحد من حدوث العدوى وكمية من فقدان الدم. بل قد تكون في موقع حقن مرارا خلال فترة زمنية قصيرة لحقن يومية من الأدوية ، على سبيل المثال.

يجب شراء كميات كبيرة من المخدرات لطرق العلاج التقليدية في الأسماك البالغة التي الأسماك مغمورة ببساطة وغارقة في المياه التي تحتوي على المخدرات من اهتمام. ومع ذلك ، إذا تم حقن الدواء مباشرة في مجرى الدم من الحيوان ، وهناك حاجة إلى كمية أقل من ذلك بكثير لتلقي العلاج ، وبالتالي تقليل التكاليف التجريبية. لبعض المركبات التي تكون كبيرة جدا لدخول تداول الأسماك من خلال تمرغ في حالة من الببتيدات معينة ، قد الرجعية المدارية حقن أيضا أن تكون مفيدة.

كذلك ، لأن الحقن ريال عماني هو أسرع وأسهل من تقنيات الحقن داخل القلب في الأسماك الكبار ، وآخر قد طلب من ريال عماني وتشمل الحقن البالغين الفحص الكيميائي الجينية. وبالتالي ، قد الرجعية المدارية الحقن تسهل كثيرا البحث الزرد الكيميائية أو المواد الكيميائية التي تتطلب التسليم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

Acknowledgements: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

ويؤيد هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي ومنحة من المعاهد الوطنية للصحة لدراسة تكون الدم الجنيني.

Materials: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

Name Company Catalog Number Comments
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich 2106 Preweighed vial of 300 USP units
Tricaine-S Western Chemical MS-222
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14190-144
Dextran, Texas Red® Molecular Probes, Life Technologies D1830
E3 5mM NaCl
0.17 mM Kcl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
Microliter Syringe Hamilton Co 80300 701N 10uL SYR (26s/2/2)

References: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

  1. Steel, C.D., Stephens, A.L., Hahto, S.M., Singletary, S.J., Ciavarra, R.P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
  2. Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961, (1964).
  3. White, R.M., Sessa, A.S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C.E., Zon, L.I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189, (2008).
  4. LeBlanc, J., Bowman, T.V., Zon, L.I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. 2, 159, (2007).

Ask the Author: الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter