Name: Profiling isotópicas estáveis de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprenda a realizar análise de fluxo metabólico intermediário em Caenorhabditis elegans usando isótopos estáveis e espectrometria de massa. Este método permite monitorar alterações metabólicas em tempo real em diferentes estágios de vida.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health (K08-DK073545 e NICHD patrocinado Intelectual e Desenvolvimento Deficiência Research Center New Investigator Award), a Fundação Filadélfia, e University of Pennsylvania prêmio McCabe (MJF), bem como o Tristan Mullen Fundo (MJF e MY). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial dos institutos nacionais da saúde.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
<li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aplicação de espectrometria de massa para medir a abundância isotópica em metabólitos intermediários proporciona uma imagem detalhada de crítica maravilhosamente alterações bioquímicas 5. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para explorar esta metodologia altamente sensível e específico para avaliar fluxo metabólico intermediário no modelo animal geneticamente versáteis, C. elegans. Na verdade, a alimentação dos animais que vivem com o isótopo estável rotulados precursores metabólicos (tais como 13 C-glicose) permite uma visão romance em fluxo intermediário via metabólica quando se mede o enriquecimento isotópico em metabólitos jusante. Temos desenvolvido metodologia confiável para obter análise robusta de fluxo através da glicólise, metabolismo do piruvato, e o ciclo do ácido tricarboxílico. Isto pode ser conseguido tanto em animais alimentados com isótopo estável desde o início de estágios de desenvolvimento larval ou início no período pós-mitóticas adulto. Enriquecimento isotópico em diferentes espécies metabólito pode ser estudada em conjunto com todo perfil de ácido amino verme livre por cromatografia líquida de alta eficiência, como descrito anteriormente 4, para determinar o enriquecimento isotópico absoluta em diferentes espécies de verme livre alanina, aspartato, glutamato e glutamina. De fato, padrões consistentes de enriquecimento isotópico são obtidos quando a medição de aminoácidos e ácidos orgânicos analitos em alíquotas de 1.000 a 2.000 jovens adultos worms síncrona. Tal metodologia pode discriminar sensivelmente o fluxo intermediário anormal em gene nuclear baseado mitocondrial cepas mutantes em relação ao tipo selvagem worms. Esta técnica tem valor para investigar alterações no fluxo específico vias bioquímicas comuns de relevância para erros inatos do metabolismo. Em particular, a utilização de glicose marcada com isótopo estável informa fluxo de carbono através de vias metabólicas centrais de relevância para doença mitocondrial. De fato, nossos dados sugerem a aplicação de tal metodologia pode discriminar sensivelmente o fluxo intermediário anormal em um gene nuclear baseado complexo mitocondrial da subunidade III cepa mutante (isp-1 (qm150)) em relação ao tipo selvagem worms. É importante reconhecer que, desde a exposição isotópica é completada por um período de um a vários dias, quantificados enriquecimento isotópico representa um &quot;estado estacionário&quot; valor de enriquecimento, em vez de fluxo quantificável durante um período definido de tempo, como pode ser determinada em células baseado em modelos expostos ao isótopo por um período de minutos a horas. Outra limitação potencial de interrogar fluxo percurso ao longo do desenvolvimento do nematóide se relaciona com diferentes comprimentos de desenvolvimento larval que ocorrem em particular cepas mutantes. Por exemplo, muitos graves mutações mitocondriais são conhecidos por causar prisão na terceira fase larval (L3) 6. Assim, a análise de isótopos de incorporação apenas em animais que sobrevivem até a idade adulta pode não ser representativa de toda a população mutante. No entanto, esta metodologia pode ser adaptada para avaliar incorporação isotópica em metabólitos intermediários em um estágio específico de larva (como L2) em vez de esperar para os animais para chegar à fase adulta. Da mesma forma, os animais que entram no estágio larval alternativa conhecida como Dauer provavelmente alteraram significativamente fluxo metabólico (baixa probabilidade) em relação aos animais que proceda diretamente através das quatro fases larval. Estudo futuro também pode ser realizada para avaliar diretamente a incorporação isotópica em animais estágio Dauer de diferentes backgrounds genéticos. Exposição dos animais ao isótopo estável por um período de tempo fixo (aqui, 24 a 48 horas), começando uma vez animais atingiram a fase adulta jovem (conforme detalhado no Protocolo B) remove o impacto da variável períodos de desenvolvimento. Enquanto 13 C-glicose apenas interroga metabolismo, glicólise piruvato e fluxo de Ciclo do ácido cítrico, outros traçadores isotópicos poderiam ser avaliados para interrogar fluxo caminho bioquímico através de outras vias de interesse em nematóides. Por exemplo, 15 N-glicina pode ser utilizada para avaliar volume de negócios de aminoácidos em nematóides. Outra limitação potencial desta abordagem é o nível de sensibilidade da detecção de metabólito. Nossa experiência sugere um mínimo de 500 nematóides adultos jovens são necessários para quantificar com sucesso incorporação isotópica pelos métodos HPLC e GC / MS empregada aqui. Utilização de instrumentos com maior sensibilidade, como cromatografia ultra-desempenho líquido (UPLC), pode permitir uma maior redução do número de animais estudados, embora nós antecipamos isso é improvável para permitir a quantificação confiável de metabólitos e incorporação isotópica em espécies metabólito de worms único. Foram estudadas populações verme de 1.000 animais por experiência, que nós encontramos para detectar confiavelmente metabólitos baixa abundância em cada tensão. No entanto, alguns metabólitos, tais como GABA, só pode ser confiavelmente quantificados em populações muito maiores de nematóides, na ordem de1x10 6 animais 4. Em resumo, o perfil de isótopos estáveis ​​é um não-invasivo e seguro abordagem (não radioativos) que tem sido utilizada para estudar os erros inatos do metabolismo. Aplicação desta metodologia para C. elegans fornece a capacidade de romance para investigar in vivo, em tempo real, alterações metabólicas que ocorrem no nível animal inteiro, o que pode resultar de doenças genéticas individuais e / ou exposições agente farmacológico.

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - página 59</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centro de Genética Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocolos A e C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centro de Genética Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Ágar NGM</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>Protocolos A, B e C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;glicose C (marcada universalmente)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protocolo A e C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;glicose C (1,6 marcada)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Ácido perclórico a 60% (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-ácido aminocapróico (Padrão Interno)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protocolo E</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protocolo E</td></tr><tr><td>Resina na forma de cloreto AG 1-X8, 100-200</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protocolos A e B (extração de ácidos orgânicos)</td></tr><tr><td>Resina AG 50W-X8, 100-200, na forma hidrogênio</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protocolos A e B (extração de aminoácidos)</td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocolo A</td></tr><tr><td>0,1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Água desionizada</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Hélio</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protocolo C2</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo de Zoom SMZ-800</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protocolos A, B e C</td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Agitador orbital com incubação</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Mini Rotacionador LabRoller</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Pistilos</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Perfurar</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Bequer de vidro de 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Erlenmeyer de 1 L</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Erlenmeyer de 25 mL</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Tubos de vidro redondos de 7 ml + rolha de borracha</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protocolos A, B e C1, C2</td></tr><tr><td>Tubos de vidro redondos de 10 ml + rolha de borracha</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protocolo C2</td></tr><tr><td>Tubos com tampa azul</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos plásticos cônicos de 50 ml</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Todos os protocolos</td></tr><tr><td>tubos microcêntrifuga de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protocolos A e B</td></tr><tr><td>Seringas (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protocolos C1 e C2</td></tr><tr><td>agulhas de 25 gauge</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protocolos C1 e C2</td></tr><tr><td>Colunas de Cromatografia Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 60 mm</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Câmara de vidro (fundo cortado de frasco de 1 L) equipada com torneira de três vias com vedação de graxa</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Placa de vidro opticamente transparente</td><td>Feito sob encomenda</td><td></td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Evaporador Reacti-Vap III</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Algodão</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>Graxa de Alto Vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protocolo C1</td></tr><tr><td>Folha de Alumínio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protocolo B</td></tr><tr><td>Cronômetro</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protocolo C</td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massas por Razão de Gases</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>GC-EM</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>GC-EM</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protocolo D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protocolo D</td></tr></tbody></table>

profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e adultos caenorhabditis elegans</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Perfis isotópicos estáveis ​​há muito tempo permitido investigações sensíveis das conseqüências metabólicas de mutações genéticas e / ou terapias farmacológicas em modelos celulares e mamíferos. Aqui, descrevemos os métodos detalhados para traçar um perfil isotópico estável de metabolismo intermediário e fluxo metabólico na nematóide, Caenorhabditis elegans. Métodos são descritos para perfilar toda verme aminoácidos livres, dióxido de carbono marcado, rotulado ácidos orgânicos, aminoácidos e rotulado em animais expostos a ambos os isótopos estáveis ​​de desenvolvimento inicial em mídia nematóide crescimento agar placas ou começando como adultos jovens, porém expostos a vários tratamentos farmacológicos em cultura líquida. Aminoácidos livres são quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em alíquotas verme todo extraído em 4% de ácido perclórico. Universalmente rotulados 13 C-glicose ou 1,6 - 13 C 2-glicose é utilizada como precursor estável isotópica de carbono, cujo rótulo é rastreado por espectrometria de massa de dióxido de carbono (ambos da atmosfera e dissolvido), bem como em metabólitos indicativo de fluxo através da glicólise , metabolismo do piruvato, e o ciclo do ácido tricarboxílico. Resultados representativos são incluídos para demonstrar os efeitos do tempo de exposição de isótopos, vários protocolos de limpeza bacteriana e métodos de interrupção alternativa verme em tipo selvagem nematóides, bem como a extensão relativa de incorporação isotópica no complexo III mitocondrial mutante worms (isp-1 (qm150) ) em relação ao tipo selvagem worms. Aplicação de perfis isotópica estável em nematóides de vida proporciona uma capacidade inovadora para investigar a todo o nível animal alterações em tempo real metabólicos que são causadas por doenças genéticas individuais e / ou terapias farmacológicas.

Profiling isotópica estável por análise de massa de gás cromatografia espectrometria de fluxo metabólico intermediário é descrito no nematóide,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Métodos são detalhados para avaliar enriquecimento isotópico em dióxido de carbono, ácidos orgânicos e aminoácidos após a exposição de isótopos, quer durante o desenvolvimento em placas de agar ou durante a vida adulta na cultura líquido.

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

O perfil isotópico estável tem permitido, há muito tempo, investigações sensíveis das consequências metabólicas de mutações genéticas e/ou terapias farmacológicas em...

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar de forma não invasiva alterações metabólicas em tempo real, ao nível do organismo inteiro, nas vias da glicólise, do metabolismo do piruvato e do ciclo do ácido tricarboxílico, causadas por alterações individuais em vias metabólicas, modificações genéticas e/ou tratamentos farmacológicos. Isso é alcançado mediante a administração de isótopos estáveis a nematoides vivos, proporcionando enriquecimento isotópico suficiente em diversos metabólitos, permitindo a quantificação de alterações genéticas e/ou farmacológicas nas vias metabólicas intermediárias. Como segundo passo, a incorporação isotópica no dióxido de carbono atmosférico e dissolvido é medida por espectrometria de massas com razão de gases, o que fornece uma avaliação mais direta do fluxo metabólico intermediário em períodos curtos de tempo.Em seguida, as amostras são processadas para análise de aminoácidos livres em vermes inteiros por HPLC, bem como para enriquecimento isotópico em aminoácidos e ácidos orgânicos por GCMS, com o objetivo de quantificar alterações no fluxo metabólico em nematoides. Após a exposição ao isótopo estável, são obtidos resultados que mostram os efeitos de diferentes durações de exposição ao isótopo, eliminação bacteriana e métodos alternativos de disruptura de vermes em vermes selvagens, a fim de investigar a abundância isotópica em metabólitos intermediários. Este método pode fornecer informações sobre a regulação do metabolismo intermediário.Ele também pode ser aplicado aos nossos sistemas, como linhagens celulares de mamíferos e tecidos. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao observar anormalidades consistentes na análise de aminoácidos livres em vermes por HPLC, que sugeriam um fluxo metabólico intermediário prejudicado em alterações respiratórias primárias da função. Para iniciar este procedimento.Vermez que foram expostos a um precursor metabólico marcado com isótopo estável durante o desenvolvimento ou na idade adulta são coletados em um tubo plástico de centrífuga de 1,5 mililitro. Geralmente diluímos os vermes para uma concentração de 1000 vermes por um mililitro. Adicione ácido perclórico 60% contendo ácido épsilon-aminocapróico como padrão interno aos vermes até uma concentração final de 4% de ácido perclórico e 20 nanomolar do padrão interno.Deixe o verme sedimentar por gravidade por cinco minutos, então remova e guarde o sobrenadante em outro tubo. O próximo passo é um dos aspectos mais críticos deste procedimento. Os vermes devem ser completamente rompidos por peneiração antes da análise de metabólitos livres. Usando um homogeneizador plástico e um torno motorizado, triture as amostras de vermes por 15 segundos.Confirme visualmente a ruptura dos vermes por microscopia de luz e repita a moagem, se necessário. Nesta imagem, os painéis A e B mostram vermes antes da moagem. Em contraste com os painéis C e D, que mostram vermes após a moagem, transfira o sobrenadante previamente salvo para os tubos plásticos de centrífuga de 1,5 mililitro com o homogenato de vermes e centrifugue.As amostras a 2.250 RPM, 1300 ×g, durante cinco minutos. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um tubo de vidro novo de sete mililitros. Guarde o pellet para uso posterior em um ensaio de concentração proteica.Agora, adicione quatro hidróxido de potássio normal ao SUPERNAT até que a faixa de pH das amostras seja de sete a oito. Centrifugue as amostras neutralizadas nos tubos de vidro de sete mililitros a 2.250 RPM (1.300 ×g) durante cinco minutos. Para remover os sais, transfira o sobrenadante de cada amostra para um novo tubo de vidro de sete mililitros. As amostras neutralizadas podem agora ser preparadas para a quantificação de metabólitos por cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC e cromatografia gasosa com espectrometria de massas ou GCMS para HPLC.Se pare 50 microlitros de cada amostra neutralizada para injeção direta na CLAE. A quantificação de aminoácidos livres é realizada utilizando pré-derivatização com aldeído e detecção fluorescente. Conforme descrito anteriormente, as amostras neutralizadas restantes passarão por extração utilizando uma resina de troca iônica para GCMS, a fim de determinar o enriquecimento isotópico em aminoácidos e ácidos orgânicos, conforme mostrado na próxima seção.Para preparar as esferas, adicione ácido clorídrico normal às esferas G1 e G50 separadamente. Em béqueres de um litro, agite cada frasco durante 30 minutos com um agitador magnético. Depois disso, lave as esferas com água desionizada 10 vezes até que o pH das lavagens seja igual ao pH da água.Em seguida, apresentaremos nosso método para preparar colunas personalizadas de baixo custo utilizando pipetas de vidro. Colunas pré-fabricadas também estão disponíveis comercialmente. Para preparar uma coluna, use uma pinça para inserir um tampão de algodão logo acima da parte mais estreita da ponta de uma pipeta de Pasteur, utilize perlas G uma para extração de ácidos orgânicos e perlas G 50.Para a extração de aminoácidos, preencha cada coluna até aproximadamente um terço da altura da coluna. Se uma amostra já estiver em pH neutro, nada é adicionado à amostra antes de aplicá-la na coluna AG 1. Para extrair ácidos orgânicos e extrair aminoácidos, adicione um mililitro de ácido clorídrico 0,1 normal à amostra antes de aplicá-la na coluna AG 50.Agora aplique as amostras previamente preparadas e neutralizadas em cada coluna. Lave cada coluna 10 vezes com água até que os lavados fiquem neutros. Após a conclusão da lavagem, elua cada coluna para frascos de amostra de vidro novos e identificados de quatro mililitros. Para a extração de ácidos orgânicos, adicione três mililitros de ácido clorídrico três normal à coluna AG uma.Isso permite a análise do enriquecimento isotópico no número total de carbonos marcados entre espécies de três carbonos, espécies de quatro carbonos, espécies de cinco carbonos e espécies de seis carbonos. Para extração de aminoácidos, adicione três mililitros de hidróxido de amônio quatro normal a uma coluna G 50. Isso permite a análise do enriquecimento isotópico no número total de carbonos marcados entre espécies de três carbonos e espécies de cinco carbonos.Após a conclusão das extrações de ácido orgânico e aminoácido, coloque os frascos de amostra em um evaporador reativo app three durante a noite até que estejam secos. As amostras são então derivatizadas e analisadas por GCMS conforme detalhado no texto do Protocolo. Inicie este procedimento transferindo mil vermes adultos jovens para uma placa NGM de 35 milímetros contendo glicose universalmente marcada com carbono 13 e E. coli.Em seguida, coloque a placa NGM experimental sem a tampa. Dentro de uma câmara de vidro personalizada equipada com uma válvula de três vias bem vedada, que permite a amostragem e substituição precisas da atmosfera. Cubra o vedante onde o disco de vidro opticamente transparente assenta sobre a placa com graxa de alto vácuo.Selar a câmara com o disco de vidro. Registrar o tempo. No tempo zero e 30 minutos depois, usar uma seringa de 20 mililitros para coletar 10 mililitros da atmosfera da câmara de vidro pela torneira de três vias.Feche a torneira de fechamento da câmara. Após a coleta da amostra, transfira a amostra para um tubo de vidro a vácuo vermelho contendo um mililitro de bicarbonato de sódio em hidróxido de sódio 0,1 molar. Em seguida, injete 10 mililitros de ar na câmara de vidro através da torneira de três vias. Usando uma seringa de 20 mililitros, feche a torneira de fechamento da câmara após reinjetar a atmosfera e, antes de retomar a incubação, repita a coleta da atmosfera da câmara de vidro aos 60, 90 e 120 minutos.Analise essas amostras de dióxido de carbono atmosférico quanto ao enriquecimento de carbono marcado utilizando um espectrômetro de massa de razão gasosa conforme descrito no texto do Protocolo. Os isótopos estáveis são bem incorporados após duas horas em vermes adultos jovens, como evidenciado aqui pelo carbono marcado medido no dióxido de carbono atmosférico e no dióxido de carbono dissolvido nos vermes alimentados com OP50 E. coli vivo ou morto por irradiação UV. A razão entre dióxido de carbono de carbono-13 e dióxido de carbono de carbono-12 foi maior na fração de dióxido de carbono dissolvido nos vermes em relação ao dióxido de carbono atmosférico liberado. Observou-se que a exposição prolongada a um isótopo estável desde o período larval, seguida pela limpeza dos vermes em meio NGM sem bactérias, aumentou o enriquecimento isotópico do glutamato livre em vermes adultos jovens.Neste gráfico, L1 representa vermes alimentados com glicose marcada universalmente com carbono 13 e bactérias OP50 desde o estágio larval L1 até o estágio de adulto jovem com 959 células; YA representa vermes alimentados com glicose com carbono 13 e bactérias OP50 por 48 horas, iniciando quando atingiram o primeiro dia de postura de ovos no estágio de adulto jovem. O eixo X indica o número total de átomos de carbono marcados em cada espécie de glutamato, e o eixo Y indica o percentual de enriquecimento. Todos os animais foram descontaminados do excesso de marcação isotópica antes da preparação da amostra para análises subsequentes.Para as análises por GCMS, as barras verdes indicam vermes descontaminados após exposição isotópica mediante alimentação com E. coli OP50 em placas de NGM por duas horas antes da extração com PCA. As barras azuis e cinzas indicam vermes descontaminados após exposição isotópica em placas de NGM sem bactérias por duas ou seis horas, respectivamente, antes da extração com PCA, independentemente do tempo de exposição isotópica. Nenhuma diferença significativa no enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários foi observada quando os animais foram descontaminados em placas por duas ou seis horas.Em ambos os cursos de exposição isotópica, observou-se menor enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários quando os animais foram submetidos à depuração mediante alimentação com bactérias não marcadas por duas horas. Portanto, o protocolo de depuração ideal para vermes cultivados em placas NGM com bactérias espalhadas e isótopo foi determinado como sendo a depuração por duas horas em placas NGM sem bactérias espalhadas, a fim de otimizar a porcentagem de enriquecimento em metabólitos intermediários. Após tratamento por 24 horas em cultura líquida com uma glicose 13C de seis carbonos na ausência de bactérias.Foi realizada uma comparação de amostras de vermes rompidas apenas por sonicação ou por sonicação mais moagem, conforme mostrado nesta figura. Verms rompidos por sonicação mais moagem apresentaram maior enriquecimento isotópico do que amostras rompidas apenas por sonicação, alimentando-se finalmente com um precursor isotópico estável durante o desenvolvimento a partir do estágio L1 em placas ou a partir do primeiro dia de postura de ovos, como adultos jovens, por 24 horas em cultura líquida. Permite análise sensível do enriquecimento isotópico entre metabólitos indicativos do fluxo através da glicólise e do metabolismo do piruvato na via do ciclo do ácido tricarboxílico após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisas sobre doenças mitocondriais e a exploração do fluxo metabólico intermediário em *C. elegans*. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o perfilamento isotópico estável do metabolismo intermediário e do fluxo metabólico nos nematoides *C. elegans*.

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A facilidade de manutenção e propagação do...

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Nós apresentamos robustos métodos bioquímicos e microscópicos para...

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Para estudar a relação entre homeostase proteica, estresse e envelhecimento, monitoramos as mudanças no dobramento proteico acompanhando a disfunção proteica, a localização da proteína na célula e a estabilidade proteica nos níveis organismo, celular e proteico, usando o metazoário geneticamente tratável Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um ensaio para quantificar a taxa de alimentação de Caenorhabditis elegans com base na medição da depuração de bactérias em cultura líquida.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Aprenda a realizar análise de fluxo metabólico intermediário em Caenorhabditis elegans usando isótopos estáveis e espectrometria de massa. Este método permite monitorar alterações metabólicas em tempo real em diferentes estágios de vida.

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans /em (Vídeo) | JoVE Journal

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans

Explorar mais vídeos

Profiling isotópicas estáveis de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans