JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

1, 1, 1

1Centre for Regenerative Medicine, Department of Biology and Biochemistry, University of Bath

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.

    Date Published: 12/22/2010, Issue 46; doi: 10.3791/1937

    Cite this Article

    Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism. J. Vis. Exp. (46), e1937, doi:10.3791/1937 (2010).

    Abstract

    בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקה של microinjection לאחד תאים בשלב עוברי medaka. Medaka הוא דג קטן ההטלה מים מתוקים המאפשר ניתוח הן גנטיות העוברית הוא אחד היצורים מודל חוליות שבו הגנום כולו פנוטיפ מונחה מסכי מוטציה בוצעו 1, כמו דג הזברה והעכבר. החפיפה סטייה תפקודית של גנים הקשורים בין medaka ו דג הזברה מאפשר זיהוי של פנוטיפים רומן כי הם ניתנים לזיהוי ב זן יחיד 2, ובכך medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

    כדי לנצל את הדגים medaka אשר עוברים הם שקופים ולפתח חיצונית, microinjection היא טכניקה חיונית להזריק תא קליעים נותבים עבור תאים, mRNAs תיוג או תחושה אנטי oligonucleotides במשך-לבטא ו דפיקות מטה הגנים של עניין, DNAs להכנת מהונדס הקווים.

    Protocol

    1. הזדווגות איסוף ביצים

    1. Medaka נקבה וזכר יכולים בקלות להיות מכובדת על ידי גודל וצורה של סנפיר אנאלי הגבי. סנפירי האנאלי של הזכרים גדולים בצורת מקבילית בהשוואה לזו של הנקבות. סנפיר אנאלי הנשי הוא קטן בצורת משולש. סנפיר הגב זכר יש חריץ עמוק לעין בין שתי הקרניים האחרונות.
    2. Medaka שכבו עד 40 ביצים כל יום ונקבות medaka לשאת ביצים התקבצו ליד הבטן שלהם על ידי חוטים מצורף במשך כמה שעות לפני שהם פשט על הצמחים באקווריום.
    3. נקבות יכול להיות לכוד ברשת וקבע בתוך בעדינות משני הצדדים על ידי יד אחת. ביצים אז יכול להיות התגרו בעדינות מהבטן עם האצבע המורה של היד השנייה. הנקבה אז יכול להיות שב הטנק. ביצים יש להעביר צלחת פטרי 6 ס"מ מלאים התקשורת העובר על ידי מלקחיים קהה או אצבע.
    4. זוגות Medaka נדירות להילחם כאשר הם מוחזקים בתוך קופסה קטנה ההזדווגות. לכן, הם יכולים להישמר טנק אחד קטן עם זרימת המים, כך שהם יכולים להיות מוזן וביצים ניתן לאסוף מזוג אותו כל יום במשך כמה חודשים.
    5. חשוב דג נקבה לא צריך להישמר ללא זכרים, שכן הביוץ מתרחש היומיום medaka נקבות. אחרת, הנקבות לא יכול לספק ביצים להיות ברע.

    2. עוברים ניקוי

    1. העברת unclustered ביצים עם טפטפת זכוכית נייר זכוכית (p2000 בגודל חצץ, עמיד למים) להציב מכסה של צלחת פטרי 9cm. הסר בינוני עודף אלא להבטיח נפח מספיק נשאר כדי למנוע ייבוש של עוברים.
    2. לגלגל בעדינות עוברים על נייר זכוכית בעזרת האצבע המורה, הפעלת לחץ מינימלי ושמירה במקביל אצבע על פני השטח של הנייר בחול כ 45-60 שניות כדי להסיר כמה שערות פני השטח החיצוני של סיסית. אין לגלגל יותר מ 5-7 עוברים מיד זהירות זו תצמצם את הסיכון של ריסוק עוברים מתחת לזה.
    3. העברת עוברים ניקוי לצלחת טרי בינוני העובר.

    3. ביצוע צלחות agarose לקיום עוברים במהלך microinjection

    עוברים מוחזקים שקתות במהלך ההזרקה עשה עם עובש פרספקס agarose ב -1.5% (איור 1). ריכוז agarose חשוב להחזיק עוברים כראוי.

    1. ראשית, ליצור מסגרת של agarose להחזיק את התבנית פרספקס. יוצקים agarose 1.5% במים עד לעומק 0.5cm בצלחת פטרי 9cm ולחכות עד שהוא מתקשה לחלוטין. לגזור על שטח של agarose רק גדול יותר בגודל של התבנית.
    2. יוצקים 1.5% agarose כדי למלא את שטח חתך מקום עובש כך שאין בועות לכודים ולהמתין עד agarose מתמצק. צלחת זו agarose ניתן לאחסן במקרר כדי לזרז solidifaction.
    3. מוציאים את התבנית כדי ליצור שקתות להחזיק את הביצים. הוסף בינוני העובר מספיק כדי לטבול את התבנית, מכסים ומאחסנים ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
      איור 1

      באיור 1. סכמטי של עובש מחוייט המשמשים להכנת שקתות בצלחות agarose עבור microinjection.

    4. Microinjection עוברים medaka

    ב medaka, DNA, RNA, oligonucleotides morpholino וצבעים נותב הם microinjected דרך סיסית לתוך הציטופלסמה של 1 עד 64 תאים בעובר בשלב במקום חלמון כמו דג הזברה. מאז הציטופלסמה קטנה יותר לעין ופחות medaka, בפועל על ידי הזרקת צבעים כגון rhodamine-dextran מומלץ לפתח את המיומנות הזאת. תוספת של פנול אדום כמו נותב הוא מעודד גם כדי לאפשר אישור של זריקות.

    ככל סיסית שמסביב עוברים medaka קשה, מחט קצרה, הזרקה חזקה רחב נדרשת (איור 2). הכן זה מחט חזקה הזרקת רחב של כוס חוט המכילים נימי.

    1. הכן פתרון זריקה עם פנול אדום כמו נותב ו לטעון אותו לתוך המחט מאחור עם microloader Eppendorf. חבר את המחט על משאבת אוויר מזרק.
    2. ביצים יש לאסוף unclustered בהקדם האפשרי לאחר ההפריה להזריק בשלב אחד התא. עוברים עוד ניתן להזריק ידי אחסונם על הקרח (לא יותר מ 30 דקות) כדי למנוע חלוקת התא.
      איור 2

      איור 2. השוואה בין מחטים medaka ו דג הזברה. הערה קצה המחט MF (למעלה) הוא קצר יותר ולכן חזקה ניקוב סיסית קשה שמסביב עוברים medaka.
    3. העברת ביצים לתוך הצלחת agarose וליישר אותם שקתות עם מלקחיים. ממש לפני ההזרקה, חמש ביצים יש לסובב כך קרום התא הציטופלסמה של תא אחד יכול להיות נפגע על ידי הדואר המחט בניצב. הציטופלסמה של תא אחד לא ניתן למצוא על ידי מחפש שטח נטולי טיפות שמן קטן שנמצא מול הצד של הביצה עם טיפות שמן הצפופים. האזור זיהו ניתן לאשר להיות בציטופלסמה ידי הצגת מהצד.
    4. מקמו את המחט קרוב את הביצים. פתח את קצה המחט על ידי נוגע בעדינות את קצה המחט אל סיסית או באמצעות microforceps (איור 3). כמות קטנה של חומר הזרקה יש לראות לזרום החוצה.
    5. לנקב דרך סיסית למקום קצה של מחט בתוך סיסית. התאם את הלחץ החזקה של מזרק להיות גבוה יחסית, כדי להבטיח ריפלוקס לא מתרחשת עקב הלחץ הגבוה על לנקב דרך סיסית הקשה (הגדרות של 80 100hPA ללחץ החזקת 500-700hPA ללחץ הזרקה).
    6. הכנס את קצה המחט לתוך הציטופלסמה באמצעות חדה תוקע הקרום שלה.

