القولون الصاعد ستينت الصفاق (CASP) -- نموذج موحد لالإنتان البطن متعدد المكروبات

Traeger, T., Koerner, P., Kessler, W., Cziupka, K., Diedrich, S., Busemann, A., et al. Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis. J. Vis. Exp. (46), e2299, doi:10.3791/2299 (2010).

الإنتان لا يزال يمثل مشكلة مستمرة على وحدات العناية المركزة في جميع أنحاء العالم. فهم آليات معقدة من التعفن هو شرط مسبق لإقامة مناهج علاجية جديدة في هذا المجال. لذا ، يتعين على النماذج الحيوانية التي تكون قادرة على محاكاة عن كثب الأمراض التي تصيب البشر ، وأيضا التعامل مع المسائل العلمية بما فيه الكفاية. القولون الصاعد ستينت الصفاق (CASP) هو نموذج موحد للغاية لالإنتان البطن متعدد المكروبات في القوارض. في هذا النموذج ، يتم إدراج جراحيا الدعامة الصغيرة في القولون الصاعد من الفئران او الجرذان التي تؤدي إلى التسرب المستمر من البكتيريا المعوية في التجويف البريتوني. نتائج الإجراء في تجرثم ، التهاب الصفاق النظامية ، وعدوى الجهاز بواسطة بكتيريا الأمعاء ، والإفراج النظامية المحلية ولكن أيضا للعديد من السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات. يمكن السيطرة عليها بواسطة فتك CASP القطر من دعامات. والبديل من هذا النموذج ، CASP مع ما يسمى التدخل (كاسبي) ، ويثير فرصة لإزالة التركيز من قبل التفسخ العملية الثانية وفقا لإجراءات مشتركة في الممارسة السريرية. CASP هو نموذج قابلة للتعلم بسهولة وقابلة للتكرار للغاية الذي يحاكي عن كثب السريرية بالطبع الإنتان في البطن. انه يؤدي وسيلة لدراسة المسائل العلمية في عدة مجالات مثل علم المناعة ، infectiology ، أو الجراحة.

1. التحضير للماوس

1. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من السائل المخدرات (انظر الجدول الكواشف) ووضعه في موقف ضعيف.
2. أقدام الماوس الحاجة إلى أن تكون ثابتة مع الشريط على لوحة لتأمين وضع مستقر للحيوان خلال العملية.

2. عملية

1. يتخذ قنية الرابع ، والذي يستخدم عادة لحقن الرابع في البشر ، ونحت في أنبوب بلاستيكي دائري 2mm ومن طرفها. نستخدم ثلاثة أحجام مختلفة من cannulas للسيطرة على معدلات وفيات دينار بحريني (Venflon 18GA (1،2 x45mm ، 80 مل / دقيقة) ؛ 16GA (1،7 x45mm ، 180 مل / دقيقة) 14GA (2،0 x45mm ، 270 مل / دقيقة)).
2. بعد تطهير شامل للجلد البطن ، وعلى طول شق خط الوسط إزاء 15mm. فتح كهف البريتوني عن طريق عمل قطع في عضلات البطن والصفاق وعلى طول الخط الأبيض.
3. تحديد القطب الأعور والانسحاب بعناية الأعور ، محطة الدقاق والقولون الصاعد من البطن عن طريق استخدام قطعة قطن.
4. 15mm القاصية من صمام اللفائفية ، على المرء أن يخترق جدار القولون الصاعد مع خياطة 7 / 0. وبالتالي ، وجروح في الأمعاء والأوعية التي ينبغي تجنبها. تم إصلاح الدرز على الحائط من قبل اثنين من عقدة القولون الجراحية.
5. الآن ثقب القولون الصاعد مع استعداد 1-2 ملم قنية القريبة من الدرز 7 / 0. إدراج بعناية قنية في القولون حتى ثلم في أنبوب من البلاستيك على المستوى مع المصلية.
6. وضع النهايات الحرة للخياطة 7 / 0 في جميع أنحاء قنية ومكان عقدة شقين بالضبط في ثلم استعداد للأنبوب من البلاستيك.
7. الآن ، أخذ إبرة للخياطة 7 / 0 وغرزة من خلال الجدار مقابل المساريق من القولون. على التوالي ، وهما عقدة الجراحية يجب أن يتم بالإضافة إلى إصلاح الأنبوب البلاستيكي في جدار القولون. قطع نهايات خياطة.
8. استرداد جزء من الحديد قنية قليلا وقطع أنبوب بلاستيكي بالقرب قبالة (1MM) إلى تثبيت 7 / خياطة 0.
9. الآن يتعين على المرء أن الحليب بعناية البراز من الأعور نحو الدعامة القولون عن طريق استخدام قطعة قطن حتى تلميح صغيرة من البراز يظهر في أعلى الدعامات.
10. وضع الأمعاء مرة أخرى في كهف البريتوني وperforme الانعاش السوائل من الادارة داخل الصفاق من 0.5 مل من محلول ملحي.
11. إغلاق البريتوني المستمر مع خياطة (4 / 0).
12. إغلاق الجلد مع الغرز المفرد (4 / 0).

3. بعد العملية الجراحية العناية

1. وضع الحيوانات في القفص الخلفي ، والتي يجب أن يحتوي على ما يكفي من الغذاء والماء. لتسكين ، ينبغي تعاطيه في التجويف الجنبي من مادة مسكن قوي (نستخدم البوبرينورفين) تجري بانتظام.
2. خلال اليومين الأولين بعد العملية ، على المرء أن السيطرة على الحيوانات كل 6 ساعات.

4. خدعة CASP

1. تنفيذ الخطوات من 1،1-2،4.
2. لا ثقب القولون. تنفيذ خطوات فقط 2،6-2،8.
3. تنفيذ الخطوات 2،10-3،2.

5. كاسبي

1. أداء CASP باستخدام الخطوات التالية قنية 14G 1،1-3،1
2. 5H بعد CASP ، على المرء أن يعمل هذا الحيوان مرة أخرى. إعداد وتخدير الماوس مرة أخرى وفقا لخطوات 1،1-1،2
3. فتح الغرز من جدار البطن.
4. سحب القولون الصاعد مع دعامات.
5. قطع بعناية الغرز إصلاح وإزالة الدعامات الدعامات.
6. إغلاق عيب في القولون مع الغرز قلب واحد (7 / 0).
7. وضع الأمعاء مرة أخرى إلى تجويف البطن وطرد الاخير مرتين مع 10 مل من محلول ملحي.
8. إغلاق البريتوني المستمر مع خياطة (4 / 0).
9. إغلاق الجلد مع الغرز المفرد (4 / 0).
10. اتبع الخطوات 3،1-3،2

6. ممثل النتائج

في غضون بضع ساعات بعد العملية ، والحيوانات تظهر علامات سريرية للتسمم البداية. انخفض يتم تخفيض أعراض نموذجية من هذا المرض التنقل ، ومعطف horrent ، والتعرق ، والاستهلاك الغذائي ، وفقدان الوزن وخفض أيضا سلوك الفرار. وضع الحيوانات التهاب الصفاق الحاد بعدوى جهازية متتالية يموتون عادة خلال 48h. اعتمادا على حجم دعامات ، يمكن توليد معدلات وفيات متميزة. والنتائج 14G الدعامات في وفيات 100 ٪ ، ومعدل وفيات 16G يعطي 70 ٪ ، ويمكن الوصول إليه معدلات وفيات الأطفال من 50 ٪ باستخدام الدعامات 18G (الشكل 1A). نتائج عملية الشام في معدل البقاء على قيد الحياة بنسبة 100 ٪. عادة ، يموت المنتصف جميع الحيوانات أول 48 ساعة بعد CASP. وبالتالي ، يمكن اعتبار جميع الحيوانات التي هي على قيد الحياة عند هذه النقطة وقت الناجين. ومع ذلك ، فإننا نوصي فترة مراقبة إضافية من 72 ساعة على الأقل لكشف نادرة "وفاة الراحل" بعد CASP.

نتائج كاسبي يعتمد على فترة من الزمن بعد CASP عند إزالة الدعامات. تدخل 3H بعد النتائج CASP في معدل البقاء على قيد الحياة من 45 ٪. إذا تمت إزالة الدعامات بعد CASP 5H ، 10 ٪ فقط منالحيوانات البقاء على قيد الحياة العملية. وبعد إزالة الدعامات النتائج 9H في معدل الوفيات من 100 ٪ (الشكل 1B). خدعة كاسبي يؤدي إلى بقاء 100 ٪. لإعدادات كاسبي ، نوصي فترة الملاحظة لمدة 10 أيام لأن هناك عادة الحيوانات التي تموت في موعد أقصاه 48 ساعة بعد CASP.

العيانية التفتيش لساعات في البطن بعد 24 موقع المال CASP يظهر علامات نموذجية من التهاب الصفاق : وذمة ، توسع وعائي ، erythematic جدار الأمعاء ، وترسيم حاد من بقع باير ، وشلل الأمعاء والسوائل الحرة ، وإفراز التفسخ (الشكل 2).

يمكن أن تظهر العدوى عن طريق التحليل المنهجي الجرثومية. بعد 12 ساعة CASP ، ويمكن الكشف عن البكتيريا المبالغ الضخمة في غسيل البريتوني ، والدم والكبد والرئة والطحال والكليتين. التحليل النوعي يكشف عن عدوى البكتيريا الجهازية بواسطة بكتيريا الأمعاء نموذجية مثل E. القولونية ، عصوانية الأنواع ، والأنواع معوي ، وما إلى ذلك (الشكل 3).

CASP التي يسببها تسمم يظهر في الافراج المحلية والنظامية أيضا السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات وchemokines. ويمكن قياس 12 ساعة التالية المبالغ ، CASP كبير من TNF ، IL - 1β ، IL - 6 ، IL - 10 ، 1 - MCP وغيرهم ELISA في الدم ولكن أيضا في supernatants من تعليق الجهاز ، مثل الكبد والرئة والطحال والكلى (الشكل رقم 4).

وينبغي عند وضع CASP في المختبر الخاص ، ومعدلات البقاء على قيد الحياة ، وإطلاق سراح البكتريولوجيا خلوى تؤخذ كمعلمات الرقابة على الأداء الصحيح للCASP. في وقت لاحق ، ويمكن أن تؤخذ هذه المعايير وفقا لمعايير تلا نظام لكافة إعدادات التجريبية.

الشكل 1A : البقاء على قيد الحياة بعد CASP. معدلات البقاء على قيد الحياة بعد جراحة CASP تعتمد على القطر من دعامات. 14G النتائج CASP في معدل الوفيات بنسبة 100 ٪ ، والنتائج CASP 16G في وفيات 70 ٪ ، وCASP 18G يؤدي إلى نفوق 50 ٪. ويرتبط صورية CASP مع بقاء 100 ٪. . 20/group ن = (ب) : معدلات البقاء على قيد الحياة بعد جراحة كاسبي تعتمد على الوقت لإزالة الدعامات. إزالة الدعامات بعد CASP في 3H 14G يؤدي إلى معدل وفيات الأطفال من 55 ٪. إزالة الدعامات في 5H بعد النتائج CASP 14G في معدل وفيات الأطفال من 90 ٪ في حين إزالة الدعامات في 9H بعد النتائج CASP 14G في معدل الوفيات بنسبة 100 ٪. خدعة كاسبي (5H) النتائج في البقاء على قيد الحياة بنسبة 100 ٪. ن = 10/group (شام كاسبي ؛ كاسبي 9H) ، ن = 20/group (3H كاسبي ؛ 5H كاسبي).

الشكل 2 : موقع المال في البطن بعد CASP 24H. تمت إزالة جدار البطن بعد CASP 16G 24H CASP أو صورية ، على التوالي. الموقع الذي حدثت من الفأرة تبدو صورية تعمل الفسيولوجية. في المقابل ، نتائج CASP في ذمة ، تبيغ ، dilatated الأمعاء ، وترسيم البقع باير لإظهار شديد الصفاق.

الشكل 3 : علم ​​الجراثيم. CASP يؤدي إلى إصابة شديدة من عدة حجرات وأجهزتها من بكتيريا الأمعاء داخل 12H بعد العملية. يتم إعطاء أرقام البكتيرية وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) لكل مليلتر ، على التوالي. ثقافات جرثومية مأخوذة من الفئران عقيمة وصورية تعمل تماما (لا يظهر). CASP 16G ، ن = 5/group.

الشكل 4 : السيتوكينات. CASP مشغلات استجابة مناعية جهازية كما السيتوكينات عدة وchemokines يتم كشفها في البلازما وكذلك في supernatants الجهاز. هذا الرقم يدل على exemplarily السيتوكينات الموالية للالتهابات عامل نخر الورم (TNF) وانترلوكين 6 (IL - 6) وكذلك في الغالب مضادة للالتهابات IL - 10. 12H بعد CASP ، يمكن اكتشاف مستويات رائعة في البلازما والكبد والرئة والطحال. ومع ذلك ، لا يمكن IL - 10 يتم الكشف في الرئة والطحال بعد CASP. صورية العملية لا تؤدي إلى أي إفراز خلوى (لا يظهر). CASP 16G ، ن = 5/group.

CASP هو نموذج متعدد المكروبات الإنتان البطن الذي يلبي معظم المعايير المفترضة لنموذج الإنتان القيمة : لا يمكن أن يؤديها في CASP الحيوانات الصغيرة ، يتم استنساخه للغاية ، وبسهولة من قبل المعلمات لرصد القياسية ، يقدم قراءة جيدة من الاحتمالات ، ويحاكي عن كثب السريرية للإعدادات الإنتان في البطن. في دراسة المقارنة يمكن أن نظهر أن يؤدي إلى نزع فتيل CASP بعدوى التهاب الصفاق المبكر وزيادة مطردة الجهازية والتهاب (متلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية) ، في حين ربط الأعور وثقب (CLP) تكشف عن طراز تشكيل الخراج داخل البطن مع استمرار والثانوية علامات الالتهاب النظامية (1). تقنية كاسبي يقدم إمكانية لمحاكاة دورة سريرية لالتهاب الصفاق مع التركيز على التوالي الجراحية الصرف الصحي ، والذي هو أهم مبدأ العلاجية في البشر. ويمكن تطبيق CASP لجميع الأسئلة حول تسمم أو التهاب الصفاق وبالتالي فهو مفيد لجميع التخصصات التي تتعامل مع الأبحاث الإنتان ، على سبيل المثال علم المناعة ، وعلم الصيدلة والجراحة والعناية المركزة الطب ، وما إلى ذلك مجموعة مختارة من المنشورات المتعلقة مواضيع مختلفة الإنتان باستخدام نموذج CASP ويرد أدناه (14/01).

عندما تبدأ CASP ، ينبغي للمرء أن يكون على علم بأن بعض الممارسات أمر ضروري لتنفيذ العملية بدقة وبسرعة. قد يكون من المفيد تجربة جراحية ولكن ليس المطلوب. نوصي كشف letality كمعلمة للأداء الصحيح للCASP. ينبغي للمرء أن يبدأ CASP 14G باعتبارها دعامة كبيرة وسهولة في التعامل معها من أرق واحد. طبيب جراح CASP تدريب قادرة على تشغيل واحد الفأر خلال 10 دقائق. قبل البدء في أي التجارب ، يجب عليك التأكد من أنك على مقربة من تلك الفترة. عندما اكتسبت بعض الخبرة في العملية الجراحية ، يجب إجراء للتأكد من بقاء الحركية المهارات الخاصة بك. ينبغي 14G CASP النتيجة في الفتك 100 ٪. مبتدئين في المختبر لدينا أن يثبتوا أنهم قادرون على توليد 100 ٪ مع الفتك CASP 14G قبل أن تبدأ التجارب. يجب أن يتم تنفيذ بالإضافة إلى ذلك ، علم الجراثيم والقياسات خلوى للتحقق من التسمم. إذا كان لديك مشاكل في البداية مع الخطوات من CASP المجهرية ، فإن استخدام النظارات المكبرة أو المجهر الجراحية قد تكون مفيدة. ولكن من حيث المبدأ ، يمكن CASP أداء جيدا من دون هذه المرافق. لاستنساخ معدلات البقاء على قيد الحياة لدينا ، من الضروري للغاية أن تستخدم نفس المواد ، وخصوصا الدعامات دينار بحريني (Venflon ، أنظر أدناه). خلاف ذلك ، اختلافات كبيرة في النتائج المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، نقترح أن هناك اختلافات يمكن للنتائج حسب ، على سبيل المثال ، والفردانية من الجراح. ومع ذلك ، ينبغي للتأثير عوامل مثل أن تكون صغيرة.

