O Uso de diacetato carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos
October 12th, 2010
CFSE covalentemente rótulos de longa duração de moléculas intracelulares com o corante fluorescente, carboxifluoresceína. Como tal, quando uma célula se divide CFSE marcado, a sua progenitura têm metade da quantidade de fluorescência, que pode assim ser utilizada para avaliar a divisão celular. Este artigo descreve os procedimentos normalmente utilizados para a rotulagem linfócitos mouse com CFSE.
O objetivo geral deste experimento é marcar linfócitos com o corante fluorescente intracelular, CFSE, para que os linfócitos possam ser monitorados quanto à divisão celular por citometria de fluxo. Isso é conseguido misturando linfócitos com CFDA se, que é a forma diacetil da CFSE. Os dois grupos acetil permitem que o corante entre rapidamente nas células dos linfócitos.
As esterases removem os grupos acetil do C-F-D-A-S-E, formando a forma CFSE do corante. Sem os grupos acetil, o CFSE torna-se fluorescente e também menos permeável à membrana, concentrando assim o corante dentro das células. A cadeia lateral amino reativa AL do CFSE acopla covalentemente o corante às proteínas intracelulares, tornando as células quase permanentemente fluorescentes.
O CFSE pode ser usado para monitorar a divisão de linfócitos com base na presença sequencial da intensidade de fluorescência das células-filhas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a incorporação de timidina tritiada, é que as células individuais podem ser monitoradas quanto à divisão celular. Demonstrando o procedimento estará Ben Qua, um pesquisador do meu laboratório para rotular as células.
Comece com linfócitos recém-isolados do baço ou linfonodos de camundongos e adicione uma concentração entre metade e 10 milhões de células por mililitro de meio de cultura, suplementado com 5% de calor. O soro fetal inativado de bezerro ressuspende completamente as células e transfere cuidadosamente um mililitro para o fundo de um tubo cônico fresco de 10 mililitros. Coloque o tubo horizontalmente com cuidado.
Adicione 110 microlitros de PBS ao topo do tubo na parte não molhada do plástico, garantindo que ele não entre em contato com a solução celular. Adicione solução de corante fresco de 1,1 microlitros do estoque de cinco milimolares de CFDA aos 110 microlitros de PBS. Tampe rapidamente o tubo e inverta e vortex bem para obter uma mistura rápida e uniforme das soluções, pois o corante se torna fluorescente e, portanto, propenso ao branqueamento.
Proteja o tubo da luz cobrindo-o com papel alumínio. Incubar as células por cinco minutos à temperatura ambiente, lave as células diluindo em 10 volumes a 20 graus Celsius, PBS contendo 5% de H-I-F-C-S, sedimentando por centrifugação a 300 Gs por cinco minutos a 20 graus Celsius e descartando o sobrenadante. Repita a lavagem mais duas vezes.
As células podem então ser aplicadas a um protocolo de interesse para indução de divisão celular. As células marcadas podem ser usadas em ensaios in vitro e in vivo. Na conclusão do ensaio de proliferação, as células são colhidas e analisadas por citometria de fluxo.
Neste exemplo, a marcação CFSE é usada in vitro para medir como as células T de camundongos transgênicos geneticamente modificados respondem a células dendríticas pulsadas com diferentes concentrações de antígeno. Os picos de diluição CFSE não sombreados representam oito células T positivas para CD transgênicas que se dividiram uma a três vezes. Pode-se ver que mais células T se dividem nas concentrações mais altas do antígeno.
O método de marcação CFSE também é passível de ensaios in vivo, como experimentos de transferência adotiva. Aqui, o fax é usado para identificar a população de células T que são de interesse em camundongos receptores. Um perfil de proliferação CFSE subsequente mostra oito células T positivas para CD que se dividiram de uma a seis vezes com base nos picos de diluição da CFSE após seu desenvolvimento.
Este procedimento abriu caminho para pesquisadores e imunologia explorarem a proliferação de linfócitos durante uma resposta imune.
Visão Geral
Este artigo descreve o procedimento para marcar linfócitos de camundongo com o corante fluorescente CFSE, permitindo o monitoramento da divisão celular através de citometria de fluxo. O método permite que os pesquisadores acompanhem a proliferação de linfócitos durante respostas imunológicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Citometria de Fluxo
Fundamentos
- CFSE é um corante fluorescente usado para marcar proteínas intracelulares.
- Permite a avaliação da divisão celular medindo a diluição da fluorescência nas células-filhas.
- Esta técnica oferece vantagens sobre métodos tradicionais como a incorporação de timidina tritiada.
- A marcação com CFSE pode ser aplicada em ensaios in vitro e in vivo.
Propósito do Estudo
- Demonstrar a técnica de marcação com CFSE para monitoramento da divisão de linfócitos.
- Fornecer um protocolo detalhado para os pesquisadores seguirem.
- Destacar a aplicação do CFSE no estudo das respostas de células T a antígenos.
Métodos Utilizados
- Isolamento de linfócitos do baço ou gânglios linfáticos de camundongo.
- Mistura de linfócitos com CFDA SE para facilitar a entrada do corante.
- Incubação e lavagem das células para remover o excesso de corante.
- Análise por citometria de fluxo para avaliar a divisão celular com base na diluição de CFSE.
Principais Resultados
- A marcação com CFSE permite o rastreamento da divisão de células T em resposta a diferentes concentrações de antígeno.
- A citometria de fluxo revela picos distintos correspondentes a diferentes níveis de divisão de células T.
- O método é eficaz para aplicações in vitro e in vivo.
- Os resultados demonstram a utilidade do CFSE na pesquisa imunológica.
Conclusões
- A marcação com CFSE é um método confiável para estudar a proliferação de linfócitos.
- Esta técnica melhora a compreensão das respostas imunológicas.
- Os pesquisadores podem utilizar este método para vários desenhos experimentais.
