Name: 網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ人胎児網膜色素上皮細胞の培養法。網膜の生理機能と病態を研究するための実験モデルを確立し、眼疾患治療の基礎研究に活用できます。

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我々は、これらの細胞培養を特徴づけるの助けのためのラボはメンバージェフリーAdijanto、ティナBanzon、容里、秦ワン、Congxiao張静趙、コニー志、Awaisジア、ナタリアStrunnikovaに感謝。細胞培養の大型株を維持する上で彼らの助けのための静趙、コニー志、そしてティナBanzonに感謝。 この作品は、健康学内研究プログラムの国立研究所によってサポートされていました。

1。人間の胎児の組織すべての人間の組織に関連する研究はヘルシンキ宣言およびNIHの機関審査委員会の教義に従っています。胎児の目は氷の上にパックされたチューブを（ABRによって提供される）を含むRPMI - 1640培地に置かれた妊娠16〜22週でのランダムドナー、、から、独立した売春斡旋人、高度なバイオ資源（ABR、アラメダ、カリフォルニア州）によって得られる、とされています一晩優先配信サービスによって配信。組織は摘出後に実行可能な最大48時間のまま。 2。細胞培養培地 MEM -α改変培地（Sigma - Aldrich）を5％及びRPE細胞の培養は15％血清含有培地（下記の表1 RPE培地）を調製するための基本培地として使用されます。 <table border="1"><tbody><tr><td>の名前</td><td>シグマ</td><td>ギブコ</td><td>量は</td><td>ストレージ</td></tr><tr><td> MEM、アルファ修正</td><td> M - 4526 </td><td></td><td> 500 mLの</td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1サプリメント</td><td> N - 6530 </td><td></td><td> 5 mLの</td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 mLの</td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td>グルタミン - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 mLの</td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td> M - 7145 </td><td></td><td> 5 mLの</td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td>タウリン</td><td> T - 0625 </td><td></td><td> 125 mgの</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td> H - 0396 10 </td><td></td><td> 10μgの</td><td></td></tr><tr><td>トリヨードthyronin </td><td> T - 5516 </td><td></td><td> 0.0065μgの</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清** </td><td></td><td></td><td> 5パーセントまたは15％ </td><td> -80℃の</td></tr></tbody></table> 表1。 500mLの培地の調製のためのヒト胎児RPEの培地成分 * THTは、培地を作る前に1 1.5 mLのPBSでタウリン-ヒドロコルチゾン - トリヨードthyroninを溶解することによって行われます。複数のアリコートを-80℃で作られ、保存されています° Cで培養液の培養の準備を簡素化する。 **ウシ胎児血清はSigma - Aldrichまたはギブコから入手されていません。 メディアの準備のために使用されるウシ胎児血清は、アトランタバイオ（ノークロス、ジョージア州）から取得されます。血清の各ボトルは、使用する前に（56℃1時間のための）不活化熱です。彼らはメディアの製造のために使用されるまで、同一ロットからの血清の細胞培養の一貫性、大量性を確保するために購入し、-20℃で保存されています。別のロットから20％FBSを含む培地で数週間のためにウェルプレート - または12 - hfRPE細胞の特定のバッチからまばらに播種された細胞を24で栽培されています。最も古典的なRPEの形態（敷石）と最も急速に成長してmelanated細胞は細胞培養に使用できる適切な血清ロットを示している。 細胞培養の培地にも含まれています：N1サプリメント（Sigma - Aldrich）を1:100 mLの/ mLの、グルタミン/ペニシリン - ストレプトマイシン1:100 mLの/ mLの（Gibco社）、および非必須アミノ酸溶液（Sigma - Aldrich）を1:100 mLの/をmLの。加えて、ヒドロコルチゾン（20μg/ Lの）、タウリン（250 mg / L）を、とトリヨード- thyronin（0.013μg/ Lの）（THT）は1:500の最終濃度になるようにPBSでこれらの3つのコンポーネントを溶解することによって先に用意されています（ml / ml）と。 RPE培地に添加するまで、THTのアリコートを80℃で保存されています。 3。細胞の文化 3〜5分（下記の図1）のプラスゲンタマイシン（1 mg / mLの）領収書に、無傷の地球儀は（Invitrogen社;カタログ番号15240から096。。10倍に希釈）抗生物質抗真菌剤溶液で洗浄する。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。インキュベーションの抗生物質は、HBSSまたはPBSなどの培地で2回洗い流したされた後。一度に片方の眼の世界は、Sylgard - 184（WPI）でコーティングした10cmペトリ皿に移し、27G針で固定されています。皆伐即したナイフ（アルコン社）を使用して切開は毛様体（前面に目の赤道からの距離の1 / 3）以下の強膜を介して行われます。この切開は、前眼部を除去するための円形のカットを開始するために使用されます。このカットは、1つのブレード鋸歯状（FST）とタングステンカーバイドコーティングされた湾曲した虹彩のはさみを使って行われます。眼の前部分の除去に先立って、カットは、rを切り離す避けるために硝子体を介して行われる後極でのRPEからetina。 （。。2 U / mLの、カタログ番号04942086001、ロシュダイアグノスティックス、インディアナポリス、IN）眼の前方部分が除去された後、後極はディスパーゼ- Iの溶液と共にインキュベートされる40〜60分に5％血清を含む培地で37 ° C - 5％CO 2。ディスパーゼ処理後、後部の極は、シリコンのパディングを持つペトリ皿にHBSS（Sylgard 184、ダウコーニング、ミッドランド、MI）に転送され、象限または十分に組織をフラット化してより大きな部分に解剖。その後、網膜は、静かにピンセットで除去する。シングルセルRPE層はシートに剥離し、冷トリプシン- EDTA（ギブコ、＃25200〜056）溶液中に直接採取された。 RPEが収集された後、トリプシン- EDTAで組織を持つチューブは37℃10-15分のために水浴中に密封され、転送され、℃のインキュベーションの10分後、チューブを精力的に小さなクラスターにRPEを分離するために振とうする。分離が完了していない場合、チューブは、別の5分間水浴中に戻って配置されます。トリプシン- EDTAのインキュベーション後、試験管を可能な限り非溶解混合細胞クラスターのために検査されます。どんな観測されたクラスターが細かい先端がガラスパスツールピペットを用いて除去される。 （4分のための臨床遠心1.4回転）スピンダウン後、hfRPE細胞は15％のRPEのメディアに再懸濁しているし、Primariaフラスコ（例入れ：カタログ番号08-772-45、フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア州。。 ）。この培地を、5％血清を含むRPEの培地で1日後に交換され、そしてその後の変更は2〜3日ごとに行われた。 3〜4週間後、細胞がコンフルエントと一様に色素となった。彼らは、15％血清含有RPE細胞培養の培地に再懸濁し、1ウェルあたり150〜200K細胞（トランスウェルで明確な細胞培養インサートに播種、10〜15分間0.25％トリプシン- EDTAでトリプシン処理し、コーニングコースター、 12 mm径のインサートを使用してニューヨーク州コーニング）、、0.4ミクロン孔、ポリエステル膜（例：。。カタログ番号07-200-161、フィッシャーサイエンティフィック）。播種前に、井戸は人間の細胞外マトリックス（。。ウェルあたり150μLHBSS中の10μg、カタログ番号354237、BD Biosciences社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）でコーティングされ、2時間のフードにUV光で硬化。いくつかのケースでは、トリプシン処理の手順は、最初にトリプシン処理した後、デタッチしていない細胞を収集するため、二度目の繰り返された。同じプロトコル（ECMでコーティングを除く）は、細胞のP1の人口を生成するためにフラスコで培養細胞に使用されていました。彼らは≥200Ω•cm 2の総組織の抵抗を持っていて、一様に色素沈着したときに、これらの細胞を実験に使用した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">大きな図1は、ここをクリックしてください</a> 。 4。段階的な手順<ol><li>複数の解決策（それぞれの目に対して必要に応じて4ウェル）を12ウェルプレートを準備します。 <ol class="lalpha"><li> 10倍の抗生物質抗真菌ソリューションを追加 - 1も/目</li><li>すすぎのためにPBS / HBSS溶液を追加 - 2井戸/目を</li><li>ディスパーゼのソリューションを追加 - 1も/目を</li></ol></li><li> 5固定針を開梱し、HBSSで塗りつぶすことにより、ペトリ皿を解剖準備</li><li>アンパック目と3〜5分（ステップ1で調製した）のために抗生物質 - 抗真菌剤溶液中にそれらを置く</li><li> PBS / HBSSで2つの井戸で目を（ステップ1で調製した）洗い流した後、解剖皿に移す。 </li><li>トリム過度の筋肉と目の周りの結合組織</li><li>セキュリティで保護された27G針（シリコンベースに突き止める）角膜が上を向く方法でそれらを整列させる解剖皿に目を使う。 </li><li>即したナイフを使用すると、円形のカットが開始される角膜下に切開を加えること</li><li>使用して虹彩のはさみは、硝子体を切ってと離れて目の前方部分を持ち上げると同じハサミを使って、目の周りに予選通過。 注：ステップ3〜8は眼球への過度の機械的な圧力を避ける。 </li><li>ディスパーゼ溶液中に開いている目を移す（ステップ1で調製） </li><li> 37℃で40〜60分のためにアイカップをインキュベート° Cで5％CO 2 </li><li>新鮮なもので皿を解剖にHBSS溶液を交換してください。 </li><li>ディスパーゼ溶液から解剖皿に目を移す。 </li><li>位置は、ペトリ皿の眼（眼球のコップが上を向く）と2つの27G針で固定します。 </li><li>静かに部分的に分離された網膜を持ち上げ、網膜ハサミを使用すると、視神経から網膜をカット。網膜を捨てる。 </li><li>アイリスのはさみを使用すると、視神経に向かって眼の周囲から一切開を行います。 </li><li> 5つすべての27G注射針を使用すると、きれいに伸ばして目を作るRPE層を平坦化。 </li><li>網膜はさみを使用すると、添付ファイルから視神経にRPE層を分離する視神経の周りに円形のカットを行います。 注：ステップ13から17は、低倍率でまたはステレオ顕微鏡なしで行うことができます。 </li><li> 250倍の倍率の実体顕微鏡を調整します。以上と虹彩ハサミによるカットに沿って視神経に近いRPEシートのエッジを見つける。 </li><li> two鉗子脈絡膜組織層とは別のRPE -ブルッフの膜を使用する。それは、RPEと脈絡膜の接続が最も弱いものであるエッジに沿った領域を見つけるためにいくつかの試みが必要になる場合があります。 </li><li> 15 mLの試験管に冷トリプシン- EDTA溶液にRPEのシートを置きます</li><li> RPEの後に37℃で10 15分のために水浴中にトリプシン- EDTAの組織で、キャップと熱管を集めている℃を</li><li>インキュベーションの10分後、精力的に小さなクラスターにRPEを分離するために15 mLの試験管を振る。分離が完了していない場合、別の5分間水浴に戻しチューブを置きます。 </li><li>可能な非溶解混合細胞クラスターのためのチューブを点検します。どんな観測されたクラスターが細かい先端がガラスパスツールピペットを用いて削除する必要があります。 </li><li> （4分のための臨床遠心1.4回転）hfRPE細胞をスピンダウン、15％RPEメディア（9 mLの合計）で上清を除去し、再サスペンド細胞</li><li> Primariaフラスコに細胞懸濁液3 mLを入れて次の日まで、新鮮な15％のRPEのメディア、インキュベーターに場所のフラスコの2 mLを加える（37℃、5％CO 2） </li></ol> 5。代表的な結果 hfRPE細胞培養の機能検証以前の実験では、細胞膜輸送タンパク質の発現、偏光と機能を決定し、それらが適用されるプロパティセットの検証を提供蓄積されるとRPEの機能を1月11日これらの特性を制御する特定のシグナル伝達経路を同定するためにこれらの一次培養を使用している各セルの世代へ。実験では、上皮流体の輸送と細胞間隙経路の完全性を決定するタンパク質を同定以下にまとめる。 in vitroの実験で 、これらは、網膜再再付着6の動物モデルで検証されています。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 hfRPE細胞におけるCFTRの局在 左上部パネル：。CFTRが膜濃縮エキスを使用してhfRPE細胞で検出された。 M、分子量マーカー、 レーン1、センター下部パネルの主要な成熟（バンドC）と未熟な（とBバンド）：CFTRの免疫局在（緑ラベル） 右上のパネル：表示のz平面を介して拡大断面図。。 z軸を介して最大強度投影。 ZO - 1は、（赤のラベル）RP​​E細胞の先端および側底側面の輪郭を描くタイトジャンクショ​​ンのマーカーとして機能します。 DAPI（青）は原子核に近い基底膜にあるラベルを付けます。 ZO - 1は、その赤いラベルと重なるCFTRから緑色蛍光以来、のような黄色/オレンジ色が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。 hfRPEにおけるIFNγによって誘導される生理的変化：。基底風呂にIFNγを追加するには、プライマリ、培養hfRPE細胞の単層を介して上皮流体の輸送（J V）を増加J vは上のトレースに時間の関数と純流体としてプロットされます。吸収（基底槽に心尖部）が正の値で示されます。経上皮電位（TEP）との合計組織の抵抗は、（R、T）ボトムトレースに時間の関数としてプロットされています。 B：基底槽へCFTRinh - 172（5μM）の添加によりIFNγ刺激によるJ Vの増加を抑制した。 下記のin vitroでの調査結果で hfRPEを確認する動物モデル実験の例です。この実験では、人工的に作成された網膜剥離が著しく（図4、B）外部の眼の表面にIFNgを添加した後に減少した。この効果は、部分的にによってブロックすることができます：cAMPのブロッカー（図4D）の（1）に加え、（2）完全にJAK + cAMPのブロッカーの添加後にブロック。以下の画像は、OCTのスキャナを使用して取得されます。 <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。 生体網膜剥離の実験では。vivo実験で 、これらの手順は、以前に詳細6に記載されている。これらの実験では、網膜剥離は、単独でまたはJAK - STATおよびPKA経路の阻害剤の組み合わせと、網膜下腔（SRS）に変更されたPBS溶液の0.5から3μLの注入によるラットの眼で作成されていました。各実験は、網膜剥離の作成後に40〜70分の初期制御周期を持っていた。この時間の間に、ブレブ体積の変化率は、ブレブ安定性を確保するために測定した。光コヒーレンストモグラフィイメージングは​​（応用物理学研究所、ロシア科学アカデミー、ニージニーノブゴロド、ロシア）SRSの体積変化の時間経過を測定するために使用されていました。 再付着巻の時間的経過UMEの変更は、光コヒーレンストモグラフィ（OCT）により測定した。 40〜70分間前面にIFNγを添加した後剥離の大きさの変化（A、B、およびDの矢印）を示し、4種類の実験（AD左側のパネル）からOCTは、画像。 IFNγは、そのコントロール率（≈2μlの•cm 2で •時間-1）〜14日に合弁会社を増加し、それぞれ12μL•cm 2と •HR - 1、ていることとBのパネルが展示。 JAK - STAT経路とPKA阻害剤（CとD）、IFNγの添加後-誘起吸収率が有意に0.2と7.9に減少したμL•cm 2と •HR - 1、それぞれ。矢印は、破線で囲まれた領域、（開始量）との比較のためにブレブの境界を示している。図の右側に：いくつかの実験から測定されたJV率のトップパネルの要約、（パネル-映画真ん中<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">はここをクリック</a> ）、青でBの擬似カラーでまとめた実験の下部パネル- 3Dのセクションでは、t = 0で剥離の空間的な範囲を示し、 INFγの添加後40分。 全ての動物実験は、ビジョンと眼科文の研究のための協会に準拠して実施された。プロトコルは、国立衛生研究所の動物実験委員会によって承認された。

<ol><li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li>
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<li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li>
<li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+localization%2C+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+%28JAM-C%29+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li>
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<li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-C+and+-D+induced+proliferation%2Fmigration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li>
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<li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment%2C+migration%2C+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium%3A+relevance+for+proliferative+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li>
<li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling%2C+ion%2C+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li>
<li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%29-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

本実験では、我々は目ごとに使用可能な細胞の高い数字と一致してhfRPE初代培養を生産するために必要な複数の手順を合理化するために設計された私たちの以前に発行されたtechniques 3の追加の変更を説明します。元のプロシージャ内の各変更は、厳密に変更がアーチファクトを導入せず、継続的にこれらの細胞を使って多くの他のラボでテストされていることを保証する複数の生理学と分子生物学の実験において試験した。最後に、追加の実験が動物モデルで同様の摂動をin vitroでの結果を比較するために実施した。

解剖のプロトコルに必要な計測器<ol><li>ステレオ顕微鏡 - 解剖に必要な作業倍率X250で利用可能な任意の</li><li>解剖皿 - などキンブル100 × 20ミリメートル＃23062（郭ごとに）任意のソース</li><li> Sylgard 184 - WPI猫。 ＃SYLG184 * *料理がSylgard 184はミキシングの指示に含まれる従っ解剖準備するには、5〜8ミリメートルの層を形成するために、ペトリ皿に混合液エラストマーを注ぐ。エラストマーは、少なくとも24時間のために治すことができます。硬化エラストマーと料理を70％エタノールおよび再利用を複数回（〜100倍）を使用して滅菌することができる</li><li> BD PrecissionGlide 1から27 Gの針¼の長さ（解剖あたり5）任意のソース</li><li> CaおよびMgの塩を含有するHBSS 1Xソリューション - GIBCOカタログ番号14025 500ミリリットル（複数の解剖のための良い）。 </li><li>アイリスはさみ炭化物鋸歯状刃、曲面 - FST猫＃14559から11（一）。 </li><li>網膜はさみ - Katena猫＃K4 - 5300（いずれか）。 </li><li>鉗子 - などデュモンピンセット＃5 WPIの猫から洗練されたヒントと＃500085（2個）。 </li><li>即したナイフ - アルコン、皆伐さ1mm、重ベベル、傾斜カタログ番号8065921540。 </li><li>チューブの15ミリリットルを遠心 - （眼ごとに）任意のソース</li><li>パスツールガラスピペット - （郭ごとに）任意のソース</li><li>ウェルプレート12（郭ごとに）任意のソース</li><li> Primaria 25センチメートル2フラスコ- （眼あたり2-3）任意のソース</li></ol>

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

 Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

我々は、天然のヒトRPEの形態学的、生理学的および遺伝的特性を持つ主なヒト胎児網膜色素上皮（hfRPE）文化のコンフルエントな単層を大量に作り出すことができる細胞培養の手順を開発しました。これらhfRPE細胞培養は、大量の色素沈着を示し、電子顕微鏡では、豊富な頂端膜の微絨毛を示す。接合部複合体は、様々なタイトジャンクショ​​ンタンパク質の免疫蛍光ラベリングと同定された。これらを簡単に再現可能な初代培養の上皮極性と機能は密接に以前にヒトを含むネイティブRPEの哺乳動物モデルを、研究に似ています。これらの結果は、人間の眼疾患のいくつかの動物モデルにおける治療的介入の開発によって拡張されました。我々は、網膜や網膜下腔の異常な体液の蓄積を除去するための戦略に焦点を当てている。細胞外網膜下腔は、感光体の外側のセグメントとRPEの頂端側細胞膜を分離し、網膜添付ファイルのメンテナンスとRPE /網膜の相互作用の全体をホストするための非常に重要です。

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。

我々は、大量のヒト胎児網膜色素上皮一次細胞のコンフルエント単層を調製できる細胞培養法を開発しました。

この手順の全体的な目的は、モデルとして使用可能なヒト胎児網膜色素上皮（RPE）の培養物を生成することです。ヒトの眼疾患の研究では、ドナーから眼球全体として組織が提供されます。本手順の最初のステップは、余分な筋肉と結合組織を取り除き、角膜と水晶体を摘出して眼球を開くことです。眼球をdispaで処理して平坦化し、次いで脈絡膜からRPE単層を剥離します。解剖したRPEをフラスコに播種し、単層がコンフルエントになり色素が形成されるまで数週間培養します。これらの細胞培養物は、in vitro機能実験に使用されます。in vitro実験で成功した内容は、より複雑なシグナル伝達環境においてRPEの応答をより適切に評価できる前臨床試験動物モデルで再現されます。本手法で示すモデルは、RPEの生理学的機能のさらなる理解と、眼疾患治療のための新たな治療介入につながるものです。こんにちは、シェルドン・ミラーです。私の研究室は、メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所（NIH）キャンパス内にある国立眼科研究所（NEI）にあります。こんにちは、Miller LabのArkiです。本日は、ヒト胎児網膜色素上皮細胞の初代培養を調製する手順をご紹介します。これらの細胞は、改良シンチャンバーに搭載可能なコンフルエント単層として調製されます。また、これらの単離したヒトRPE細胞を、生化学および遺伝学の研究にも使用します。当研究室ではこの手順を用いて上皮細胞の一次培養を確立し、生理学的および病理生理学的プロセスの機能と調節に関する研究や、疾患の臨床動物モデルの開発を行っています。ここでは、眼球の背面に位置し、神経網膜と脈絡膜の血流を隔てている網膜色素上皮（RPE）に焦点を当てます。この眼球の模式図は、光受容体に隣接した眼球背面におけるRPE層の位置を示しています。挿入図は網膜の細胞を示しており、右側に光受容細胞、左側に神経節細胞が配置されています。この上皮は代謝的に極めて活性が高い組織です。日次的に光受容体を絶えず貪食し、視覚色素であるビタミンAを貯蔵、変換、および光受容体へ輸送します。視覚サイクルにおいて、この上皮は周囲の細胞外空間の化学組成と容積を維持するために恒常的に作用します。上皮細胞の極性は極めて重要な特性です。頂端膜および基底側膜へのタンパク質の継続的な非対称輸送は制御されたプロセスであり、これにより上皮は、ある細胞外空間から別の細胞外空間へと代謝物、イオン、および液体をベクトル的に輸送することが可能になります。この活動は、上皮が神経網膜の健康と完全性を維持するのに役立っています。本稿で述べるin vitro調製法を用いることで、解剖を開始する前に、上皮の極性と機能を決定する輸送タンパク質、受容体、およびシグナル伝達経路の解析が可能になります。ラミナーフローフード内で、室温の溶液を用いて12ウェルプレートを準備します。眼球1つにつき、10倍濃度の抗生物質・抗真菌剤溶液を1ウェル、1倍濃度のXPBSを2ウェル、および5% RPE血清含有培地で希釈した2 units/mLのdisc spaceを1ウェル用意します。シリコンパッド付きの解剖皿に1倍濃度のH-B-S-Sを満たし、液体を排出した後、各眼球を抗生物質・抗真菌剤溶液のウェルにそれぞれ移します。室温で3〜5分間インキュベートします。眼球に過剰な圧力をかけないように注意してください。余分な抗生物質を除去するため、XPBSが入った2つのウェルで順次眼を洗浄します。次に、解剖用ステレオ顕微鏡下で、ピンセットを用いてそれを1X-H-B-S-Sを満たした解剖皿に移します。アイリス剪刀を用いて、眼球周囲の余分な筋肉および結合組織を除去します。角膜が上を向くように眼球を配置します。2本の滅菌済み27ゲージ針を用い、強膜を損傷しないように結合組織で眼球をシリコンパッドに固定します。この状態で、サイドポートナイフを使用して強膜に切開を加えます。切開部位は、眼球赤道から前方表面までの距離の3分の1の位置としてください。虹彩剪刀を使用して、網膜色素上皮（RPEと略記）が硝子体網膜の牽引によって損傷するのを避けるため、眼球の周囲を円状に切り進めます。同じ剪刀を用いて硝子体を切断し、前眼フラップを眼杯から分離します。IOAの前方を持ち上げて取り除きます。ピンセットを使用して、開眼した眼球をdysのウェルに移動させます。眼球内に気泡が入っていないことを確認してください。37 °C、5% CO2条件下で40分から60分間インキュベートします。眼球をディスクスペースから、新鮮な室温の1X HBSSを満たした解剖皿に戻します。眼球のカップ側を上に向け、2本の27ゲージ針で固定します。解剖顕微鏡下で、精密ピンセットを用いて、部分的に剥離させた網膜を網膜用ハサミでそっと持ち上げます。視神経から網膜を切り離します。切り出した網膜を虹彩用ハサミで除去します。眼球の周辺部から視神経に向かって切開します。27ゲージの針5本を用いて、眼球をピンで固定し広げます。RPE層を伸展させるため、網膜用ハサミを使用して視神経の周囲を円状に切開します。倍率を250倍以上に切り替えて、RPE層を分離します。虹彩剪刀で切開した部位に沿ったRPEシートの端を、視神経の近くで探します。2本のピンセットを使用して、RPEおよびブルッフ膜を脈絡膜組織層から分離します。切断端に沿った数箇所を試し、RPEと脈絡膜の結合が最も弱い箇所を探します。膜をゆっくりと剥がして、完全に除去します。RPEシートを、室温のtrypsin-EDTAを満たした15 milliliterコニカルチューブに入れます。すべてのシートを回収したら、チューブにキャップをし、37 °Cのウォーターバスで10分間インキュベートします。チューブを激しく振って、RPEを小さなクラスターに分離させます。色の濃い細胞の塊が見られなくなれば、分離は完了です。チューブをウォーターバスに戻し、さらに5分間静置します。ペステール、ピペット、および緩やかな吸引を用いて、未消化の組織残渣を除去します。遠心分離機を用いて、280 5Gで4分間、細胞を遠心沈降させます。上清を除去します。15% RPE培地を用いて最終容量を9 mLに調整し、再懸濁します。細胞懸濁液 3 mLを25 cm²フラスコに分注します。室温の新鮮な15% RPE培地を2 mL加えます。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩培養します。培養が進むにつれ、3〜4週間後に色素沈着が増加します。培養に成功すると、細胞はコンフルエントになり、均一かつ濃い色素沈着が見られます。以上が、ヒト胎児網膜色素上皮（RP）一次培養の調製方法です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

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加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

眼の網膜色素上皮層に影響を及ぼす変性眼疾患は、単一遺伝子および多遺伝子起源を有する。いくつかの疾患モデルとソフトウェアアプリケーションであるLipidUNetは、疾患のメカニズムと潜在的な治療介入を研究するために開発されました。...

LipidUNet-機械学習に基づくiPS細胞由来網膜色素上皮を用いた脂質沈着物のキャラクタリゼーション・定量法

このプロトコルは局部的に供給されたブタの目から第一次網膜の色素の上皮(RPE)のセルを得、培養するためのプロシージャを概説する。これらの細胞は、幹細胞の高品質な代替品として機能し、 in vitro...

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網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。...

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

学ぶ人胎児網膜色素上皮細胞の培養法。網膜の生理機能と病態を研究するための実験モデルを確立し、眼疾患治療の基礎研究に活用できます。

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