Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros

O seguinte foi produzido por pesquisadores da Universidade da Geórgia e da Warnell School of Forestry and Natural Resources. Este vídeo de demonstração descreve a colheita de xilema e tecido phem e subsequente isolamento de RNA de Pinus, comumente conhecido como pinheiro lob, que é a espécie de conífera mais importante para a produção de produtos florestais nos Estados Unidos. Uma vez que a árvore é reprovada, neste caso, uma árvore de 40 anos, o caule principal é cortado em parafusos de aproximadamente 50 centímetros de comprimento.

O parafuso é então marcado longitudinalmente com a motosserra em vários lugares para facilitar a remoção da casca. Usando um martelo e um cinzel de madeira, a casca é acesa até que possa ser descascada em seções. Em seguida, o tecido que flui é removido manualmente e é retirado de dentro das seções da casca e imediatamente imerso em nitrogênio líquido.

Uma vez que a casca tenha sido removida, a fina camada de xilema secundário pode ser coletada raspando a superfície do parafuso com uma lâmina de barbear de um lado. O tecido aquoso do xilema é imediatamente colocado em nitrogênio líquido. Nesta colheita, também coletamos amostras de madeira de reação, comumente chamada de compressão e madeira oposta antes de cortar os galhos do caule principal.

A orientação do membro é primeiro marcada com tinta spray para que as áreas que contêm os dois tipos de tecido opostos à madeira na parte superior do membro e à madeira de compressão na parte inferior possam ser determinadas. Durante a remoção da casca. Os galhos são primeiro marcados com uma motosserra ao longo de linhas delineando a compressão e a remoção oposta da madeira e da casca é realizada como com os parafusos da haste principal, exceto que apenas a casca na região correspondente ao tipo de reação.

A madeira que está sendo colhida é removida a qualquer momento. Normalmente, é mais difícil remover grandes seções de casca desses membros menores. As amostras de madeira de reação do xilema secundário são coletadas da mesma maneira que com o xilema secundário normal, raspando com a lâmina de barbear e imersão imediata em nitrogênio líquido.

Observe a cor marrom avermelhada característica da madeira de compressão. Vale ressaltar que coletar e processar várias amostras de uma grande árvore requer muitas mãos, com cada pessoa envolvida realizando uma tarefa designada para que todos os tipos de tecido sejam coletados simultaneamente para ajudar a reduzir a degradação do RNA, amostras congeladas e nitrogênio líquido são posteriormente removidas para sacos de armazenamento rotulados e colocadas em gelo seco para transporte de volta ao laboratório. Nosso primeiro passo é pulverizar o tecido usando um moinho congelador modelo 68 50 em comparação com a moagem com um almofariz e pilão, a etapa aumenta significativamente os rendimentos de extração de RNA para amostras de tecido lenhoso, mantendo as amostras frias com nitrogênio líquido.

O tecido é primeiro quebrado em pedaços menores à mão e colocado na câmara de amostra. A câmara é inserida no suporte travado no lugar e a amostra é moída por dois minutos. O produto final tem a consistência de um pó grosso.

O protocolo de extração de RNA é um processo de dois dias. No primeiro dia, 2,5 gramas de tecido congelado são adicionados ao tampão de extração de RNA que foi aquecido a 65 graus Celsius. A amostra é agitada vigorosamente para misturar, e um volume igual de clorofórmio é adicionado e a amostra é misturada novamente com inversão suave.

Em seguida, a amostra é colocada em uma roda giratória por cinco minutos. A amostra é então transferida para tubos Teflon Oakridge de alta velocidade e centrifugada em um rotor SS 34 a 12.000 RPM por cinco minutos. A fração aquosa superior é extraída para um tubo novo e meio volume de clorofórmio é adicionado.

A amostra é submetida a um vórtice durante um minuto e novamente colocada na roda rotativa durante cinco minutos. Após uma segunda centrifugação, a fração aquosa é novamente extraída para um tubo de polipropileno de alta velocidade de 50 mil e centrifugada a 10.000 RPM por 20 minutos. Para remover quaisquer partículas residuais, a amostra é decantada em um tubo Falcon de 50 mil e um quarto do volume de cloreto de lítio 10 molar é adicionado à amostra.

A amostra é misturada por agitação e colocada a quatro graus Celsius durante a noite. No segundo dia. A amostra precipitada de cloreto de lítio é primeiro centrifugada a 11.000 RPM por 30 minutos a quatro graus Celsius.

O estado é derramado e descartado, e os tubos são invertidos em lenços químicos por um minuto. Para remover qualquer excesso de líquido, o pellet de RNA, que deve ser visível, é ressuspenso em 800 microlitros de tampão SSTE quente que foi pré-aquecido a 65 graus Celsius. Certifique-se de pipetar para cima e para baixo várias vezes e ao redor das margens do pellet para garantir que tudo entre em solução.

Em seguida, transfira o RNA ressuspenso para um tubo de micro fuga livre de RNA de dois mil ou mais. Aqueça a amostra por um a dois minutos em banho-maria a 65 graus Celsius, seguido de vórtice para garantir que a amostra seja completamente ressuspensa. Isso pode ser repetido, se necessário.

Agora, adicione um volume igual de clorofórmio fenol tamponado. Vortex a amostra por 15 a 20 segundos e micro fuga a 14.000 RPM por três minutos. A fração aquosa é extraída para um novo tubo de microfusível e um volume igual de é adicionado.

A amostra é vórtice e micro fundida como na extração anterior. Para a fase final de extração orgânica. Os tubos de gel de bloqueio são primeiro micro fued a 11.000 RPM por dois minutos.

Em seguida, a amostra de RNA da extração anterior é adicionada ao gel de bloqueio de fase, seguida por meio volume de clorofórmio, e os dois são misturados por pipetagem suavemente. A amostra é então micro fued a 11.000 RPM por cinco minutos, e a amostra aquosa de RNA é transferida para um novo tubo de micro fuge livre de RNA ambion. O próximo passo é uma precipitação simples de RNA para a amostra em um décimo volume de acetato de sódio de três molares pH 4,8 e dois volumes de etanol a 100%.

A amostra é um vórtice, brevemente colocado em um freezer de menos 80 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, micro fuga por 30 minutos a quatro graus Celsius. O sobrenadante é cuidadosamente aspirado e o pequeno pellet branco é lavado com um mil de aspirado de etanol a 70% gelado e repetido a lavagem com etanol após a aspiração final. O etanol residual é evaporado deixando os tubos abertos na bancada por cinco minutos.

Os grânulos de RNA são ressuspensos em 100 microlitros de água DEPC e ressuspensos por vórtice e aquecimento a 65 graus. Isso pode ser repetido, se necessário. A concentração da amostra é determinada.

Espectrometria e proporções de 2 62 80 e 2 62 30 são calculadas para estimar a extensão da contaminação de proteínas e carboidratos na amostra. A eletroforese em gel 1%AGROS é usada para estimar qualitativamente a qualidade da amostra, a contaminação do DNA genômico e a degradação do RNA A integridade da amostra de amostras críticas é avaliada posteriormente usando um bioanalisador Agilent 2100 para determinar as razões ribossômicas de 28 18 s e um número de integridade de RNA. Obrigado por assistir ao nosso vídeo sobre a colheita de amostras de tecido e o isolamento do RNA total do pinheiro LOB.

As seguintes pessoas são responsáveis pela filmagem e produção deste vídeo de treinamento.