باختصار ، CASP هو عمليا ، الإنتان نموذج بسيط ، استنساخه والقيم الذي يحاكي عن كثب الحالة السريرية للتسمم في البطن. ومن ثم فهي مناسبة لجميع مجالات الأبحاث الإنتان.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المؤلفان بالشكر نيكو Zantl ، فيفر كلاوس ، وهولتسمان برنهارد. وأيد هذه الدراسة من قبل جمعية الألمانية للبحوث ، بون باد GODESBERG ، وألمانيا (GRK - 840 ؛ 450/10-1 فو).

1. Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K. & Heidecke, C.D. Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis. Shock 21, 505-511 (2004).
2. Bougaki, M., Searles, R.J., Kida, K., De Yu, J., Buys, E.S. & Ichinose, F. NOS3 protects against systemic inflammation and myocardial dysfunction in murine polymicrobial sepsis. Shock (2009).
3. Buras, J.A., Holzmann, B. & Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov 4, 854-865 (2005).
4. Busse, M., Traeger, T., Potschke, C., Billing, A., Dummer, A., Friebe, E., Kiank, C., Grunwald, U., Jack, R.S., Schutt, C., Heidecke, C.D., Maier, S. & Broker, B.M. Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination. Gut 57, 188-195 (2008).
5. Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C.J., Ulevitch, R. & Elson, G. TLR4/MD-2 monoclonal antibody therapy affords protection in experimental models of septic shock. J Immunol 179, 6107-6114 (2007).
6. Entleutner, M., Traeger, T., Westerholt, A., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Maier, S. & Heidecke, C.D. Impact of interleukin-12, oxidative burst, and iNOS on the survival of murine fecal peritonitis. Int J Colorectal Dis 21, 64-70 (2006).
7. Kerschen, E.J., Fernandez, J.A., Cooley, B.C., Yang, X.V., Sood, R., Mosnier, L.O., Castellino, F.J., Mackman, N., Griffin, J.H. & Weiler, H. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein C. J Exp Med 204, 2439-2448 (2007).
8. Kiank, C., Koerner, P., Kessler, W., Traeger, T., Maier, S., Heidecke, C.D. & Schuett, C. Seasonal variations in inflammatory responses to sepsis and stress in mice. Crit Care Med 35, 2352-2358 (2007).
9. Lustig, M.K., Bac, V.H., Pavlovic, D., Maier, S., Grundling, M., Grisk, O., Wendt, M., Heidecke, C.D. & Lehmann, C. Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes. Shock 28, 59-64 (2007).
10. Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C.D. & Maier, S. Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun 76, 5285-5293 (2008).
11. Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., van Rooijen, N., Heidecke, C.D. & Maier, S. Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release. Respiration 77, 203-213 (2009).
12. Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C.D., Maier, S. & Vollmar, B. Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis. Eur J Gastroenterol Hepatol Epub ahead of print (2010).
13. Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C. & Holzmann, B. Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis. J Immunol 177, 5623-5630 (2006).
14. Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J.R., Holzmann, B., Heidecke, C.D. & Pfeffer, K. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun 66, 2300-2309 (1998).

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.