      הימנע החדרת קצה המחט בחלמון. שלא כמו דג הזברה, החומר מוזרק לתוך החלמון לא יועברו לתוך הציטופלסמה. נוזלים מוזרקים יש גבול ברור כאשר הוא מוזרק לתוך החלמון ואילו הגבול מטושטש כאשר בציטופלסמה (איור 4).

      מדי פעם המחט עשוי להיחסם על ידי agarose / פסולת. מלקחיים ניתן להשתמש לגעת / rebreak סוף המחט ולהסיר את החסימה. אם המחט שוברת בכל נקודה במהלך ההזרקה, מבעבע יהיה לראות את העובר בינוני לבין חומר שאתה הזרקת יאבדו. זריקות צריך להתבצע באופן שיטתי מלמעלה למטה לאורך תעלות agarose ו משמאל לימין על פני התבנית.
    7. עוברים מוזרק יש להעביר צלחת נקייה המכילה בינוני העובר ופיתח בטמפרטורה המתאימה.
      איור 3

      איור 3. שוברים את קצה המחט לפני ההזרקה. 1: העבר קצה המחט קרוב סיסית של העובר; 2: גע סיסית ולהעביר מחט בעדינות קדימה ואחורה כדי לשבור קצה; 3: כאשר כמות קטנה של חומר הזרקה זורם מתוך בסופו של המחט זו מאשרת שבירה של קצה.

    5. נציג תוצאות

    איור 4
    איור 4. תמונות נציג מוזרק עוברים medaka. לוח מראה תמונה מייצגת של הזרקה נכונה של rhodamine-dextran לתוך הציטופלסמה של תא אחד עובר שלב medaka. לוח ב 'מציג תמונה מייצגת של הזרקה שגויה של rhodamine-dextran לתוך שק החלמון של העובר חד תא הבמה medaka. לוחות C ו-D להראות את העוברים מקולטי A ו-B בהתאמה על כ 30 שעות לאחר ההזרקה. א.מ.: העובר, הקדמי הוא כלפי מעלה לוחות C ו-D ולהציג היא הגב. הערה על הגוף של העובר בלוח D הוא לא אדום כמו צבע היה מוזרק בצורה לא נכונה לתוך שק החלמון. חצים ב B ו-D עולה rhodamine-dextran מוזרק בצורה לא נכונה לתוך שק החלמון לציין את הגבול מעגלי מובהק. קווים מקווקווים ב A ו-B עולה קווי המתאר של הציטופלסמה של תא אחד, הוא להציג לרוחב.

    Discussion

    בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה נותב התא, ה-mRNA, ה-DNA או oligonucleotide אנטי תחושה זריקה לתוך אחד התאים בשלב עוברי medaka. טכניקה זו אפשרה לנו לבחון תהליכים התפתחותיים שונים ב-vivo בזמן אמת. תהליך זה לבין ניתוח מפורט בהמשך היא מספקת יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את הבנתנו organogenesis החולייתנים לבין ביולוגיה של התא הבסיסי. ידע כזה עשוי להיות חשוב, ואת התשואה יישומים טיפולית רפואה רגנרטיבית.

    Disclosures

    Acknowledgements

    עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם MRC.

    Materials

    Name Type Company Catalog Number Comments
    4" fine net Tools J K Aquatics Ltd. MD001 Used to capture fish during egg harvesting.
    Embryo medium Reagent Home made 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.
    Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size Tools Hermes Abrasives Ltd. Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
    Borosilicate glass capillaries Tool Harvard Apparatus GC100-10F For making microinjection needles.
    Micropipette puller Equipment Narishige International Model PP-830 For making microinjection needles.
    Eppendorf microloader Tool Eppendorf 5242956.003 For loading microinjection needles.
    Microinjector apparatus Equipment Eppendorf Model 5242.
    Micromanipulator Equipment Narishige International Model MN151.
    Agarose injection plate Tools Home made For holding embryos during injection.

    References

    1. Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
    2. Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).

    Comments

    1 Comment

    Manufacturer capillary Needle
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 6, 2011, 8:07 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter