Name: 成人和胚胎骨骼的肌肉Microexplant文化和骨骼肌肉干细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-21T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: 学习使用微切割外植体技术从成年小鼠或胚胎骨骼肌中分离骨骼肌干细胞，用于研究细胞行为和再生医学应用。该方法支持体外扩增和体内移植研究。

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我们感谢Patrick Paddison赠送shRNAi穿梭载体。Angela Sloan生成了图3中的GFP RNAi图像。我们还感谢以下资助机构的支持： 
肌肉萎缩症运动组织资助编号RA2/592/2；SPARKS资助编号02BHM04；英国皇家学会资助编号574006.G503/1948./JE；以及英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）资助编号6/SAG10077。

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<li>Smith, J., Fowke, G., Schofield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+dystrophic+%28mdx%29+muscle+is+inhibited+by+IGF-II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in dystrophic (mdx) muscle is inhibited by IGF-II.</a> Cell Death Differ. 2, 243-251 (1995).</li>
<li>Smith, J., Schofield, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+an+mdx+skeletal+muscle+cell+line+into+dystrophic+%28mdx%29+skeletal+muscle%3A+evidence+for+stem+cell+status%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Stable integration of an mdx skeletal muscle cell line into dystrophic (mdx) skeletal muscle: evidence for stem cell status.</a> Cell Growth Differ. 8, 927-934 (1997).</li>
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<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells+AQ4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells AQ4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1443-1448 (2002).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

显微解剖外植体培养可用于可靠且可重复地分离细胞群体，其中增殖性Myf-5阳性骨骼肌干细胞（SMSc）的比例极高（约85%）。在本文所述的严格控制的培养条件下，原代外植体培养可用于表征基因突变小鼠SMSc的生长行为，并可用于生成肌管，以进行体外分化过程的详细分析。通过仔细维护和操作这些培养物，可实现长期培养与扩增。根据本文所述方法，还可通过单细胞稀释法从外植体培养中建立克隆性骨骼肌干细胞系。在克隆过程中，为促进分离的单个细胞增殖，使用“条件培养基”以模拟这些细胞在高密度培养条件下的正常需求。该方法（经适当调整后）适用于胚胎期、成年期及老龄成年期组织，除小鼠外，还可用于从其他物种（包括人类（Rao和Smith，未发表）、鸡胚和鱼类（鲑鱼））的骨骼肌中分离细胞。 24克隆来源的SMSc可进行分析 体内 通过肌肉内移植，在这些条件下注射的骨骼肌干细胞（SMSc）将与宿主肌管融合，形成杂合肌纤维。肌肉内注射的SMSc不会形成肿瘤，并且在注射后超过一年仍可在宿主肌肉中位于卫星细胞位置被发现，表明它们受到卫星干细胞微环境的内源性调控。这些细胞在注射宿主后12个月以上仍可重新分离出具有增殖能力的SMSc。 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 1:1 混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>液体培养基：（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基&amp;rsquo;s 培养基和 Ham&amp;rsquo;s F12 培养基，1:1 v/v</td></tr><tr><td>100&amp;#215; 谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>稀释于培养基中至1&amp;#215; 2 mM 浓度（Glutamine HYBRI-MAX R）</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>来自多家不同的公司</td><td></td><td>在原代培养物和骨骼肌细胞系中进行批次测试。以10-20%的比例添加至液体培养基中</td></tr><tr><td>Heraeus Labofuge 300</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>可达到1,000 rpm的实验室离心机</td></tr><tr><td>15 ml Falcon 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>必须适配实验室离心机</td></tr><tr><td>组织培养塑料器皿（25、75 或 175 mm² 组织培养容器；96 孔组织培养板；60 mm 培养皿）。</td><td>Nalge Nunc International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿的 CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Heraeus 培养箱</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>我们的设备为铜衬里，推荐用于减少污染</td></tr><tr><td>带有层流空气系统的无菌罩（Heraeus）</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>我们使用的是II级生物安全柜 &amp;#8211; 适用于人组织的使用</td></tr><tr><td>水浴</td><td>资助设备</td><td></td><td>始终保持在37&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>用于动物、解剖器械的灭菌以及工作台、超净台等的擦拭消毒 </td></tr><tr><td>无钙、镁磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>经细胞培养测试的PBS（Dulbecco&amp;rsquo;s 公式）以预混粉末或片剂形式购买，使用前用双蒸水配制，并通过高压灭菌进行灭菌。PBS 包含 2.68 mM 氯化钾（KCl）；1.47 mM 磷酸二氢钾（KH2PO4）；0.137 M 氯化钠（NaCl）；和 8.1 mM 磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4). PBS 可按如下方法配制：200 mg KCl，200 mg KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，8 g NaCl 和 1.15 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/升双蒸水，经高压灭菌。&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>CryoTube 冻存管</td><td>Nalge Nunc International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 血细胞计数板和盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>用于细胞计数的估算</td></tr><tr><td>手动计数器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜，Zeiss Stemi 1000</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td>用于外植体的制备</td></tr><tr><td>小型无菌罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌解剖器械（包括珠宝匠&amp;rsquo;s 镊子</td><td></td><td></td><td>经高压灭菌器灭菌</td></tr><tr><td>无菌塑料收集管（7 ml 比约管或 20 ml 通用管）</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>预热 PECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>在无菌操作台中配制并升温至37&amp;#x00B0;C，置于组织培养水浴中。DMEM:F-12 培养基添加 20% FCS、1% 谷氨酰胺和 1% 青霉素 &amp;amp; 链霉素溶液</td></tr><tr><td>Dispase (50 &amp;mu;g/ml，相当于 6 单位/mg </td><td>可从英国 MP Biomedicals 公司获取</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;g/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>用于凋亡和有丝分裂的显微观察</td></tr><tr><td>Vectashield 荧光封片液</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光直立显微镜配备紫外滤光片（我们使用的是 Nikon Eclipse E600）</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数码相机及成像软件（我们使用 Nikon Coolpix 995 相机；Nikon D3 相机）</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OpenLab4.0a 软件</td><td>珀金埃尔默股份有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

培养的胚胎期和成年骨骼肌细胞具有多种不同用途。本章节所述的显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出数量相对较多的增殖性骨骼肌细胞，作为骨骼肌干细胞的来源。作者已利用显微解剖的外植体培养方法，分析了野生型和营养不良型肌肉中骨骼肌细胞的生长特性。组织生长的各个组分，即细胞存活、增殖、衰老和分化，均可通过本文所述方法分别进行分析。通过测量外植体的生长速率，可确定所有生长组分的总体效应。微型外植体方法可用于建立来自多种不同类型和年龄肌肉的原代培养，并且如本文所述，作者已对此方法进行了改进，以实现胚胎期骨骼肌前体细胞的分离。
独特的是，微植块培养技术已被用于获得克隆性（单细胞来源）骨骼肌干细胞（SMSc）系，这些细胞系可被扩增并用于 体内 移植 体内 移植的SMSc表现为功能性、组织特异性的卫星细胞，能够参与骨骼肌纤维的再生，同时也在卫星细胞微环境中被保留下来，形成一小部分未分化的干细胞池，可通过微组织块法重新分离并进行体外培养。

显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出具有增殖能力的骨骼肌细胞，以获取骨骼肌干细胞。这些细胞具有独特性，可通过克隆化培养获得骨骼肌干细胞系，用于体内移植。

培养的胚胎和成年骨骼肌细胞具有多种不同用途。本章所述的显微解剖外植体技术是一种……

本实验的总体目标是从成年动物或胚胎来源的显微解剖组织植入物中分离出富集的骨骼肌干细胞群体，以研究其行为与功能。这些细胞也可能具有治疗用途。该目标首先通过在无菌条件下从成年小鼠尸体中解剖目标肌肉，或从子宫组织中取出胚胎来实现。该步骤的第二步是洗涤并清理成年肌肉组织，分离出脂肪和结缔组织，并将胚胎组织转移至新鲜的DF 20培养基中。去除外层膜结构和内部器官，将组织转移至新鲜DF 20培养基，然后进行解剖以分离富含肌肉的区域。该操作步骤的第三步是将分离的组织切割成400微米的组织块。将外植体逐一转移至96孔板中央的60个孔中，并在37摄氏度下孵育。该操作步骤的最后一步是进行细胞计数。细胞将从成功的X型外植体中开始出现，时间可能在数小时至两周内，具体取决于组织来源。最终可获得结果显示，细胞从成功的X型外植体中开始迁移出来，这些细胞可被扩增，并随后用于多种体外和体内实验，包括增殖与凋亡研究以及蛋白标志物的鉴定。这些细胞还可进行克隆化培养、遗传修饰，并最终移植到宿主体内，用于再生研究或治疗应用的测试。大家好，我是来自伯明翰大学生物科学学院骨骼肌干细胞生物学实验室的 Janet Smith。我是 Janet Smith 实验室的 Lana Dean，我是 Byron Chen，也来自 Janet Smith 实验室。今天我们将向您展示一种从成年动物和胚胎肌肉中获取的显微解剖肌肉组织来分离骨骼肌干细胞培养物的操作方法。我们在实验室中采用此方法研究骨骼肌干细胞的行为，例如增殖、凋亡和分化，以及研究肌营养不良等疾病中骨骼肌干细胞功能的异常。现在让我们开始。从骨骼肌中建立微组织块培养的基本方法，始于在无菌条件下从一只新鲜的冷处死小鼠中解剖目标肌肉。在此演示中，解剖后肢肌肉，用DF 20培养基洗涤两次以分离肌肉，然后将其放入盛有新鲜DF 20培养基的60毫米培养皿中。在无菌条件下，使用体视解剖显微镜仔细进行显微解剖，去除脂肪、结缔组织和骨骼。接着，使用珠宝镊子将清理后的肌肉组织切成400 µm的立方体。将肌肉组织块分别放入96孔板中央的60个孔中，每个孔内含有50 µL DF20。在周围孔中加入生理盐水，以防止含有离体组织的孔干燥。在显微镜下检查各孔，随后将96孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。显微观察贴壁和细胞迁移生长在培养24至48小时后进行评分，之后根据所培养肌肉的生长速度，每隔48至72小时重复评分。图中显示了成年骨骼肌组织外植块培养第2天的迁移生长情况，以及已建立的外植块迁移生长，其中包含聚集的细胞集落和高细胞密度。每个外植块的评分依据是各孔中细胞的汇合程度，该评分方法将在后续用于SMS细胞的扩增与分离示例中予以展示。应单独监测具有主要为SMS细胞形态的细胞的外植体培养，即呈高折光性的球形单核细胞，并以聚集的细胞簇形式生长。该操作步骤首先从子宫中分离E 12.5胚胎，E 11.5至E 17.5阶段的胚胎也可采用此方法进行分离。将胚胎单独放入含有 PECM 的培养皿中，以备进行详细的显微解剖。随后对单个胚胎进一步解剖，以分离富含骨骼肌的区域。首先去除内脏器官，解剖出尾部后段及后肢，以及上、下体壁。将所有解剖得到的组织放入新鲜的 PECM 中以维持胚胎活性。在显微解剖培养中，将解剖出的四肢、后肢以及上、下体壁进一步显微解剖，制备成大小相等的微小组织块。将这些微组织块分别单独置于96孔板中央的60个孔中，每孔含有50 µL PECM。每研究一个用于培养的胚胎，应至少建立60个培养孔，每孔接种一个x植物。中间的60个孔可根据外植体来源区域进一步划分。该设计可使肢体、上体壁、后肢和下体壁分别各占15个孔。将外植体在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育三周。在三周的孵育期间，使用倒置显微镜在培养的第3天、第7天、第14天和第21天对外植体进行观察评分。根据每个单独孔中细胞的汇合程度对外植体进行评分。该示例展示了 E15.5 原代胚胎外植体培养物在不同汇合度下的情况，这些培养物经 MyoD 染色后分为以下等级：14% 及以下、15% 至 24%、25% 至 49%、50% 至 74%，以及 75% 至 100%。当外植体培养物达到汇合状态并呈现出成肌细胞（SMS 细胞）的形态学特征时，可进行传代培养，此时也可拍摄培养物的显微照片。从选定的孔中移除培养基，并使用 0.2 微米 ACR 圆盘 R 注射器滤器进行过滤。将培养基保留，作为每孔的条件培养基。每孔加入100微升以PEC培养基按1:10稀释的圆片。然后将培养板放回37°C培养箱中孵育20分钟。20分钟后，用移液器吸头轻轻刮下孔板表面松动的细胞，随后将细胞悬液在1000 × g离心3分钟，以沉淀细胞。通过重悬将细胞稀释，将其悬浮于2 mL PECM中，然后转移至新的48孔板的孔中。最后将细胞混合物转移至48孔板中进行进一步扩增。为进行分析，将原代胚胎Splunk细胞以PECM培养基和条件培养基接种于48孔板中的盖玻片上，进行传代培养。细胞接种密度为每平方厘米3 × 10³个细胞，在37°C培养箱中孵育，使细胞贴壁，通常需要4至6小时。在评估细胞凋亡和增殖前，用PBS将盖玻片上的细胞洗涤两次，随后在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。固定后，再用PBS洗涤盖玻片10分钟，然后加入10 µg/mL的DPI染色3分钟。用铝箔包裹培养板，在 PBS 中清洗盖玻片 5 到 10 分钟。随后，将盖玻片从孔中取出，倒置在玻璃载片上的一滴封片剂上。用指甲油密封盖玻片边缘，以便保存。将载玻片用铝箔包裹，并置于零下20摄氏度保存以备计数。在直立式荧光显微镜下观察载玻片，使用IP评分系统对凋亡细胞和有丝分裂细胞进行评分。当外植体从成年骨骼肌或胚胎中被小心植入后，在37摄氏度孵育数小时至72小时内将开始产生细胞。根据细胞来源的不同，细胞群体的扩增需要数天（胚胎植入物）或数周（较老的骨骼肌植入物）的时间，以生成高密度聚集的SMS细胞原代培养物。此处展示的是成功获得SMS细胞克隆系的代表性结果。单个细胞被分离至96孔板中后，可形成源自单细胞的细胞集落，最终建立稳定的克隆细胞群体。随后通过MIF5免疫组织化学染色验证SMS细胞的身份。将骨骼肌来源的成体干细胞移植到宿主小鼠的胫骨前肌中，在注射后三个月拍摄的图像中，通过β-半乳糖苷酶（beta GC）标记可识别这些细胞。在注射后14个月，观察到一个肌纤维中存在三个最近融合的β-半乳糖苷酶阳性细胞（呈蓝色染色），并通过抗β-半乳糖苷酶抗体（呈棕色染色）检测到β-半乳糖苷酶阳性细胞在肌纤维中有广泛贡献。图中箭头指示一个β-半乳糖苷酶阳性的卫星细胞。对照组中未使用一抗，因此无染色信号，该对照组样本取自注射后12个月的宿主肌肉组织。通过β-半乳糖苷酶阳性细胞增殖培养核型分析，小鼠克隆SMS细胞系显示出正常的二倍体染色体组成。在PD50A细胞克隆中，组织化学染色显示了β-半乳糖苷酶的表达。对营养不良的胚胎Myh5阳性成肌细胞的体外分析表明，这些成肌细胞具有过度增殖的特性，并易于发生凋亡。如本图所示，与野生型肌肉组织外植体相比，MDX和CAV3基因敲除突变体中胚胎成肌细胞从肌肉组织外植体培养中的迁移生长速率均增加。此处展示了一个经MIF5免疫染色的外植体示例。通过KI-67阳性免疫反应性检测发现，这些MDX和CAV3基因敲除突变体中均观察到胚胎成肌细胞的过度增殖现象。此外，通过 DPI 染色显示，这两种突变体中均出现升高的细胞凋亡，本图像显示了由箭头指示的凋亡细胞示例。我们刚刚向您展示了如何从成体和胚胎中分离骨骼肌干细胞并对外植体进行显微解剖。在进行该操作时，重要的是要注意显微解剖所得外植体的大小。如果它们过大，就会导致细胞死亡；如果过小，则无法提供有效支持。良好的菌落生长。感谢观看，祝您的实验顺利。

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