Name: Crônico Salmonella Modelo de camundongos infectados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo crônico de infecção por Salmonella em camundongos usando gavagem com estreptomicina e detecção em placas BL. Este método permite estudar colonização intestinal persistente e resposta do hospedeiro.

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Este trabalho foi financiado pelo NIDDK KO1 DK075386 subvenção ea Sociedade Americana do Câncer RSG-09-075-01-MBC para junho dom

Este protocolo inclui três partes: detecção de cultura bacteriana, gavage mouse, e Salmonella. 1. Condições de crescimento Salmonella. <ol><li> Prepare a Salmonella Luria-Bertani caldo de placa (LB), incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Escolha um clone da placa de LB e colocar em 7 LB ml em um tubo de 12 ml, e agitar a 37 ° C por cerca de 5 horas. </li><li> Inocular 50 ml LB com 0,05 ml de uma cultura de fase estacionária e incubar a 37 ° C sem agitação por cerca de 18 horas. </li><li> Rotação de cultura bacteriana durante a noite a temperatura ambiente com 6000 rpm por 10 minutos, suspender as bactérias em HBSS usando 100:3 ratio (LB: HBSS). Por exemplo: Cada cultura LB 50 ml será suspenso em 1,5 ml HBSS. </li><li> Para a sonda animal, diluir a cultura bacteriana na proporção de 1:10. Por exemplo: A cada 1,5 ml de cultura LB será suspenso em 15 ml HBSS. </li></ol> 2. Salmonella modelo de infecção *. <ol><li> Preparar a solução de estreptomicina. Cada rato será dado 7,5 mg de estreptomicina em 100 mL HBSS. Por exemplo, prepare mg 90 total de estreptomicina, em 1,2 ml de HBSS 10 ratos. Sempre tem algum volume extra na preparação da solução de estreptomicina. </li><li> Retirar água e comida 4 horas antes do tratamento gavagem oral. </li><li> Camundongos gavagem com estreptomicina com 7,5 mg de estreptomicina (100 l de HBSS para os ratos de controle). Agarre a pele sobre o ombro do mouse firmemente com o polegar eo dedo médio, esticar a cabeça e pescoço com o dedo indicador para fazer o esôfago em linha reta. Dirigir a bola ponta da agulha de alimentação ao longo do céu da boca e em direção ao lado direito da parte de trás da faringe, em seguida, delicadamente passar para dentro do esôfago e injetar a solução de 100 ml. Nenhuma resistência deve ser sentida. </li><li> Menos 20 horas após o tratamento estreptomicina, água e alimentos retirados novamente antes de os camundongos são infectados com bactérias. </li><li> Gavagem cada rato com 100 mL de suspensão em HBSS ou tratados com HBSS estéril (controle) por gavagem oral. O procedimento de gavagem é o mesmo que 2.3) ratos gavage com estreptomicina. </li></ol> Experimentos em animais * foram realizadas utilizando-específicas isentos de agentes patogénicos C57BL feminino / 6 camundongos (Taconic, Hudson, NY), que foram 6-7 semanas de idade, como descrito anteriormente 1. O protocolo foi aprovado pela Universidade de Rochester University Comité de Recursos Animal (UCAR). 3. Detecção de Salmonella no intestino. <ol><li> Coletar rato fecal (cerca de 100 mg). </li><li> Transferência da amostra fecal a um tubo de centrífuga de 1,5 micro com 1ml de PBS e vortex vigorosamente. </li><li> Centrifugar por 10 min a 800 rpm. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. </li><li> Centrifugação a 6000 rpm por 5 min. Sobrenadante é descartado e 200 mL PBS é adicionado à pellets e agitadas. </li><li> Raia o PBS 200 mL com um espalhador de células em um prato descartável CHROMagar BBL para detectar Salmonella. Espécies Salmonella aparecem malva (rosa ao roxo, ver Fig.1). Se 200 mL rende muitas colônias na placa, use 100 ml ou 50 ul para a raia. </li></ol> 4. Resultados representante. Quando o protocolo é feito corretamente, a colonização de Salmonella typhimurium pode ser detectado no intestino do rato mais de 6 meses. Salmonella pode ser detectado por cultura fecal mais de 6 meses (Fig.1). Como fora típico vêm deste modelo, o corpo de emagrecimento e morte ocorrer dentro de 4 semanas após a infecção. Dependente do Cepas de Salmonella usado para infecção, alguns ratos não podem sobreviver mais de 6 meses. <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Salmonella intestinal na espécie Salmonella aparecem malva (rosa ao roxo) na cor, devido às diferenças metabólicas na presença de cromógenos selecionado. Outras bactérias são inibido ou produzir colônias azul-esverdeada ou incolor. <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Proporções de sobrevivência de camundongos infectados com Salmonella cepa mutante PhoP c, c PhoP Avra, e PhoP AvrA-/AvrA c +, c PhoP Avra durante 4 semanas (28 dias). Tabela peso corporal 1. De camundongos infectados com Salmonella durante 4 semanas. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 </td><td> 1 semana </td><td> 2 semanas </td><td> 3 semanas </td><td> 4 semanas </td></tr><tr><td> controle </td><td> 16,78 ± 1,05 </td><td> 16,91 ± 1,28 </td><td> 18,26 ± 1,23 </td><td> 19,31 ± 1,26 </td><td> 20,26 ± 1,15 </td></tr><tr><td> PhoP c </td> 16,89 ± 1,03 <td> 17,14 ± 1,19 </td><td> 17,43 ± 1,63 * </td><td> 18,68 ± 1,78 </td><td> 20,05 ± 1,11 </td></tr><tr><td> PhoP c Avra- </td><td> 16,91 ± 1,12 </td><td> 16,96 ± 1,39 </td><td> 17,06 ± 2,14 ** </td><td> 18,71 ± 2,18 </td><td> 20,15 ± 1,56 </td></tr><tr><td> PhoP c + AvrA-/AvrA </td><td> 16,94 ± 0,96 </td><td> 17,17 ± 1,02 </td><td> 17,63 ± 1,42 * </td><td> 18,44 ± 2,03 </td><td> 20,09 ± 1,17 </td></tr></tbody></table> * Comparado ao grupo controle p &lt;0,05 ** Quando comparado ao grupo controle p &lt;0,01 Tabela 2. Cepas de Salmonella utilizados neste estudo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Descrição </td><td> De referência ou fonte </td></tr><tr><td> Salmonella 14028s </td><td> Do tipo selvagem S. typhimurium </td><td> ATCC </td></tr><tr><td> PhoP c </td><td> Não-patogênicos complexo regulador mutante </td><td> Miller et al., 1990 </td></tr><tr><td> PhoP c Avra- </td><td> Avra mutação </td><td> Collier-Hyams et al., 2002 </td></tr><tr><td> PhoP c + AvrA-/AvrA </td><td> PhoP c Avra com Avra codificação complementada plasmídeo </td><td> Collier-Hyams et al., 2002 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+activity+negatively+regulates+bacteria-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation.</a> Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).</li>
<li>Barthel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Miller, S. I., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+the+phoP+regulon+attenuates+Salmonella+virulence+and+survival+within+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages.</a> Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).</li>
<li>Valdez, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+expression+by+dendritic+cells+modulates+inflammatory+responses+during+Salmonella+Typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).</li>
<li>Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+Salmonella+colitis+with+features+of+diarrhea+in+SLC11A1+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).</li>
<li>Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+call-and-response%3A+how+Salmonella+learns+the+gospel+from+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host.</a> Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).</li>
<li>Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+Host+resistance+factor+Nramp1+up-regulates+the+expression+of+Salmonella+pathogenicity+island-2+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).</li>
<li>Townsend, P., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Animal+Care+Policies+and+Regulations%3A+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom.</a> ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+for+infectious+disease+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints for infectious disease animal models.</a> ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+AvrA+regulation+of+colonic+epithelial+cell+inflammation+by+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination.</a> Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enteric+salmonella+infection+in+mice+leads+to+severe+and+persiste+nt+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+murine+model+of+chronic+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Development of a murine model of chronic Salmonella infection.</a> Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).</li>
<li>Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).</li>
<li>Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+effects+of+a+Salmonella+type+III+secretion+effector+protein+AvrA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo.</a> PLoS ONE. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para utilizar este sistema, é necessário que o pesquisador para aprender a gavagem os animais. Detalhamos uma metodologia para preparar a cultura bacteriana e gavagem a camundongos. Também mostramos como monitorar a persistência de Salmonella no trato gastrointestinal (TGI). Os passos críticos neste protocolo, incluindo: <ol><li> Estreptomicina pré-tratamento: Estreptomicina pré-tratamento, poderia se livrar de alguns comensais da flora intestinal e fazer os ratos suscetíveis à infecção por Salmonella</...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria-Bertani</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de alimentação</td><td>Popper &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin </td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr><tr><td>BBL CHROMagar &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>214983</td><td></td></tr><tr><td>Espalhadores celulares descartáveis</td><td>Biologix Research Company</td><td>65-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

crônico salmonella modelo de camundongos infectados

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

O modelo do rato infectado de bactérias é um sistema poderoso modelo para o estudo de áreas tais como inflamação, infecção, imunologia, transdução de sinal, e tumorigênese. Muitos pesquisadores têm se aproveitado da colite induzida por<em&gt; Salmonella</em&gt; Typhimurium para os estudos sobre a fase inicial de inflamação e infecção. No entanto, poucos relatos são a infecção crônica<em&gt; In vivo</em&gt;. Camundongos com<em&gt; Salmonella</em&gt; Existência persistente no trato gastrointestinal nos permitem explorar a host-bacteriana interação a longo prazo, transdução de sinal, e tumorigênese. Nós estabelecemos um modelo de camundongo bacteriana crônica infectados com<em&gt; Salmonella</em&gt; Typhimurium colonização no intestino do rato mais de 6 meses. Para utilizar este sistema, é necessário que o pesquisador para aprender a preparar a cultura bacteriana e sonda os animais. Detalhamos uma metodologia para cultura bacteriana preparar e ratos gavagem. Também mostramos como detectar a<em&gt; Salmonella</em&gt; Persistência no trato gastrointestinal. Globalmente, este protocolo vai ajudar os pesquisadores usando o modelo de camundongo infectado de bactérias para tratar fundamentalmente importantes questões biológicas e microbiológicas.

Estabelecer um modelo de camundongo bacteriana crônica infectados com persistente<em&gt; Salmonella</em&gt; Typhimurium colonização no intestino durante 27 semanas.

Crônico Salmonella Modelo de camundongos infectados

O modelo de camundongo infectado por bactérias é um sistema de modelo poderoso para estudar áreas como infecção, inflamação, imunologia, transdução de sinal e...

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Research

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