Name: Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco de câncer de xenotransplantes de adenocarcinoma pancreático humano usando citometria de fluxo com marcadores CD44, CD24 e atividade de aldeído desidrogenase. Este método viabiliza estudos funcionais e análises comparativas.

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Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (CA127574, CA107040 e CA09071) para WM

1. Xenoenxertos colheita de Ratos <ol><li> Prepare a célula de dissociação buffer: Dulbecco modificado Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS), a penicilina-estreptomicina, 200 U / mL de colagenase tipo IV, e 0,6 dispase U / mL. </li><li> Um atímicos (nu + / nu +) do mouse abrigar um subcutânea xenoenxerto de câncer humano de pâncreas que é menos de 1 cm de maior diâmetro é sacrificados por asfixia de dióxido de carbono e deslocamento cervical. </li><li> O tumor é colhida subcutâneo do flanco do mouse por dissecção romba usando uma pinça e tesouras e colocado imediatamente no buffer de células dissociação. </li><li> Tumores são pesados ​​e colocados de volta em 10 mL de células dissociação tampão por 1 grama de tecido do tumor. </li></ol> 2. Gerar uma suspensão de células isoladas da xenoenxertos <ol><li> Trabalhando em um estéril biossegurança gabinete, o tumor é transferido para uma placa de cultura 100 x 20 mm com 1 mL de tampão de células dissociação. Tumores são mecanicamente picada usando lâminas de barbear estéreis e fórceps. A suspensão de células tumorais é triturado através de uma pipeta de 5 mL sorológicos 10 vezes. As peças tumor deve ser pequeno o suficiente para não entupir a pipeta de 5 mL sorológicos. </li><li> A suspensão de células tumorais é transferido para um tubo cônico de 50 mL contendo o volume restante de células dissociação buffer (cheio menos de 50%) e centrifugadas a uma velocidade máxima por 1 minuto. </li><li> A suspensão de células tumorais é, então, incubados a 37 ° C por 2 horas com vórtex intermitente por 1 minuto a cada 20 minutos. </li></ol> 3. Destroem suspensão de células de restos de tecido e células mortas <ol><li> Após a incubação de 2 horas da suspensão de células é agitadas na velocidade máxima durante 1 minuto. </li><li> A suspensão de células é então passado através de um filtro de 70 mm e coletado em um tubo de 50 mL fresco cônica e ajustado para um volume final de 15 mL por tubo. </li><li> Para separar ainda mais células viáveis ​​a partir de células mortas e restos de tecido, a suspensão de células tumorais é separado por centrifugação de densidade Ficoll-Paque Plus. Um underlayment de Ficoll-Paque Plus é criado por pipetar 15 mL de Ficoll-Paque Plus lentamente abaixo da suspensão de células com cuidado para não misturar as duas camadas. </li><li> A suspensão de células e camadas de Ficoll estão é centrifugado a 500x g por 30 minutos com os freios desligado. </li><li> Células na interface de o Plus Ficoll-Paque e buffer de células dissociação são coletados e transferidos para um tubo de 50 mL fresco cônico. </li><li> Frescos DMEM suplementado com 10% SFB é adicionado à suspensão de células para o diluir 1:3 (por exemplo, 20 mL de mídia fresco adicionado a 10 mL de suspensão de células). </li><li> As células são coletadas por centrifugação a 450X g por 10 minutos, a mídia decantado, eo pellet celular é ressuspenso em 1 mL de tampão ALDEFLUOR. </li><li> Dez microlitros da suspensão de células é diluído com 10 mL de tripan azul e células viáveis ​​são contadas usando um hemocitômetro. Se um grande número de células mortas ou restos de tecido são anotados durante esta etapa, a separação das células por centrifugação de densidade podem ser repetidos (passos 3,3-3,7). </li></ol> 4. Células mancha para separação de células de fluorescência Activated <ol><li> Rótulo sete 12 x 75 mm tubos de poliestireno teste da seguinte forma: <ol><li> Imaculado </li><li> CD44-APC </li><li> CD24-PE </li><li> rato CD31-biotina + mouse linhagem-biotina + mouse H-2Kd-biotina </li><li> ALDEFLUOR </li><li> ALDEFLUOR + + deab IgG 2bκ-APC + IgG 2aκ-PE </li><li> ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + mouse CD31-biotina + mouse linhagem-biotina + mouse H-2Kd-biotina. </li></ol></li><li> Diluir a suspensão de células em 2 mL de tampão ALDEFLUOR para uma concentração final de 5-10 milhões de células / mL e manter em gelo. Adicionar 100 mL da suspensão de células de tubos # 1, 2, 3 e 4 e mantê-los no gelo. Adicionar 1 mL para tubo de deab # 6 e manter em gelo. Adicionar reagente ALDEFLUOR à suspensão de células restantes diluídas 1000 - fold (por exemplo, adicionar 1,6 mL de reagente ALDEFLUOR para 1,6 mL suspensão celular), misturar bem e colocar no gelo. Transferir 100 mL dessa mistura para tubos de # 5 e 6, ea mistura restante (1,4 mL) ao tubo n º 7. Incubar todos os tubos em banho-maria a 37 ° C por 40 minutos. Misture a suspensão celular a cada 10 minutos a fim de impedir as células de sedimentação para o fundo dos tubos. </li><li> Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1 e 5 em cada 100 mL de buffer ALDEFLUOR. Para tubos # 2, 3, 4 e 6, adicionar 100 mL de ALDEFLUOR buffer que contém os anticorpos adequados diluído da seguinte forma: 1:20 para IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, CD44-APC, e CD24-PEanticorpos; 1:100 para mouse CD31-biotina, mouse linhagem-biotina e mouse H-2Kd-biotina anticorpos. Ao tubo # 7 adicionar 1,4 mL de tampão contendo ALDEFLUOR uma diluição 1:20 do CD44-APC, e CD24-PE anticorpos e uma diluição de 1:100 do mouse CD31-biotina, mouse linhagem-biotina e mouse H-2Kd-biotina anticorpos. Incubar as suspensões de células no gelo por 10 minutos. </li><li> Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1, 2, 3, 5, e 6 em 100 mL de buffer ALDEFLUOR. Prepare 1,5 mL de tampão contendo ALDEFLUOR uma diluição de 1:100 de estreptavidina-PerCP proteína. Adicionar 100 mL para o tubo n º 4 e adicionar 1,4 mL para tubo de # 7. Incubar as suspensões de células no gelo por 10 minutos. </li><li> Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1, 2, 3, 4, 5 e 6 em 200 mL de buffer ALDEFLUOR. Ressuspender o sedimento em tubo de 7 em 2,8 mL de tampão contendo 2 ALDEFLUOR mcg / mL de iodeto de propídio. Mantenha os tubos no gelo em todos os momentos. </li><li> Passe as células através de 35 mícrons filtro com 12 x 75 mm tubos de ensaio com tampas de poliestireno filtro. </li></ol> 5. Isolar células-tronco cancerosas por separação de células de fluorescência Activated <ol><li> Um citômetro de fluxo FACSAria está preparado para separação de células. </li><li> Controles de compensação são definidas usando as células dos tubos n º 1, 2, 3, 4 e 5. </li><li> Portões são criados com base em declarações de lado e dispersão de parâmetros para coletar singlets celular. </li><li> Mouse-sem (PerCP-negativos) e viáveis ​​(não coradas propidium iodeto), as células são fechadas através do canal de FL-3. </li><li> Células ALDH + são coletados com base em portas criado usando deab células tratadas (tubo # 6) e do canal-1 FL. </li><li> CD44 + CD24 + células são coletadas com base em portas criado usando células coradas com ALDEFLUOR, IgG 2bΚ-APC, e IgG 2aκ-PE (tubo # 6) usando o FL-4 e FL-2 canais. </li><li> As células são coletadas em 12 x 75 mm tubos de ensaio contendo poliestireno 1 mL de DMEM suplementado com 10% SFB. </li><li> Depois que as células foram ordenadas, centrifugar a suspensão de células em 450X g por 10 minutos, decantar a mídia, e ressuspender as células em 500 mL DMEM fresco suplementado com 10% SFB. </li><li> Contar o número de células classificadas utilizando um hemocitômetro como descrito no passo 3.8. </li></ol> 6. Resultados representante Este protocolo vai levar ao isolamento da ALDH + e CD44 + CD24 + CSCs pancreático. A porcentagem de células derivadas do mouse é variável, mas descobrimos que xenoenxerto de câncer pancreático mais humano contêm 20-60% de células de rato derivados usando o mouse CD31, mouse cocktail linhagem, e mouse H-2Kd biotina anticorpos conjugados (Figura 1A ). Da mesma forma a freqüência de cada população CSC de xenoenxertos diferentes é variável, mas geralmente descobrimos que 1-4% da população total de células é ALDH + (Figura 1B) e 0,2-5% é CD44 + CD24 + (Figura 1C). Rotineiramente manualmente contagem de células classificados usando um hemocitômetro desde a máquina de contagem de FACSAria são muitas vezes imprecisas devido à não-celular partículas detectadas pelo FACSAria. <img src="/files/ftp_upload/2169/2169fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Enredo citometria de fluxo retratando populações específicas de um xenoenxerto de câncer pancreático. (A) Células coradas positivamente no canal de FL-3 (propidium iodeto +, mouse CD31 + + lineage mouse, ou mouse H-2Kd +) são excluídos de forma a isolar apenas viáveis ​​e não do rato células derivadas. (B) ALDH atividade em um xenoenxerto de câncer pancreático humano foi medido por citometria de fluxo usando o reagente ALDEFLUOR na presença e ausência do inibidor ALDH1 dietilamino-benzaldeído (deab). Os quadros representam portões que retratam células + ALDH que foram criadas com base em células tratadas com deab e depois aplicada a células não tratadas. As porcentagens de células + ALDH são mostrados no portão. (C) O CD44 + CD24 + portão foi criado a partir de células coradas com ALDEFLUOR, eo IgG 2bκ-APC (controle isotípico para CD44-APC) e IgG 2aκ-PE (controle isotípico para CD24-PE) anticorpos. As porcentagens de células CD44 + CD24 + são mostrados no portão.

<ol><li>Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66, 9339-9344 (2006).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ginestier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+Is+a+Marker+of+Normal+and+Malignant+Human+Mammary+Stem+Cells+and+a+Predictor+of+Poor+Clinical+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 Is a Marker of Normal and Malignant Human Mammary Stem Cells and a Predictor of Poor Clinical Outcome.</a> Cell stem cell. 1, 555-567 (2007).</li>
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<li>Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+multiple+myeloma+progenitors%2C+stem+cell+properties%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance.</a> Cancer Res. 68, 190-197 (2008).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of pancreatic cancer stem cells.</a> Cancer Res. 67, 1030-1037 (2007).</li>
<li>Hermann, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell stem cell. 1, 313-323 (2007).</li>
<li>Rasheed, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+tumorigenic+cells+with+mesenchymal+features+in+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of tumorigenic cells with mesenchymal features in pancreatic adenocarcinoma.</a> J Natl Cancer Inst. 102, 340-351 (2010).</li>
<li>Rubio-Viqueira, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+platform+for+translational+drug+development+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.</a> Clin Cancer Res. 12, 4652-4661 (2006).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve o isolamento de pâncreas CSCs de xenoenxertos humanos. Várias etapas fundamentais neste procedimento irá melhorar o rendimento de CSCs viável. A recuperação de uma população pura de pâncreas CSCs depende da pureza de células viáveis ​​presentes na suspensão celular antes de classificar na FACSAria. Tendo o cuidado de usar xenoenxertos que são menos de 1 centímetro de diâmetro maior ajuda a reduzir a quantidade de tecido necrosado no centro do tumor. Além disso, esgotando a suspensão de células de restos de tecido e células mortas durante a centrifugação Ficoll-Paque gradiente é crítico e pode ser repetido se um grande número de restos de tecido ou de células não-viáveis ​​são detectados quando as células são contadas sobre o hemocitômetro. O protocolo de coloração descrito aqui utiliza o sistema de reagentes para detectar atividade ALDEFLUOR ALDH bem como fluoróforos anticorpos para detectar antígenos de superfície específicos de células. ALDEFLUOR coloração é realizada a 37 ° C e, portanto, precisa ser concluído antes de coloração de anticorpos (no gelo) para evitar a possibilidade de nivelamento de anticorpos, o que pode acontecer a 37 ° C. Como as células podem efluxo o reagente ALDEFLUOR, é importante para manter as células em ALDEFLUOR tampão a 4 ° C após coloração ALDEFLUOR foi concluída. O buffer ALDEFLUOR contém um inibidor de efluxo de drogas que ajuda a manter os níveis intracelulares de ALDEFLUOR. Uma vez que este método isola viável pancreático CSCs eles podem ser aplicados em uma série de experimentos que medem a função fisiológica dessas células. Nós temos usado essas células de tumor de iniciação ensaios utilizando camundongos imunodeprimidos e em células in vitro de migração / invasão ensaios. Além disso, RNA, DNA e proteínas podem ser coletados a partir dessas células para estudos analíticos comparando CSC e não-CSC populações.

<table><tbody><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Soro de bezerro fetal </td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-9501</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV </td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura 100 x 20 mm </td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 70-&amp;mu;m </td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL </td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de reagentes ALDEFLUOR </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>01700</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano </td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de poliestireno 12 x 75 mm </td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC (clone G44-26) </td><td>BD Biosciences</td><td>559942</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE (clone ML5) </td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td></td></tr><tr><td>CD31-biotina de camundongo </td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td></td></tr><tr><td>Linhagem de camundongo-biotina </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-613</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kd-biotina de camundongo </td><td>BD Biosciences</td><td>553564</td><td></td></tr><tr><td>IgG&lt;sub&gt;2b&amp;#954;&lt;/sub&gt;-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555745</td><td></td></tr><tr><td>IgG&lt;sub&gt;2a&amp;#954;&lt;/sub&gt;-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555574</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Streptavidina-PerCP </td><td>BD Biosciences</td><td>554064</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de poliestireno 12 x 75 mm com tampas coadoras </td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células-tronco de xenoenxertos humano do câncer de pâncreas

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Células-tronco cancerosas (CSCs) foram identificados em um número crescente de doenças malignas e são funcionalmente definidas por sua habilidade de sofrer auto-renovação e produzir descendentes diferenciados 1. Essas propriedades permitem que CSCs recapitular o tumor original quando injetadas em ratos imunodeficientes. CSCs dentro de um tumor maligno epitelial foi primeiramente descrito no câncer de mama e está em exibição específico de células a expressão do antígeno de superfície (CD44 + CD24 / low -) 2. Desde então, CSCs foram identificados em um número crescente de outras doenças malignas humanas usando CD44 e CD24, assim como um número de antígenos de superfície. Propriedades fisiológicas, incluindo a atividade de aldeído desidrogenase (ALDH), também têm sido usados ​​para isolar CSCs de tecidos malignos 3-5. Recentemente, nós e outros identificados CSCs de adenocarcinoma do pâncreas com base na atividade ALDH ea expressão dos antígenos de superfície celular CD44 e CD24, CD133 e 6-8. Estas populações altamente tumorigénico podem ou não podem ser sobrepostas e exibir outras funções. Descobrimos que ALDH + e CD44 + CD24 + pâncreas CSCs são igualmente tumorigénico, mas as células ALDH + são relativamente mais invasivos 8. Neste protocolo, descrevemos um método para isolar viável pancreático CSCs de passagem de baixa xenoenxertos humanos 9. Xenografted tumores são colhidos a partir de camundongos e transformado em uma suspensão de uma única célula. Restos de tecido e células mortas são separados a partir de células vivas e, em seguida, coradas utilizando anticorpos contra CD44 e CD24 e usando o reagente ALDEFLUOR, um substrato fluorescente de ALDH 10. CSCs são então isolados por separação de células de fluorescência ativado. Isolado CSCs pode então ser usado para ensaios analíticos ou funcionais que requerem células viáveis.

Células-tronco cancerosas (CSCs) foram identificados em uma série de tumores malignos. Neste protocolo, descrevemos um método de citometria de fluxo utilizando atividade aldeído desidrogenase e CD44 e CD24 expressão para isolar CSCs de xenoenxertos adenocarcinoma pancreático humano. Estas células viáveis ​​podem então ser utilizados em estudos funcionais e analíticos.

Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

As células-tronco cancerígenas (CSCs) foram identificadas em um número crescente de neoplasias malignas e são definidas funcionalmente por sua capacidade de realizar a autorrenovação...

Células-tronco cancerígenas ou CSCs possuem a capacidade de autorrenovação de longo prazo e a habilidade de gerar progênie diferenciada. As CSCs foram identificadas em um número crescente de neoplasias malignas, incluindo o adenocarcinoma pancreático, no qual podem ser identificadas com base na atividade de aldeído desidrogenase e na expressão de antígenos de superfície celular, CD 44, CD 24 e CD 1 33. Aqui, tumores são isolados de camundongos portadores de câncer pancreático humano.São gerados xenografismos e suspensões de células individuais. As células são então coradas com o reagente eldor, que identifica células com alta atividade de aldeído desidrogenase e antígenos de superfície celular CD 44 e CD 24. As populações de células-tronco cancerígenas são então isoladas utilizando classificação de células ativada por fluorescência.As células isoladas podem ser utilizadas em diversos ensaios funcionais e analíticos subsequentes. A hipótese das células-tronco é uma área emergente na biologia do câncer. Essencialmente, a hipótese afirma que os tumores contêm subconjuntos distintos de células com fenótipos e funções diferentes.Subconjuntos específicos de células, denominados células iniciadoras de tumor ou células-tronco cancerígenas, podem gerar tumores em camundongos imunodeficientes ou colônias em ensaios congênicos in vitro. Mais recentemente, acredita-se que as células-tronco cancerígenas também desempenhem um papel importante no desenvolvimento de metástases, bem como na resistência terapêutica. Inicialmente, as células-tronco cancerígenas foram estudadas em leucemias mieloides utilizando amostras de sangue periférico ou de medula óssea.No entanto, com o surgimento da biologia de células-tronco e dos tumores sólidos, surgiu o desafio de gerar suspensões de células isoladas que possam ser separadas por citometria de fluxo e posteriormente analisadas em aplicações a montante. Meu pós-doutorando colega Zan demonstrará agora este procedimento. Demonstrarei visualmente várias etapas críticas durante este protocolo.Começando com a geração de uma suspensão simples de células tumorais a partir de um xenoenxerto de câncer pancreático humano. Em seguida, corarei as células para a atividade da aldeído desidrogenase e vários antígenos de superfície celular. Finalmente, separarei as células utilizando um citômetro de fluxo ativado por fluorescência.Os camundongos utilizados para este protocolo abrigam xenoenxertos subcutâneos de câncer pancreático humano. Esses camundongos foram previamente gerados da seguinte maneira. Tumores recém-coletados de pacientes submetidos à cirurgia por adenocarcinoma pancreático no Hospital Johns Hopkins foram picados em fragmentos de dois a três milímetros e implantados subcutaneamente nas laterais de camundongos atímicos de seis semanas de idade.Quando os tumores atingiram aproximadamente 1,5 centímetros cúbicos, foram ressecados e transplantados para camundongos receptores secundários para expandir o pool de tumores. Este protocolo inicia com a coleta de um tumor subcutâneo do flanco de um camundongo anêmico por dissecação romba. Após a remoção do tumor, coloque-o imediatamente em tampão de dissociação celular.Em seguida, pese o tumor e coloque-o novamente em 10 mililitros de tampão de dissociação celular por um grama de tecido tumoral, trabalhando em uma cabine de segurança biológica estéril. Transfira o tumor para uma placa de cultura de 100 por 20 milímetros contendo um mililitro de tampão de dissociação celular usando lâminas de barbear e pinças estéreis. Pique o tumor mecanicamente.Transfira a suspensão de células tumorais para um tubo cônico de 50 mililitros contendo o volume restante do tampão de dissociação celular. Em seguida, pipete a suspensão de células tumorais 10 vezes com uma pipeta serológica de cinco mililitros. Os fragmentos tumorais devem ser pequenos para que não obstruam a pipeta serológica de cinco mililitros e, então, vortexe a suspensão na velocidade máxima por um minuto.Em seguida, incubar a suspensão de células tumorais a 37 graus Celsius por duas horas, fazendo vortex por um minuto a cada 20 minutos. Após a incubação de duas horas, fazer vortex da suspensão celular em velocidade máxima por um minuto. Passar a suspensão de células por um filtro de 70 mícrons e coletá-la em um novo tubo cônico de 50 mililitros.Ajuste o volume final para 15 mililitros com DMEM contendo 10% de FBS e pen strep para separar ainda mais as células viáveis de células mortas e detritos teciduais. Pipete 15 mililitros de Ficoll-Paque Plus lentamente abaixo da suspensão celular para preparar um gradiente de Ficoll para separação por centrifugação em densidade. Tenha cuidado para não misturar as duas camadas. Centrifugue a 500 ×g por 30 minutos à temperatura ambiente com o freio desativado. Após a centrifugação, as células viáveis estarão na interface entre o Ficoll-Paque Plus e o tampão de dissociação celular.Transfira-os para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione DMEM fresco suplementado com 10% de FBS à suspensão celular para diluí-la na proporção de um para três, centrifugue as células isoladas a 450 ×g durante 10 minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão alor, fornecido no kit de coloração alor e que será utilizado nas etapas subsequentes de coloração celular. Em seguida, dilua 10 microlitros da suspensão celular com 10 mililitros de azul de trian e conte as células viáveis utilizando um hemocitômetro.Se um grande número de células mortas ou detritos teciduais for observado durante esta etapa, repita a separação celular. A separação por centrifugação em gradiente de densidade será realizada e as células serão coradas para atividade de aldeído desidrogenase. Utilizando o reagente AldeFluor, as células também serão coradas para diversos antígenos de superfície celular com anticorpos conjugados a fluoróforos específicos.Rotule sete tubos de ensaio de poliestireno de 12 por 75 milímetros e coloque-os no gelo. Dilua a suspensão celular em dois mililitros de tampão eldor até uma concentração final de cinco a 10 milhões de células por mililitro e mantenha-a no gelo. Em seguida, de acordo com as instruções no protocolo escrito fornecido, prepare as seguintes amostras para ajustar os controles de compensação no fax area.Primeiro, analise as células-controle não coradas com ST no citômetro de fluxo. Em seguida, analise as células coradas com CD44 APC. Terceiro, as células coradas com CD24 PE e quarto, as células coradas com biotina anti-CD31 murino, biotina anti-linhagem murina, biotina anti-H2KD murino e estreptavidina PerCP. Prepare também uma quinta amostra contendo apenas ALOR e uma sexta amostra para definir os gateamentos positivos para ALDH, CD44 positivo e CD24 positivo.Esta amostra conterá ELDOR DEAB, um inibidor da aldeído desidrogenase, e anticorpos isotópicos de controle. IgG dois B kappa a PC IgG dois a kappa PE camundongo CD 31 biotina camundongo linhagem, biotina camundongo, H dois KD, biotina e estreptavidina por cp. Em seguida, no tubo final, marque as células com alor CD 44 A PC CD 24 PE camundongo CD 31 biotina camundongo linhagem, biotina camundongo, H dois KD, biotina e estreptavidina por cp.Este é o espécime real a ser classificado após a conclusão de todas as colorações; mantenha os tubos sobre gelo e no escuro até que a classificação celular seja realizada. Este protocolo de classificação resultará no isolamento de CSE pancreáticas positivas para LDH A, CD44 positivas e CD24 positivas. Imediatamente antes da classificação, adicione dois miligramas por mililitro de iodeto de propídio ao tubo de seleção positivo para LDH A, CD44 positivo e CD24 positivo, para excluir células não viáveis utilizando como controles de compensação as células linfoides de camundongo não coradas com ST, CD44 APC, CD24 PE e células alor, configurando os controles de compensação em um citômetro de fluxo FIA.O citômetro gera portas com base nos parâmetros de dispersão para frente e dispersão lateral para coletar células singulares. Utilize os tubos não corados com ST e de linhagem murina para criar uma porta para exclusão de células negativas para CP e viáveis negativas para iodeto de propídio utilizando o canal FL3. A maioria dos xenografias de câncer pancreático humano contém de 20 a 60% de células derivadas de camundongo, utilizando o coquetel de linhagem murina CD31 e H2kd murino.Anticorpos conjugados com biotina utilizando células tratadas com DEAB geram portas no canal FL1 para células positivas para A LDH. A frequência da população positiva para A L DH em diferentes xenografias é variável, mas geralmente corresponde a 1 a 4% da população total de células. Em seguida, coloque as células para classificação no porto fax e utilize essas portas.Colete células positivas para LDH em tubos de ensaio de poliestireno de 12 por 75 milímetros contendo um mililitro de DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, crie gates utilizando células coradas com IgG Eldor 2B kappa a PC e IgG 2a kappa PE nos canais FL4 e FL2. Então, colete as células CD44 positivas e CD24 positivas, que geralmente representam de 0,2 a 5% da população total após cada população celular ter sido separada.Centrifugue a suspensão celular a 450 G durante 10 minutos e re-suspenda as células em 500 mililitros de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS; conte o número de células classificadas utilizando um hemocitômetro. Este procedimento resultará no isolamento de Células-Tronco Cancerígenas pancreáticas viáveis. Essas células podem ser utilizadas em diversos ensaios analíticos e funcionais que exijam células viáveis.Utilizamos-nos deles para medir o crescimento clonogênico e a invasão in vitro. Utilizamos-nos deles para medir a iniciação tumoral e a formação de metástases in vivo, e utilizamos-nos deles para realizar análises genéticas comparativas. Após dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente sete horas.Existem várias etapas essenciais para obter uma população pura de células viáveis. Primeiramente, xenografias com menos de um centímetro no maior diâmetro apresentarão a menor quantidade de tecido necrótico dentro dos tumores. Isso garantirá a menor quantidade de células não viáveis e debris tecidual contaminando sua população final de células isoladas.Em segundo lugar, ao gerar uma suspensão única de células tumorais, é importante trabalhar rapidamente e manter as células ou o tumor em meio suplementado com 10% de soro para aumentar a viabilidade celular. Em terceiro lugar, uma vez iniciada a marcação celular com o reagente alde Fluor e os anticorpos, é fundamental manter as células sobre gelo e em tampão alor para reduzir a quantidade de influxo do reagente alor para fora das células. Além disso, é importante manter as células ao abrigo da luz o máximo possível para reduzir a quantidade de fotodegradação dos fluoro fours.Por fim, é importante contar manualmente as células utilizando um hemocitômetro, já que o citômetro de fluxo frequentemente fornece contagens de células imprecisas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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