Name: In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Öğrenin, Drosophila embriyolarında canlı organel ayırma yöntemini. Agar içine yerleştirilen embriyolar santrifüjle yoğunluğa göre ayrılır ve biyokimyasal analiz için kesirler elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Susan Gerbi Heidi Smith ve David Lambert, sırasıyla, Sciara coprophila ve Ilyanassa obsoleta in vivo santrifüj test etmek için malzeme temini için teşekkür ederiz . Biz Welte laboratuar tekniği ve el yazması üzerinde yorum yapmak için üye teşekkür ederiz. In vivo santrifüj testin geliştirilmesi ve arıtma MAW NIGMS hibe GM64687 tarafından desteklenmiştir. Görüntüleri Şekil. 1 ve Şekil. 5E, F, daha önce 2 basıldı ve izni ile yeniden basıldı.

<ol><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 2nd Edition, University Press. Oxford. 179-214 (1998).</li>
<li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li>
<li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A. Quantitative microinjection of Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiehart%2C+DP+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 345-359 (2000).</li>
<li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li>
<li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+Drosophila+CID%2FCENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li>
<li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li>
<li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos%3A+forces+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li>
<li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((unpublished+observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">unpublished observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 141-157 (2000).</li>
<li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport%3A+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li>
<li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+XXII%3A+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Embryology%22%5BJournal%5D)">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , Columbia University Press. New York. (1927).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li>
</ol>

Kritik adımlar Agar agar konsantrasyonu yeterince yüksek olduğundan emin olun. Çok düşükse, santrifüj sırasında parçalanır ve embriyoların patlaması ya da rastgele odaklı olacak . Agar konsantrasyonu sadece biraz agar (4.3 adım aşırı AKM yeterince kurutulmuş veya yetersiz kaldırma) ıslak çok düşük ya da eğer varsa, santrifüj sırasında embriyoların deliklerinden dışarı float ve yanlış odaklı hale gelecektir. Agar çok ince dökülür, aynı zamanda çökmesi veya santrifüj sırasında çatlak. Organelleri, tek tek hücrelerin binlerce içinde tecrit olacak embriyolar cellularization aşamalarında ötesinde gelişmiş olduğunu emin olun, aksi takdirde, organellerin ayrılması (Şekil 5C) iş olmaz . Bir hücre aşamada genç embriyoların, organeller büyük mesafeler göç ücretsiz ve onların karakteristik yoğunluğuna göre birikir. Çok eski olan embriyolar analiz önlemek için, emin olun, (i) kadın, eski yumurta (adım 2.4), (ii) (adım 2.5) 3 saat veya daha az embriyolar toplamak, (iii) bırakmak için izin vermek için bir ön toplama agar içine gömmek için görsel cellularization aşamalarında önce embriyolar seçin (adım 4.2), (iv) cellularization (adım 4.6) sonuna kadar gelişimini önlemek için kısa bir süre gömme tutmak, ve (v) (adım 5.6) doğru katmanı yoktu embriyolar iptal . Santrifüj zaman eksik etmeyin. Bazı embriyoların sadece 10 dakika santrifüj sonra bile güzel katmanlarını göstermek rağmen, ayırma embriyo embriyoya tutarsızdır. 30 dakika spin yüksek tutarlı sonuçlar verir. Ayrıca, santrifüj sona erdikten sonra uzun süre santrifüj süresi daha uzun katmanları stabildir. Bu kullanmadan önce daha fazla embriyoların süreci zaman alır, bu uygulamalar için önemlidir (örneğin, nakli deneyleri için konfokal analizi için işlenen veya monte edilmesi gerekiyorsa). Olası değişiklikler Yumurta toplama ve adım 2 ve 3 1, 3, 9 koryon kaldırılması çok farklı protokoller var ve kullanılan embriyoların genç olanlar sürece burada açıklanan yanı sıra iş, yumurta verimi yüksek ve kesir yanlış sahnelenen embriyolar en aza indirilir. Ön-arka hizalama protokol posterior uç agar gömüldü ve ön ucu (Şekil 3) olduğu gibi tüm embriyolar yönlendirir. Bu yönelim, tutarlılık için iyi micropyle santrifüj (Şekil 1, 5) sırasında sivri ucunu bir dönüm noktası olarak kullanmak mümkündür, böylece. Ancak, uygulama ile, parlak alan mikroskobu ile lipit damlacık ve yumurta sarısı katmanları farklı bir görünüm santrifüje embriyoların yönünü ortaya çıkarmak kolaydır. Sonra iki ucunda olan embriyolar monte etmek mümkün olur; bu esneklik montaj sürecini hızlandırır. Yönlenimsiz santrifüj protokolün en çok zaman alıcı ve teknik açıdan zor yönü montaj agar embriyolar (adım 4). Bu iki kez (bir kez deliğe takın ve bir kez santrifüj sonra kurtarmak için) her bir embriyo dokunmadan gerektirir. Alternatif olarak, bir AKM ile dolu mikrosantrifüj tüpler içine adım 4.1 &#39;embriyolar transfer edebilirsiniz. Bu borular, mikrosantrifüj (13.000 rpm, 10-30 dak.) Santrifüj, embriyoları aynı zamanda tipik tabakası 10-13 . Bu değişim, bir çok hızlı bir şekilde aynı anda yüzlerce embriyo süreci sağlar. Ancak, katman olarak tutarlı değildir; embriyoların bir kısmını yukarıda protokol uygulanan daha yüksek santrifüj kuvvetler (~ 16.000 g) rağmen farklı katmanlar ortaya çıkmaz. Daha zorlu embriyoların yönünü değişkendir ve bir büyük embriyo ekseni çeşitli açılardan ayrımı izleyebilirsiniz gerçektir. Bu değişkenlik, deneyci, belirli bir embriyo santrifüj tüpüne nasıl düzenlenmiştir santrifüj sonra dışarı sıralamak için gereklidir. Sarısı otofloresans embriyonun en yoğun bölümü için bir belirteç olarak kullanımı ile güvenilir bir şekilde bunu yapmak için çok daha pratik ve daha fazla karar gerektirir rağmen, bu, çoğu zaman mümkündür. Örnek yeterli embriyolar varsa, bir embriyolar Şekil gibi düzenlenmelidir oldu bu örnekleri sıralamak mümkün olabilir. 1. Kendi yumurta kabuğu embriyoların Santrifüj koryon ilk 2 çıkarmadan adım 4 agar embriyolar gömmek için mümkündür. Bu yaklaşımda, toplama plakası üzerinde embriyolar Halokarbon yağ yerine adım 3.2 (Halokarbon koryon saydam döner)% 50 çamaşır suyu ile kaplıdır. Embriyolar uygun aşamalarında seçilmiş ve cımbız kullanarak yeni bir agar plaka transfer; cımbız, zarar, sadece yumurta filamentler kapmaembriyonun düzgün kaçınılmalıdır. Embriyolar ön yumurta filamentler agar delikten dışarı yapıştırma ile, 4.8 ile adım 4.4 gibi gömülürler. Embriyolar santrifüj ve adım 5.4 agar çıkardı sonra yumurta kabuğu,% 50 çamaşır suyu arıtma ile kaldırıldı. Yumurta kabuğu varlığında Santrifüj fiksasyon sonra devitellinization oranı (adım 6.2) artırabilir, ama santrifüj için doğru aşamalarında seçimi (4.2 adım) daha zordur. Uygulamalar Embriyo santrifüj ko deneyler, yani, eğer belli bir proteinin belli bir büyük organel lokalize sınamak için yararlıdır. Örneğin, Klar protein erken embriyonik lipid damlacıkları bulunan, henüz bu lokalizasyon sağlam embriyolar göstermek zordur. Bölümünde, Klar puncta ve lipid damlacıkları hem de sabit sahte ko ekarte etmek için, embriyo çevre 10 bol çünkü bu. Ancak, farklı bir tabaka haline santrifüj lipid damlacıkları konsantreleri, ve böylece, Klar sinyal ile ko 10 belirginleşmektedir. Benzer analiz, belirli histon gibi şaşırtıcı örnekler de dahil olmak üzere lipid damlacıkları 8, 13-15, 2 ve bir protein yayg mevcut olduğu durumlarda diğer proteinlerin lokalizasyonu net bir şekilde gösterdi, ancak lipid damlacıkları 8 zenginleştirilmiş. Embriyolarının gelişim aşamasında (adım 4.2) tarafından görsel olarak seçilebilir olarak, lipid damlacıkları 8, 15 proteinlerin gelişimsel düzenlenir işe tespit etmek bile mümkün . Çünkü görsel olarak ayrı bir &quot;kap&quot; lipid damlacıkları birikir lipid damlacıkları ile ko için test özellikle kolaydır, böylece başka marker veya leke bu katmanı tanımlamak için gereklidir. Aslında, çünkü kolaylığı ve potansiyel çarpıcı görsel sonuçları (Şekil 1, Şekil 5 D, E), bizim laboratuar aday protein, lipid damlacıkları lokalize olup olmadığını bir ilk test olarak artık rutin olarak bu tekniği kullanır. Prensip olarak, benzer ko çalışmaları Şekil diğer organellerin için çalışması gerekir. 1, muhtemelen dağıtım santrifüje embriyolar diğerleri (hücre içi parazitler de dahil olmak üzere) belgelenmelidir henüz için. Santrifüj sıkı bantlar organelleri konsantreleri bu yana, bu organeller zenginleştirilmiş bir kısmını izolasyonu kolaylaştırır. Bu yaklaşım, zaten içine donör embriyoların 2 nakli için lipid damlacıkları kurtarmak için kullanılır olmuştur. Ayrıca zenginleştirilmiş fraksiyonu (örneğin, 15 fiksasyon sonra embriyolar kapalı katmanları keserek) biyokimyasal analiz etmek mümkün olabilir. Santrifüj 16 (kurbağa, nematod, gömlekliler, halkalı, deniz kestaneleri, yumuşakçalar ve cnidarians da dahil olmak üzere) pek çok farklı türlerin yumurta tabakalandırmak için kullanılabilir yöntemi, burada Drosophila embriyolar ötesinde uygulamalar vardır anlatılan. Kendi laboratuarında, housefly Musca domestica 2 embriyolar için yukarıdaki protokol ve mantar sivrisineği fosili Sciara coprophila 17 ve salyangoz Ilyanassa obsoleta 17 embriyoların analiz yönlenimsiz santrifüj istihdam. Son olarak, bu yöntem embriyolar sınırlı değildir: Santrifüj oosit (örneğin, Drosophila 2, 18 ve sütlü özsuyu olan bir bitki hata Oncopeltus fasciatus 17) gibi diğer büyük hücreler, sınıflandırmaktı yararlı olabilir. Farklı örnek için, tam santrifüj koşulları optimize edilmesi gerekir: Örneğin, 3000 g 10 dakika verimli Musca domestica 2 embriyolar tabakalandırmak için yeterli ve eğer çok daha uzun santrifüj, embriyoların fiksasyon ve immün sırasında dağılma eğilimi gösterir.

<table><tbody><tr><td>60x15 mm Petri kapları</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>Falcon'dan</td></tr><tr><td>Tel örgü</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>304 tip paslanmaz çelik; gözenek boyutu #150 x150, tel çapı: 0.0026 inches</td></tr><tr><td>Tungsten iğneler</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0.25 mm</td></tr><tr><td>Moria Nikel Kaplı Pin/İğne Tutucu</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Sinek Kafesleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 veya 59-101</td><td>Sırasıyla 65 mm veya 100 mm çapındaki Petri kapları için</td></tr><tr><td>Halocarbon Yağı 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo drosophila embriyolar santrifüj

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Batmaz yoğunluğu farklılıkları onları birbirinden ayırmak için farklı tipte hücre içi organelleri arındırıcı ve izole etmek için önemli bir strateji. Ancak, hücreler santrifüj, proteinler ve yerli olmayan bu ortamda organelleri önce kesintiye çoğu zaman uygunsuz birbirine yapışmaz. Burada, ayrı organelleri sağlam yaşayan Drosophila embriyolar yoğunluk bir metodu tanımlar . Cellularization önce Erken embriyoların nüfus kafeslerden hasat edilir ve dış yumurta kabukları,% 50 çamaşır suyu ile tedavi kaldırılır. Embriyolar sonra agar küçük dikey deliklere, ilk önce küçük bir agar plaka ve eklenen arka sonuna aktarılır. Gömülü embriyoları içeren plakalar 3000g az 30 dakika süreyle santrifüj. Agar embriyoların destekler ve belirli bir yönde tutmaktadır. Daha sonra, embriyolar agar künt bir iğne ile çıkardı. Santrifüj bir tabakalaşma parlak alan mikroskobu ile kolayca görülebilir, farklı katmanlar halinde büyük organelleri ayırır. Floresan belirteçlerin bir dizi canlı embriyolarının başarılı tabakalaşma onaylamak için kullanılabilir. Proteinler belli organelleri ile ilgili ko gösteren belirli bir tabaka güçleniyor. Bireysel katmanlar, donör yumurta içine biyokimyasal analiz veya transplantasyon için telafi edilebilir. Bu teknik, farklı türlerin yumurta ve oosit dahil olmak üzere diğer büyük hücre, organel ayrımı için geçerlidir.

Biz yaşayan organelleri yoğunluğu ile ayrı bir metodu tanımlar<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar gibi. Embriyolar agar gömülü ve santrifüj. Bu teknik, ön-arka embriyo eksen boyunca büyük organellerin tekrarlanabilir ayrılığı ortaya çıkarır. Bu yöntem, biyokimyasal analiz ve nakli deneyleri için ko deney ve verim organel kesirler kolaylaştırır.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

Farklı tipteki hücre içi organellerin saflaştırılması ve izole edilmesi için temel bir strateji, bunları ... farklılıklarına dayanarak birbirinden ayırmaktır.

Meyve sineği yumurtaları içindeki ana organellerin yoğunluğa göre ayrıştırılması işlemi, üç saatten daha küçük olan embriyoların toplanmasıyla başlar. Yumurta kabukları, dekorasyon sonrası %50 çamaşır suyunda inkübe edilerek uzaklaştırılır. Belirli evrelerdeki embriyolar agar içerisine gömülür.Son adım olarak, embriyolar santrifüjlenir ve geri kazanılır; ardından geri kazanılan embriyolar parlak alan ve floresan ışık altında incelenir. Mikroskopi, spesifik proteinlerin belirli organellerdeki lokalizasyonunu göstermektedir. Hücre içi organelleri saflaştırmak ve izole etmek için temel bir strateji, onları diğer tüm hücre bileşenlerinden yoğunluklarına göre ayırmaktır, ancak hücreler santrifüjlemeden önce parçalandığında, normalde ayrı olan proteinlerin ve organellerin birbirine karışması gibi bir zorluk ortaya çıkmaktadır.Bu yabancı in vitro koşullar altında Mays'ler birbirine yapışabilir. Aksine, bazı proteinler normalde bağlandıkları yapılardan ayrılabilir. Tanımlayacağımız tekniğin temel avantajı, in vivo ortamda yoğunluğa göre ayırmaya olanak tanımasıdır.Böylece, hücrelerin parçalanmasını ve buna bağlı olarak ortaya çıkan artefaktları önler. Bu yöntem, temel hücre biyolojisi sorularının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kolokalizasyon deneylerini oldukça kolaylaştırır ve transplantasyon deneyleri ile biyokimyasal analizler için spesifik organel fraksiyonlarının izole edilmesine olanak tanır.Bu prosedürde, beraberindeki yazılı protokolde detaylandırıldığı üzere, elma suyu içeren yüksek yüzdeli agar ortamı hazırlanır ve plakalara dökülür. Plakalar hem yumurtlama aşamasında hem de embriyoların sonraki gömme ve santrifüjleme işlemleri için kullanılır. Bu prosedür, yumurta toplama işleminin başlatılmasıyla başlar.Öncelikle, kuru mayayı suyla fıstık ezmesi kıvamına gelene kadar karıştırarak maya pastasını hazırlayın. Ardından, taze elma suyu agarlı bir plakanın bir kısmını maya pastasıyla kaplayın. Erişkin sinekler, alt kısımlarına agar plakalarının sabitlendiği kafeslerde tutulur.Mevcut plakayı çıkarmak için, sinek kafesini ters çevirin ve tezgah üzerine vurun. Birkaç kez vurduğunuzda sinekler dibe düşer ve bu çok kısa süre içinde kısa süreliğine yönlerini şaşırırlar. Eski agar plakayı hızla, üzerine maya pastası sürülmüş taze plakayla değiştirin.Maya, yumurta üretimi için besin sağlar ve agardaki elma suyu ile birlikte yumurtlama sürecini tetikler. İlk 30 ila 60 dakikalık yumurta toplama işleminiyle elde edilenleri atın. Döllenmeden sonra dişiler tarafından tutuldukları için, bu süre zarfında gelişim evreleri hatalı belirlenmiş çok sayıda embriyo elde edilir.Sonraki yumurta toplama işlemleri, genellikle döllenmeden kısa süre sonra bırakılan yumurtaların baskın olduğu bir eğilim gösterir. En tutarlı katmanlama genç embriyolarda elde edildiğinden, yumurtaları en fazla üç saat boyunca toplayın. Bir saat veya daha kısa süreli toplama süreleri tercih edilir.Rutin deneyler için, mayaya veya agar plakasının yüzeyine yapışmış olan sinekleri uzaklaştırmak amacıyla cımbız kullanın. Yumurtaları topladıktan sonra, yumurta kabuğunu çıkarmak için agar plakasını bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve embriyoları transilüminasyon ile gözlemleyin. Embriyolardan yumurta kabuğunu çıkarmak için yumurta filamentlerini belirlediğinizden emin olun.Agar plağının altına, embriyoları kaplayacak şekilde %50 çamaşır suyu sıkın ve birkaç dakika inkübe edin. Embriyoların çamaşır suyu içinde dönmesini sağlamak için agar plağını ara ara çalkalayın. Yumurtaları mikroskop altında tekrar inceleyin.Yumurta filamentleri artık görünmediğinde, Corian başarıyla uzaklaştırılmış demektir. Bu işlem genellikle çamaşır suyu çözeltisi ile üç ila beş dakikalık bir inkübasyon gerektirir. Ardından, embriyoları çamaşır suyundan ayırmak için elek olarak tel örgü bir sepet kullanın.Sepet, ortası içeri doğru bastırılmış iki santimetreye iki santimetrelik kare şeklinde bir tel örgü düz levhadan hazırlanır. Tel sepeti cımbızla tutun ve ters çevrilmiş agar plak kapağının üzerine yerleştirin. Çamaşır suyu ve embriyo süspansiyonunu agar plakadan, tel örgü üzerinden agar plak kapağına süzülecek şekilde dökün.Embriyolar agar plak üzerinde kalırsa, onları yerinden çıkarmak için plağın üzerine distile su püskürtün ve distile su ile embriyo karışımını tel örgüden süzün. Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için tel örgünün alt kısmını bir kağıt havluya değdirin. Ardından, embriyo kaybını minimize ederek kalan çamaşır suyunu durulamak için tel sepetin çevresi boyunca distile su püskürtün.Fazla sıvıyı sık sık emdirerek temizleyin. Tüm çamaşır suyu uzaklaşana kadar yıkama adımını beş ila 10 kez tekrarlayın. Tel sepet hâlâ çamaşır suyu kokuyorsa, embriyoları yıkamaya devam edin.Embriyolar yeterince yıkandıktan sonra agara yerleştirilebilirler. Embriyoları tel sepetten yıkayarak çıkarın. Boş bir petri kabına TSS ile birlikte konulduğunda, embriyo dibe çökmelidir.Bir diseksiyon stereomikroskobu altında, embriyoları trans-aydınlatma ile gözlemleyin. Belirli evreler görsel olarak kolayca tanınabilir. Bir P 200 pipeti kullanarak istenen evrelerdeki embriyoları seçin ve bunları küçük bir agar plağına aktarın.Embriyolar yaşlandığı için hızlı çalışın; TSS içerisinde 30 dakikadan uzun süren daldırmalar gelişimi etkileyebilir. Bir pipet kullanarak, Kim wipe altındaki TSS'nin çoğunu uzaklaştırın.Agar yüzeyi, embriyoları hareket ettirmeyi kolaylaştırmak için hafif nemli olmalıdır. Ancak, santrifüj sırasında fazla sıvı embriyoların deliklerden kayarak çıkmasına neden olacağından, plakanın hiçbir yerinde sıvı birikintileri kalmamalıdır. Bu prosedürün en zor kısmı, embriyoların ve burgunun yerleştirilmesidir.Embriyolar hassas olduğu, kolayca tahrip edilebileceği ve kaba müdahalelere karşı dayanıksız olduğu için bu işlem özellikle zorlayıcıdır. Bunu önlemek için iğne yavaşça, dikkatle ve küçük artışlarla hareket ettirilmelidir. Embriyonun ne kadar dokunmaya ve basınca dayanabileceğini tam olarak öğrenmenin en iyi yolu pratiktir. İzleme sırasında küt ucun dışarıda kalması için bir pens ve iğneyi iğne tutucuya ters şekilde yerleştirin.Mikroskop altında, her bir embriyonun yanındaki agarda dikey delikler açmak için iğneyi kullanın; agarda delik açarken aynı zamanda mikroskopla izleyebilmek için iğne belirli bir açıyla tutulur. Bu nedenle, tamamen dikey delikler açmak zordur. Ancak, iğnenin hafif eğimi deliğin bir tarafında küçük bir çöküntü veya oluk oluşturur, böylece embriyo bu oluk boyunca kolayca kayarak deliğin içine girer.Ardından, embriyo deliklere tutarlı bir yönelimle yerleştirilmesi gerektiği için uzamış embriyoların ön ve arka uçlarını belirleyin. Genellikle ön uç yukarıda olduğunda, ön uçtaki ign membranı özelleşmiş bir yapı ile karakterize edilir. İğnenin küt ucunu kullanarak, embriyoyu agar boyunca hareket ettirmek ve arka ucunu delinmiş bir deliğe doğru yönlendirmek ve manevra yapmak için itin.Ardından, anterior ucu deliğe doğru itin. Embriyo, delme işlemi sırasında oluşan hafif çöküntü boyunca kolayca deliğe kaymalıdır. Embriyo yukarı doğru eğildikçe, onu deliğin daha derinlerine itin.Agar yeterince yumuşaktır, böylece bir embriyo delinen bir deliğe kısmen yerleştirildiğinde, zarar görmeden daha ileriye itilebilir. Tamamen itildiğinde, embriyo genellikle zaten oldukça dikey konumdadır. Eğer değilse, yerleştirilen embriyoyu yanlardan bastırarak daha dikey hale getiriyoruz.Delik çok büyük değilse, santrifüj boyunca embriyo konumu agar tarafından stabil bir şekilde tutulacaktır. Pratikle, plaka başına 100 ile 250 embriyo gömmek mümkündür. Gereken embriyo sayısı, sonraki uygulamalara bağlıdır.Montaj süresini kısa tutun. Embriyolar montaj sırasında gelişmeye devam ettiğinden, dar bir gelişim aşaması isteniyorsa, artan kullanılmamış embriyoları nemli bir fırça ve sinek fırçasıyla temizleyin. Ardından, agar içine monte edilen embriyoları bir santrifüje yerleştirin.Sinek embriyolarının bulunduğu plakaları, agar tarafı aşağı gelecek şekilde santrifüjün sallanan kovalarına yerleştirin. Santrifüjün dengeli olduğundan emin olun ve plakaları 4 ile 10 °C arasında, dakikada 4.000 devir hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, agar plakasını diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve bir iğnenin küt ucunu kullanarak plakayı bir kat TSS ile kaplayın.Embriyoları deliklerinden çıkarın. Embriyolar TSS içinde yüzer ancak batık halde kalırlar. Embriyolar; ön uçta kahverengi bir başlık, orta bölgede şeffaf bir alan ve arka uçta koyu gri bir bölge ile belirgin şekilde katmanlaşmış görünürler.Aydınlık alan veya epi floresan mikroskobuyla yapılan doğrudan gözlemde belirgin katmanlaşma göstermeyen embriyoları atın. TSS içindeki iyi katmanlaşmış embriyoları bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için P 200 pipet kullanın. Ardından, tampon çözelti içindeki embriyoları bir lam üzerine aktarın ve beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı şekilde sabitleyin.Embriyolar fikse edilecekse, TSS içindeki iyi tabakalanmış embriyoları bir sintilasyon tüpüne aktarmak için P 200 pipet kullanın. Embriyoları standart fiksasyon tekniklerini kullanarak fikse edin. Santrifüj edilen embriyolar için devitalizasyon adımının verimliliği düşük olduğundan.Mümkün olduğunca çok embriyo ile başlayın. Eğer embriyolar transplantasyon deneylerinde kullanılacaksa, embriyoları agar plakalara aktarın ve lamel üzerine yerleştirin. Standart embriyo taşıma prosedürlerini uygulayın; bu prosedürlere ilişkin referanslar yazılı protokolde bulunabilir.Santrifüjle indüklenen katmanlaşma onlarca dakika boyunca stabildir. Burada, santrifüj öncesindeki canlı oph embriyolarının, anterior ucu sola ve posterior ucu sağa, dorsal tarafı yukarıda ve ventral tarafı aşağıda olacak şekilde gösterilen parlak alan görüntüleri yer almaktadır. Bölünme evresindeki embriyolar tekdüze görünür.Bu tür kahverengi evreler, in vivo santrifügasyon için idealdir. Blastoderm embriyolarının, tüm yanlarda benzer görünen şeffaf bir kenarı vardır. Bu şeffaf çevre, blastülasyonun sonuna yakın bir zamana kadar genişler.Embriyolar, organizasyonun sonuna kadar santrifügasyon ile başarılı bir şekilde katmanlandırılabilir. Vitellus ve çekirdeklerin katmanlaşması, bölünme aşamalarındaki kadar tutarlı değildir. Hücresel embriyolar asimetrik görünmeye başladıktan sonra, dorsal ve ventral bölgeler belirginleşir ve çeşitli kıvrımlar gelişir.Gösterilen embriyo erken germ bandı uzaması aşamasındadır. Bu evrelerde, santrifüjleme artık ana organelleri tabakalara ayırmada etkili değildir. Embriyogenez süreklidir.Bu nedenle, bu aşamalar ayrı birer yapı değil, gelişim ilerledikçe birbirine dönüşen süreçlerdir. Bu zaman atlamalı film, cleavage aşamalarından itibaren embriyogenezin dört saatini yakalamaktadır. Germ band uzaması 720 kat hızlandırılmıştır.Burada, trans aydınlatma kullanılarak çekilmiş santrifüjlenmiş embriyo görüntüleri yer almaktadır. Soldaki embriyo iyi şekilde tabakalanmıştır. Düşük yoğunluklu lipid damlacıkları, en ön uçta bir lipid başlığı oluşturur.Yüksek yoğunluklu vitellus araçları, posterior uçta koyu gri bir bölge olarak birikir. Bu iki tabaka, diğer organelleri ve sitoplazmayı temsil eden geniş, şeffaf bir alanla birbirinden ayrılmıştır. Sağdaki embriyo, izolasyon sonrası santrifüj edilmiştir.Eğer bir epi floresan mikroskobu mevcutsa, katmanlaşma minimaldir. Santrifüjlenmiş bu canlı embriyolar, vitellusun yoğun mavi su floresansı gösterdiği UV eksitasyonu altında incelenebilir. Posterior poldeki otofloresan materyalin oluşturduğu kompakt bir tabaka, santrifüj işleminin başarılı olduğunu gösterir ve posterior uç için bir işaretleyici görevi görür.Embriyolar fikse edilirse katmanların görünümü önemli ölçüde değişir. Lipid damlacıkları yarı saydam hale gelir ve lipid tabakası, parlak alan mikroskobunda koyu kahverengi yerine beyazımsı ve tüylü görünür. Yo corso floresansı fiksasyonla kısmen veya tamamen yok olarak çok daha az yoğun hale gelir veya tamamen tespit edilemez olur.Bu görüntüde, organeller floresan işaretleyicilerle etiketlenmiştir ve işaretleyiciler anterior posterior eksen boyunca karakteristik konumlarda birikir. Belirli histon füzyon proteinleri hem lipid damlacıklarına hem de çekirdeklere lokalize olur, bu nedenle hem bu hücresel kompartmanları işaretlemek hem de etiketli çekirdek sayısı aracılığıyla embriyonun evresini izlemek için kullanılabilirler. Az önce gördüğünüz gibi, bu prosedürün en zorlayıcı yönlerinden biri embriyoların auger içine gömülmesidir.Ancak biraz pratikle, bunu hızlı ve verimli bir şekilde yapabileceksiniz. Bu teknik bir kez kavrandığında, normalde zahmetli olan kolokalizasyon deneylerini oldukça kolaylaştırır.Örneğin laboratuvarımız, ilgilenilen bir proteinin belirli bir ana organelde lokalize olup olmadığını floresan mikroskobu ile test etmek için rutin olarak bu tekniği kullanmaktadır. Ayrıca, biyokimyasal analizler veya transplantasyon deneyleri için santrifüj edilen embriyolardan tekil katmanlar geri kazanılabilir. Bu teknik sadece meyve sineği embriyoları için değil, genel olarak kullanışlıdır.Santrifüjleme, diğer türlerin yumurtalarında ve sitler gibi diğer büyük hücre tiplerinde de organelleri yoğunluklarına göre ayırır.

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz ayrı primer hücrelerin hazırlanması için ayrıntılı bir...

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir...

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder.

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Burada, konvansiyonel lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için erken Drosophila embriyolarında genişleme mikroskobunun uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Öğrenin, Drosophila embriyolarında canlı organel ayırma yöntemini. Agar içine yerleştirilen embriyolar santrifüjle yoğunluğa göre ayrılır ve biyokimyasal analiz için kesirler elde edilir.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

Daha fazla video keşfet