SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

自己免疫性下垂体炎は、下垂体の肥大と1つ以上の下垂体ホルモンの欠乏を特徴としています。自己抗原の原因は不明のままです。コンパニオンビデオでは、マウス下垂体免疫原を調製するためのプロトコールを実演しており、ここではヒト自己免疫性リンパ球性下垂体炎に似たマウスモデルを作成するために使用します。

下垂体免疫原は、感受性の高いマウス株に注入されます。その後、注射は14日後に7日後に繰り返され、バイオマーカー研究のために血液が採取されます。28日目に、犠牲にしたマウスから下垂体を採取し、切片化して染色し、白血球浸潤の程度を決定します。

自己免疫性下垂体炎は、セリカに発生する他の非ホルモン分泌腫瘤と区別するのが難しい疾患であり、ますます認識されている疾患です。この病気が最初に報告されたのは約50年前ですが、自己免疫性下垂体炎で患者の免疫系によって認識される自己抗原はとらえどころのないままでした。2008年には、模倣するように設計されていたヒトの病気を忠実に再現したマウスモデルの開発を発表しました。

このマウスモデルは、関与する下垂体自己抗原を発見し、下垂体炎の病因と自然史についてさらに学ぶために使用できます。このモデルは、SJL株のような感受性株にマウスの下垂体タンパク質を注入することに基づいています。これらのタンパク質は、最終的に下垂体自己反応性リンパ球の出現を誘発する局所的な炎症環境を作り出すために、強力なアジュバントと混合する必要があります。

最初に注射部位を排出するリンパ節で、次に下垂体で。このモデルでは、比較的大量の下垂体タンパク質を注入する必要があり、マウスあたり合計2ミリグラムです。これは、コセット自己抗原または自己抗原が受胎能腺内に微量に存在することを示唆しています適切に準備されたエマージュの注射は、注射部位での下垂体タンパク質のゆっくりとした連続的な放出に変換され、最終的に下垂体特異的リンパ球の生成と活性化をサポートするため、疾患の誘発にとって重要です。

コンパニオンビデオでは、下垂体免疫原を調製する方法がそのビデオで紹介されています。安楽死マウスから単離された下垂体は、低速遠心分離によって均質化および清澄化されます。タンパク質混合物は、比色、BCAアッセイによる量とポリアクリルアミドゲル電気泳動による品質が評価されます。

次いで、水性タンパク質ホモジネートを不活性結核菌を含む油性アジュバントと混合して、下垂体エマルジョンを作製する。添付ビデオで紹介されているようにエマルジョンを調製した後、1ミリリットルのシリンジからマイクロ乳化針を取り外し、25ゲージの針を取り付けます。注射するマウスごとに100マイクロリットルの下垂体エマルジョンが必要です。

エバートンでマウスに麻酔をかけた後、つま先をつまんでも反応がないことを確認してから、左背側後肢領域に50マイクロリットルのエマルジョンを皮下注射します。針の先端が完全に皮膚の下にあり、注射部位からエマルジョンがにじみ出ていないことを確認してください。次に、右鼠径部に50マイクロリットルを注入します。

繰り返しになりますが、にじみ出ていないことを確認してください。エマルジョンは白っぽく、注射後のSGL Lマウスの毛皮の白い背景の文脈では区別が難しい場合があることに注意してください。マウスをケージに戻し、回復を監視します。

注射後最初の3日間は、注射したマウスを毎日監視し、極度の苦痛が発生しないことを確認します。アジュバントは不活化結核を含んでいるため、炎症誘発性です。7日目に桿菌は、反対側の解剖学的側面で注射を繰り返します。

右背側腿脚部に50マイクロリットル、左鼠径部に50マイクロリットルを注入します。免疫応答が発生した後に実験結果が評価される前と同様にマウスを監視します。血液は、マウスがまだ生きている間に実験結果を評価するために最も一般的に使用される組織です。

最初の免疫から14日後に定期的に採血を行い、下垂体抗体やサイトカインやケモカインなどの他のマーカーの血清レベルを測定します。生きたマウスから血液を採取するには、動物を首筋でしっかりと保持し、顎骨の後ろを見つけます。この位置が明確になったら、顎下血管束を4ミリメートルのランセットで刺します。

ピアス部分から血液が出始めます。6滴の血液をマイクロ遠心チューブに集めます。ピアスの部分を濡れたペーパータオルで拭いて出血を止めます。

血液チューブを遠心分離機に入れ、2000Gで20分間回転させます。この遠心分離により血液細胞が分離され、血液細胞は最終的に血清スナットからペレットに流れ込みます。血清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

必要になるまで、血清を摂氏マイナス80度で保管してください。.免疫したマウスが本格的な自己免疫性下垂体炎を発症するまでには、約1ヶ月かかります。したがって、マウスは通常、最初の免疫化の28日後に犠牲にされます。

頭蓋骨を切った後、脳を持ち上げて後方にひっくり返すと、下垂体が露出します。病気の下垂体は腫れて見え、周囲の髄膜によりしっかりと付着しています。鋭い鉗子の先端を下垂体の周りに動かして、髄膜を緩めます。

下垂体がこの腱骨上を自由に動いたら、鉗子で腺の一方の端をつかみ、慎重にこの臆骨から持ち上げます。1ミリリットルのベット溶液(亜鉛ベースの固定剤)が入ったマイクロ遠心チューブに組織を入れ、室温で一晩腺を固定します。翌日、下垂体をレンズペーパーに移します。

下垂体をレンズペーパーで包み、組織学カセットに入れます。試料をインキュベートしてアルコールの濃度を上げ、処理後にキシレンで処理します。レンズペーパーをはがし、下垂体を金型に入れます。

次に、下垂体をパラフィンで覆います。ティッシュカセットを型の上に置き、追加のパラフィンを充填します。最後に、アセンブリを氷の上に置いてパラフィンを固めます。

パラフィンが固まったら、ミクロトームを使用して厚さ5ミクロンの切片を切断します。スライドガラスのセクションを拾います。各マウスの下垂体から、同じスライド上の少なくとも5つの連続していないセクションを収集します。

自動組織染色ステーションを使用して、スライドをヘマチンとエオシンで染色します。スライドを光学顕微鏡で調べて、結果を収集します。下垂体炎を発症した下垂体の主な特徴は、下垂体実質を単独でまたはクラスターを形成する小さな青い細胞として現れるリンパ球の浸潤です。

リンパ球は、下垂体の正常な内分泌細胞のさまざまな程度の破壊に関連しています。最も重度のリンパ球浸潤と下垂体の破壊を伴うセクションは、実験条件を知らない 2 人の研究者によって採点のために選択されます。スコアリングは、損傷の程度の主観的な推定値に基づいています。

スコアが 0 の場合は、正常な下垂体またはリンパ球、およびその他の造血単核細胞がめったに見られないことを示します。スコア 1 は、単核浸潤が下垂体前葉の総面積の 2 から 20% を占めることを示します。スコア 2 は、単核浸潤が下垂体前葉の全領域の 20 から 30% を占めていることを示します。

スコア 3 は、単核浸潤が下垂体前葉の総面積の 30 から 50% を占めていることを示します。スコア 4 は、単核浸潤が下垂体前葉領域全体の 50 から 90% を占めていることを示し、スコア 5 は、単核浸潤が下垂体前葉領域のほぼ全体を占めていることを示します。習得すると、1匹のマウスへの免疫原の注入は15分で行うことができます。

1匹のマウスからの末梢血の採取は5分で完了し、組織病理学用のスライドの準備は6時間で完了し、免疫化手順を試みながら行うことができます。麻酔と免疫原の注射後のマウスの健康に細心の注意を払うことが重要です。ピットピットに加えて、組織病理学。

この手順は、フローサイトメトリーによるドレーンリンパ節の請求書亜集団の評価など、さまざまな方法を使用して、膨大な数の実験結果を収集するために使用できます。導入疾患および自己免疫疾患のための組織抽出物による免疫技術は、自己免疫の分野の研究者が疾患の病因形成における主要なイベントを発見するための道を開きます。このビデオを見た後、実験的自己免疫性下垂体炎を誘発するためにマウスに免疫を与える方法と、そのインシデントと重症度を評価する方法についてよく理解しているはずです。

マイクロトーンブレードでの作業は危険であることを忘れないでください。それら、したがって、手袋を着用したり、良好な照明条件で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があります。