Name: 間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶマウス視覚野の慢性的イメージング法。間伐-頭蓋骨準備を用いて樹状突起棘の動態を観察し、大脳皮質可塑性のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は、医歯薬学総合研究のバロウズウェルカムのキャリア賞（AKM）、ホワイトホール財団研究助成（AKM）、スローン財団フェローシップ（AKM）、NIH EY019277（AKM）、および資金NEI、ビジョントレーニンググラント、EY013319（によってサポートされていましたEAK）。

<ol><li>二光子顕微鏡、ニューロンが蛍光マーカーで標識されている準備を使用して無傷の脳内の神経細胞を可視化するために使用されます。実験で我々は層5錐体細胞には1をラベルする GFP - Mトランスジェニックマウスのラインを使用するここで紹介。層5錐体細胞は、PIAのレベル以下に300μmの深さに樹状突起と樹状突起棘の可視化を可能に、浅層に樹状突起を投影。代替アプローチは、ウイルスマーカーを用いて細胞を（ らロウェリーを参照してください。、Joveのために提出された）ラベルを付けることです。 </li><li>無菌手術のために70％エタノールおよびオートクレーブのツールを使用してワークスペースを滅菌する。きれいなドレッシングを使用してオペレーティング表面を覆う。 </li><li> IACUC承認された手順を使用してAVERTINの四半期投与量（0.0075 mg / ml）を、続いフェンタニルカクテル（metatomadinは0.5 mg / kg体重;ミダゾラム5 mg / kgのフェンタニル0.05 mg / kg体重）をマウスに麻酔。鎮痛剤をマウスに前処理、ブプレノルフィン（0.5 mg / kg）を（SQ）皮下投与。テール/つま先ピンチに反応をテストすることによって、麻酔薬平面のレベルを監視します。 </li><li> 37.5で動物を維持° C添付の直腸温度計で加熱毛布を用いた。 </li><li>乾燥から目を防ぐために、眼に眼軟膏を適用します。手術中に、光源から目を保護するために紙の小さなシートとフードの目。 </li><li>はさみを使って、目に頭の後ろ（耳の後ろ）から髪を削除する。 </li><li> 70％エタノールのシーケンシャルアプリケーションと動物の頭の上をきれいに、betadineスクラブとbetadineの溶液を加えた。 </li><li>眼への正中線（イメージ化される半球に応じて）の右側または左側に沿って耳と、最大の後ろにL -カットの切開を行います。手術部位から皮膚を倍以上との距離。皮膚がイメージングセッションは、次縫合されるため、皮膚を削除しないでください。 </li><li>微細な鉗子を使用すると、静かに関心のある分野から持ち上げ、皮膚を引っ張る。 </li><li>優しく清潔なピンセットや顕微ブレードと頭蓋骨の露出面積から骨膜を削り取る。綿棒を使用して、完全に骨膜メンブレンを乾燥させると、それは完全に削除されていることを保証するために頭蓋骨に10％塩化第二鉄を少量。頭蓋骨は（11を参照）接着剤の適切な付着を確保するために、完全に乾燥していることが重要です。鉗子または顕微ブレードを使用して、静かに乾燥させ骨膜の膜をこすり落とす。 </li><li>ステンレス鋼のヘッドプレート（図1を参照）し、印を押さなけれ頭蓋骨にプレートのイメージングのウィンドウ周りシアノアクリレート接着剤の薄層を適用します。 </li><li>綿綿棒の棒の木の端を使用して、画像ウィンドウの内側の縫い目に接着剤を適用し、イメージングプレートと頭蓋骨の曲率の間のすべてのギャップを埋めることを確認すること。 </li><li>ウィンドウに接着剤のアクセラレータのドロップを置きます。すぐにワイプ綿棒または金と過剰な接着剤のアクセラレータを拭き取る。接着剤は完全に掘削する前に固化してください。 </li><li> 0.7ミリメートルのステンレス鋼ばりを貼付歯科用ドリルを用いた撮像ウィンドウで頭蓋骨を薄くし始める。 0.9％滅菌生理食塩水の臨時のアプリケーションで代替掘削は頭蓋骨上にあまりにも多くの熱を生成しないように。 </li><li>歯科用ドリルで頭蓋骨の表面全体に小さなストロークを使用して頭蓋骨上に薄いの4x4 mmのウィンドウ。平滑末端の鉗子で頭蓋骨の薄さをテストします。頭蓋骨の表面は穏やかな圧力をわずかにインデントされます。イメージングに最適な頭蓋骨の厚さは10〜30μmである。 </li><li>頭蓋骨が薄いと、すべての破片を掃除窓の場合は、頭蓋骨に生理食塩水を置きます。解剖スコープに取り付けられたデジタルカメラとイメージングのウィンドウを撮影。脳血管系の写真と使用は、その後のイメージングセッションのためにイメージングプレートを配置する位置を見つけるのに役立ちます。 </li><li> 2光子リグに動物を輸送しています。動物全体のイメージングセッション中に加熱毛布（直腸プローブ付き）にままにしてください。注：鎮静下にある間、動物の体温は、皮質損傷または場合によっては死に至る加熱装置のない状態で大きく変動します。 </li><li>マイタイレーザー、最大電力および変更されたオリンパスFluoview共焦点ユニット用10Wソリッドステートポンプを使用した2光子顕微鏡が使用されます。システムは、脳からの蛍光の最大の検出を可能にするために可能な限り客観的に近いとしてインストールされている深部組織のイメージングと外部検出器に最適化されています。オリンパスLUMPlan FL / IR 20X/0.95NAの対物レンズが使用されます。 0.9％生理食塩水は、客観的な浸水のための画像処理時に使用されます。 </li><li>明るく標識したニューロンを含む領域を識別するこの顕微鏡を使用して、低デジタルズーム（× 1）。 </li><li>顕微鏡の接眼部に固定されたデジタルカメラを使用して、撮像領域の写真を撮る。また、血液の血管パターンの概略を述べる。これは、再することが必要ですその後の時点で同一の撮像位置に回します。 </li><li>樹枝状分岐の程度を示す脳の全体の可視範囲（通常は〜200μmをスパニング）を介して、低倍率のスタック（5μmのステップX20の目標、512 × 512ピクセル）を取得。注：この低倍率の画像は、血管や樹状突起の両方が若く、成熟した動物で、その構造を維持するとして、その後の時点でのイメージング領域を見つけるために使用されます。 </li><li>イメージングソフトウェア（Fluoview、V. 5.0、FV300）を使用して、8倍デジタル倍率を増加させる。 X、Y座標（パン座標）を必要に応じて調整し、場所と樹状突起棘の構造を含む、詳細な樹枝状形態が表示されます高倍率のスタックを収集する。各スタックコレクション、すなわちパン座標、コレクション、Z -ステップサイズおよびスタック内のステップ数の範囲についての詳細なメモを取る。その後の時点で、この樹状突起や軸索に戻るときにこれらのノートは使用されます。 </li><li>イメージングの後、静かに頭蓋骨の表面から板を分離することにより、ヘッドプレートを取り外します。鉗子を使用して、頭蓋骨に残った残留接着剤を除去し、0.9％滅菌生理食塩水で頭蓋骨の表面を拭いてください。 ＃6の縫合糸を使用して一緒に頭蓋骨を介して皮膚を縫合。 70％エタノールでエリアを拭いてください。手術後の回復中に痛みを軽減するために、0.1 mg / kgのブプレノルフィンの鎮痛、SQを管理する。 </li><li>それが起動して、モバイルになるまで加熱ランプの下できれいなケージで動物を置きます。オリジナルのケージに動物を返します。 </li><li>後の時点でのイメージを再作成の動物（私たちの撮影時間のポイントが離れて2日から何ヶ月にどこでも構いません）に、ステッチを削除するか、上記のような無菌の方法を使って頭の上に皮膚を再び開きます。元画像の場所を見つけるために脳血管系（最初の手術の日に撮影）のデジタル画像を使用してください。 Reaffixステンレス鋼headplate（ステップ10-12）。撮影時間の点の間に再成長している可能性のある骨離れて静かに薄いために顕微ブレードを使用してください。歯科用ドリルで薄い、必要に応じて。明確なイメージング破片のウィンドウと0.9％滅菌生理食塩水の滴を適用する。 </li><li>二光子顕微鏡に動物を運ぶと、元画像のフィールドを探します。援助のための最初のイメージングセッション中に撮影されたデジタル写真を使用してください。 </li><li> Fluoviewプログラムを開き、元の低倍率の画像を開きます。貼って、コンピュータの画面に透明シートや透明性のペンを使用して主要な血管のパターンをスケッチ。 </li><li>ライブ画像を開いて、透明フィルム上にスケッチパターンへの血液の血管系を再調整してください。 </li><li>構造にズームイン8倍速のイメージを再作成するには、以前のイメージングセッションから目的収集したスタックを開く。コンピュータの画面に貼付透明フィルム上に構造を（グリア、樹状突起、軸索すなわち）、スケッチ。 </li><li>ライブイメージから8倍速でのズームとパンを設定するには、初日のイメージングパラメータに変換します。低倍率の位置を揃えるの精度に応じて、それはまた、若干画像の角度を調整する必要があります。所望の構造が発見されると、あなたのスケッチ高倍率のパターンに構造を一致させる。その後の分析のためのZスタック画像の同一のステップの大きさと数でz -スタックを収集する。 </li><li>すべての高倍率の画像が再収集されるまで、手順29と30を繰り返します。 </li><li>イメージングが完了したら、手順22から24を繰り返します。再イメージングは​​、2つの独立した時点にでまで繰り返すことができる。 </li><li>動物実験は、実験動物のケアの評価と認定のために協会が完全な認定で、医学と歯学のロチェスター大学大学の実験動物医学のビバリウムと部門が定めたガイドラインと規則に従って行われた州法、連邦法及びNIHのポリシーに準拠して国際的な（AAALAC）となります。 </li></ol>代表的な結果 GFP - M発現マウスでは、層5錐体細胞とそれに対応する樹状突起のサブセットは容易に2光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）1を用いて可視化することができます。ここでは、目的の画像の位置上の頭蓋骨が〜10から30ミクロンまで薄くされている間伐-頭蓋骨の準備を示した。正しく実行される、我々のプロトコルは、私たちは明らかに急性または慢性の分析（図2）のための完全な視覚野における皮質の樹状突起と棘を可視化することができました。 <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。カスタムヘッドとベースプレート。間伐-頭蓋骨の手術の準備のために使用されるカスタムメイドのヘッドとベース板の（）上から見た図。カスタムメイドの頭部と底板の（B）は側面図。 （C、D）ヘッドプレートの詳細な回路図と画像。 <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> in vivoで画像化樹状突起。画像は175μmの最終的な深さにPIAからすべての5μmを得られる単一のイメージの投影です。の箱入りのエリアは、（B）と（C）0日目に結像（D0）と4日後（D4）の拡大された領域を表します。安定した棘（白い矢印の頭を）実証BとCの箱入り樹状分岐の（D、E）高倍率では、/後退の棘（赤い矢印の頭）と新しい​​の棘（緑の矢印の頭を）失った。スケールバーは= Aは200μm、B、Cの20μmの、D、E.は5μm。

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

二光子顕微鏡を用いて慢性的なイメージングは、可塑性2-5時にトリガーの形態学的変化を研究するためにますます一般的な手法になりつつあります。ここでは、異なる画像間で無傷のマウス脳内の識別された樹状突起に従うことを間伐-頭蓋骨の準備を示しています。このプロトコルでは、頭蓋骨は皮質への最小限の損傷を引き起こし、脳の機能6を変える可能性の神経炎症の非常に低いレベルで、その結果、そのまま残されます。これは、動物はすぐに最初の手術後にしてから数年後に続いてイメージを再作成日イメージングすることができます。これは強力なテクニックですが、にも限界があります。頭蓋ウィンドウがクリアされている間に開頭し、そ​​れゆえ関連するグリアの活性化を伴う、より侵襲的なウィンドウの準備は、イメージングのセッションの任意の数と脳の繰り返しイメージングすることができます。薄い頭蓋骨の準備は、しかし、マウスの皮膚を開閉に関わる手術のために最大で3つの画像のセッションに制限されています。さらに、深さの浸透は、頭蓋ウィンドウ2に優れています。慢性的なイメージング実験のための外科的アプローチを決定する際には慎重に検...

<table><tbody><tr><td>クエン酸フェンタニル</td><td></td><td>院内（自施設）</td><td></td><td>フェンタニルカクテル：麻酔用カクテル；&lt;br/&gt;腹腔内投与量：0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;最終カクテル濃度：0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>塩酸メデトミジン</td><td></td><td>院内（自前）</td><td></td><td>フェンタニルカクテル：麻酔カクテル&lt;脳/&gt;腹腔内投与量：0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;2光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を用いたin vivoイメージングにより、完全な脳内における生存細胞および神経突起の研究が可能になります。本手法では、脳の同一領域を複数の時点でイメージング（慢性イメージング）することができ、顕微鏡レベルの解像度により、中枢神経系（CNS）におけるポストシナプス興奮性部位の大部分を占める微小構造である樹状突起スパインの追跡が可能です。複数の時点で皮質の微細構造を明確に分解できる能力は、特に、シナプスの形態的変化や回路の再構築が根底にあるメカニズムの解明に寄与する脳可塑性の研究において、多くの利点があります。本ビデオおよび補足資料では、薄い頭蓋骨（thinned-skull）標本を用いた完全な脳の慢性in vivoイメージングのプロトコルを紹介します。thinned-skull標本は、硬膜や皮質への潜在的な損傷を回避し、炎症反応の発現を抑制できる低侵襲なアプローチです。本プロトコルを正しく実施することで、完全な脳における樹状突起スパインの特性の変化を、長期間にわたって明確にモニタリングすることが可能になります。&gt;最終カクテル濃度：0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>ミダゾラム塩酸塩</td><td></td><td>院内での実施</td><td></td><td>フェンタニルカクテル：麻酔カクテル&lt;br/&gt;腹腔内投与量：0.0125 ml/g&lt;2光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を用いた生体イメージングにより、無傷の脳内における生存細胞および神経突起の研究が可能になります。本手法では、脳の同一領域を複数の時点にわたってイメージング（慢性的イメージング）することができ、顕微鏡レベルの解像度により、中枢神経系（CNS）におけるポストシナプス興奮性部位の大部分を占める微小構造である樹状突起スパインの追跡が可能です。皮質の微細構造を複数の時点で明確に識別できる能力には多くの利点があり、特に、シナプスにおける形態的変化や回路の再構築が基礎となるメカニズムの解明に寄与する脳可塑性の研究において有用です。本ビデオおよび補足資料では、薄頭蓋準備法を用いた無傷の脳の慢性的生体イメージングのプロトコルを紹介します。薄頭蓋準備法は低侵襲なアプローチであり、硬膜や皮質への潜在的な損傷を回避できるため、炎症反応の発生を抑えることができます。本プロトコルを正しく実施することで、無傷の脳における樹状突起スパインの特性の変化を、長期間にわたって明確にモニタリングすることが可能になります。&gt;&lt;br/&gt;最終カクテル濃度：0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-トリブロモ&amp;#8211;エタノール </td><td></td><td></td><td></td><td>アベルチンカクテル：麻酔剤；&lt;br/&gt;腹腔内投与量：0.0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;最終カクテル濃度：1%</td></tr><tr><td>2-メチル-2-ブタノール（最終濃度：0.775%）</td><td></td><td></td><td></td><td>アベルチンカクテル：麻酔剤；&lt;br/&gt;腹腔内投与量：0.0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;最終カクテル濃度：0.775%</td></tr><tr><td>マウス用TC-1000温度制御システム</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000マウス</td><td>体温調節</td></tr><tr><td>トベラデックス</td><td></td><td>院内（または施設内）</td><td></td><td>眼軟膏</td></tr><tr><td>10% 塩化第二鉄</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>薄頭蓋骨標本作成</td></tr><tr><td>マイクロサージェリー用メス刃</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>頭蓋骨薄化法</td></tr><tr><td>シアノアクリレート 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>頭蓋骨薄層化標本作成</td></tr><tr><td>シアノアクリレート 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>頭蓋骨薄層化法</td></tr><tr><td>Zip Kicker 接着促進剤</td><td></td><td>ペーサー技術</td><td>PT-29</td><td>頭蓋骨薄層化法</td></tr><tr><td>マイクロドリル用スチールバー チップ径0.7mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>薄い頭蓋骨標本作成</td></tr><tr><td>マイクロトルク制御ボックスおよびTech2000ハンドピース</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>頭蓋骨薄層化法</td></tr><tr><td>#6-0 (0.7 metric) シルク縫合糸</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>テーパーC-1</td></tr><tr><td>眼科用ピンセット、10cm、先端幅0.5mm、曲型</td><td>手術器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>超極細ボン鋏、8.5cm、ストレートチップ、刃渡り13mm</td><td>手術器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子、直線型、チップ 2.5mmx1.35mm、12cm</td><td>手術器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

二光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を用いた in vivoイメージングでは無傷の脳で生きている細胞と神経突起の研究ができます。ここで紹介するテクニックは、中枢神経系におけるシナプス後興奮部位の大部分を表す小さな構造である樹状突起の追跡を可能にする顕微鏡の分解能を持ついくつかの時点（慢性の画像）で脳の同じ領域のイメージングを可能にします。明らかにいくつかの時点では問題なく皮質の構造を解決するためには、シナプスと回路のリモデリングにおける形態学的変化は、根本的なメカニズムを説明することがする脳の可塑性の研究では特に、多くの利点があります。このビデオと補助材料では、我々は、間伐、頭蓋骨の準備を使用して無傷の脳のin vivoイメージング慢性ためのプロトコルを示す。間伐-頭蓋骨の準備は、このように炎症反応の発症を減らすこと、硬膜および/または皮質が損傷する可能性を回避する低侵襲アプローチ、である。このプロトコルが正しく実行されると、それは明らかに長期間にわたって無傷の脳内の樹状突起棘の特性の変化を監視することが可能です。

このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す<em&gt; in vivoで</em間伐-頭蓋骨の準備を使用して無傷の脳の&gt;イメージング。

2光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を用いたin vivoイメージングにより、無傷の脳内における生細胞および神経突起の研究が可能になります。

樹状突起スパインは、シナプス入力を受けるニューロンの樹状突起からの膜突出部です。スパインの伸長、縮小、あるいは出現や消失は、特定の神経活動パターンに起因する神経ネットワーク機能の変化に応じて起こります。この現象は皮質可塑性として知られており、樹状突起スパインの形態学的変化を観察することで確認できます。生体動物において、マウスの頭蓋骨にイメージングプレートを固定します。頭蓋骨の一部を外科的に薄くし、低倍率および高倍率で画像を撮影します。その後、後日のタイムポイントでこれらの領域を再度撮影します。得られた結果から、薄層頭蓋骨標本作製を用いることで、複数のタイムポイントにおいて樹状突起スパインの形態を明確に可視化できることが示されました。また、スパインの形態は非常に可塑性が高く、構造の変化だけでなく、樹状突起スパインの出現や消失も認められます。こんにちは、ロチェスター大学神経生物学・解剖学部の Anaya Maka 研究室の Emily Kelly です。本日は、finsと呼ばれる標本作成後のマウス視覚皮質の慢性的イメージングの手順について解説します。当研究室では、この手法を用いて樹状突起スパインのターンオーバーを研究しています。それでは始めていきましょう。無菌手術用の器具を滅菌することから手順を開始します。次に、70% ethanolを用いて作業領域を滅菌し、手術面に清潔なドレッシング材を敷きます。フェンタニルカクテルで麻酔をかけたマウスの足指を挟んで反応を確認し、麻酔深度をモニターします。ここで示しているマウスは、GFPが発現しているA-G-F-P-M遺伝子組換えマウスです。第5層のパラメタ細胞は、浅層へと樹状突起を伸ばしています。体温を37.5 °Cに維持するため、動物を電気毛布の上に置き、直腸温度計で監視してください。次に、眼球の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布し、ハサミを使用して処置します。マウスの後頭部、耳の後ろから目にかけての被毛を除去します。次に、動物の頭頂部に70%ethanolを塗布して洗浄し、続いてベタダイン・スクラブとベタダイン溶液で洗浄します。耳の後ろから、イメージングを行う半球に応じて正中線の右側または左側に沿って目に向かってLCU切開を行い、皮膚を翻転させて手術部位から遠ざけます。皮膚は後で微細鉗子を用いて縫合するため、除去しないでください。皮膚をゆっくりと上に引き上げ、目的の領域から遠ざけます。清潔な鉗子を使用して、露出した頭蓋骨領域から骨膜を慎重に掻き出します。10% fair chlorideを頭蓋骨に少量塗布し、骨膜を完全に乾燥させ、完全に除去されていることを確認します。頭蓋骨が完全に乾燥していることが重要です。接着剤を適切に密着させるため、マイクロサージカルブレードを用いて、乾燥した骨膜を優しく掻き出してください。次に、ステンレス製ヘッドプレートのイメージングウィンドウの周囲にSanoアクリル接着剤を薄く塗り、プレートを頭蓋骨に固定します。綿棒の木の端を使用して、イメージングウィンドウの内側の継ぎ目に接着剤を塗り、イメージングプレートと頭蓋骨の曲面の間の隙間をすべて埋めてください。その後、ウィンドウの中に接着促進剤を1滴滴下します。その後、速やかに余分な接着剤を拭き取ります。接着剤が完全に乾燥するまで待ちます。0.7 mmのステンレス製バーを取り付けた歯科用ドリルを使用し、イメージングウィンドウ部分の頭蓋骨を薄く削り始めます。頭蓋骨への過剰な熱発生を避けるため、時折0.9%滅菌生理食塩水を塗布しながら、断続的にドリリングを行います。頭蓋骨表面に小さなストロークを繰り返し、4 mm × 4 mmのウィンドウを薄く削り出します。歯科用ドリルを使用します。鈍端鉗子を用いて頭蓋骨の厚さを確認してください。軽く圧力をかけると、頭蓋骨の表面がわずかに陥没します。撮像に最適な頭蓋骨の厚さは10～30 µmの間です。頭蓋骨を薄くした後、ウィンドウ内のゴミをすべて取り除き、頭蓋骨上に生理食塩水を滴下します。実体顕微鏡に取り付けたデジタルカメラで、撮像ウィンドウを撮影します。この写真に写っている脳血管は、その後のイメージングセッションでイメージングプレートを配置する位置を特定するのに役立ちます。動物を2光子顕微鏡装置に移動させてください。動物は加熱ブランケットの上に置いたままとし、イメージングセッションの間、体温を継続的にモニタリングする必要があります。MiTaiレーザーを搭載した2光子顕微鏡。最大出力を得るために10 Wの固体ポンプが使用され、改造されたOlympus Flow View共焦点ユニットが組み込まれています。本システムは深部組織イメージングに最適化されており、脳からの蛍光検出を最大化するため、外部検出器が対物レンズの可能な限り近くに設置されています。低デジタルズームを使用して、イメージングウィンドウに生理食塩水を一滴滴下します。顕微鏡に固定したデジタルカメラを使用して、明るくラベル化されたニューロンを含む領域を特定します。次に、撮像領域の写真を撮影します。これは、後のタイムポイントで同じ撮像位置に戻るために必要です。樹状突起の分岐範囲を確認するため、脳の可視範囲全体にわたる低倍率のスタック画像を取得します。血管と樹状突起は、若年および成体動物においてその構造が維持されるため、これらを後続のタイムポイントにおけるイメージング領域の特定に利用します。イメージングソフトウェアを使用して操作してください。デジタル倍率を8倍に上げ、必要に応じてXY座標を調整し、樹状突起棘の位置や構造を含む詳細な樹状突起形態を示す高倍率スタックを収集します。パン座標、収集範囲、Zステップサイズ、スタック内のステップ数など、各スタック収集に関する詳細なメモを記録してください。これらのメモは、後日の時点でこの樹状突起または軸索に戻る際に使用します。イメージング後、ピンセットを用いてヘッドプレートを頭蓋骨表面からゆっくりと剥がして取り除きます。残った接着剤をすべて除去し、0.9%滅菌生理食塩水で頭蓋骨を拭きます。6番の縫合糸を用いて、頭蓋骨上の皮膚を縫合します。イメージング処置後、当該部位を70% ethanolで拭き取ります。動物が目覚めて自力で動けるようになるまで、ヒートランプの下にある清潔なケージに入れておきます。その後、動物を元のケージに戻し、2日後から数か月後の任意の時点で再びイメージングを行います。縫合糸を外し、頭部の皮膚を再度開きます。無菌的な手法を用い、初回の手術時に撮影した脳血管系のデジタル画像を使用して、元のイメージング位置を特定します。その後、前述と同様にヘッドプレートを再度固定します。必要に応じて、マイクロサージェリー用メスを使用して、イメージングの各タイムポイント間に再生した可能性のある骨を慎重に削り取ります。歯科用ドリルで薄く削り、イメージングウィンドウ内の破片を除去して、0.9%滅菌生理食塩水を1滴滴下します。動物を2光子顕微鏡に運び、前回のセッションで撮影したデジタル蛍光画像を用いて、元のイメージング領域を特定します。フロービュープログラムを起動します。元の低倍率画像を開き、コンピュータ画面に透明シートを貼り付け、透明ペンを用いて主要な血管パターンをスケッチします。次に、ライブ画像を開き、血液血管系を透明フィルム上のスケッチパターンに合わせて再整合させます。8倍に拡大した構造体を再撮影するために、透明フィルムを取り除きます。前回のイメージングセッションで収集した目的のスタック画像を開きます。コンピュータ画面に貼り付けた透明フィルム上に、構造体のスケッチを描きます。ライブ画像から8倍にズームし、画像を透過的に合わせます。低倍率での位置合わせの精度に応じて、画像の角度をわずかに調整する必要がある場合があります。ステップサイズや収集画像数など、1日目のイメージングパラメータにパン座標を設定し、Zスタック再イメージングを最大2回まで実施します。頭蓋骨の完全性を損なうと、GFP発現マウスにおいてイメージング解像度が低下するため、頭皮を開く回数は制限する必要があります。in vivo 二光子レーザー走査顕微鏡を用いて、第5層のパラメタ細胞の一部および対応する樹状突起を可視化しました。ここではGFPで標識された視覚野の樹状突起が示されています。この画像は、PIAから最終深度 175 µm まで 5 µm ごとに得られた単一画像の投影図です。枠で囲まれた領域を、0日目に高倍率で示し、続いて 4日目に再び高倍率で示しています。0日目と 4日目の樹状突起分枝画像の高倍率比較図です。これらの画像では、白い矢印で安定したスパインを、赤い矢印で消失・退行したスパインを、そして緑の矢印で新生スパインを示しています。以上で、薄い頭蓋骨標本を用いたマウス視覚皮質における慢性的な2光子イメージングの手法を説明しました。この手順を行う際は、頭蓋骨およびその下の硬膜を損傷するとイメージングの解像度が低下するため、薄層化の過程で細心の注意を払うこと、および詳細な記録を取ることが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

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