Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é obter registros eletrofisiológicos simultâneos de um potencial de ação do neurônio motor e a resposta sináptica associada no músculo-alvo. Isso é feito removendo primeiro a pele da parte superior do peixe. A segunda etapa do procedimento é expor a medula espinhal removendo todas as células musculares dorsais sobrepostas.

A terceira etapa do procedimento é expor o músculo rápido alvo, removendo a camada superior do músculo lento. A etapa final do procedimento é prender a corrente do neurônio primário ou cap e prender a voltagem do músculo esquelético alvo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as respostas sinápticas no músculo que estão associadas ao disparo dos potenciais de ação do neurônio motor por meio do grampo de corrente simultâneo do neurônio motor e do grampo de voltagem do músculo alvo.

O LaVar Super Fish ofereceu uma combinação de vantagens, facilita o músculo esquelético do neurônio motor emparelhado, registrando o pequeno tamanho das licenças musculares, o grampo de voltagem efetivo e as características estereotipadas do neurônio motor da tampa permitem fácil identificação e acesso ao vi. Agora, vou percorrer os procedimentos necessários para estabelecer o patch clamp de ambos os músculos neurais antes de iniciar o procedimento. Prepare cinco soluções principais, que incluem solução de banho, solução de banho com solução de banho Trica com solução interna de neurônio IDE e solução interna muscular.

Em seguida, colete uma única larva de peixe-zebra entre as idades de 72 a 96 horas e coloque em solução de banho com trica. Dentro de um minuto após a exposição ao anestésico, o peixe não responderá. Para tocar, coloque o peixe em cima de um prato de plástico e, usando um microscópio estéreo, decapite com uma lâmina de barbear de dois gumes.

Transfira o peixe para uma câmara de gravação de vidro revestida com sardinha e cheia de solução de robalo. Crie uma aba de pele perto da extremidade rostral do peixe com um alfinete que fornecerá uma aderência adequada para um par de pinças finas. Remova a pele sobrejacente segurando-a perto do pino rostral com uma pinça fina.

Descasque lentamente na direção do mimo para remover a pele. Trate o peixe com três mililitros de solução de banho com forma IDE por três a cinco minutos para bloquear as contrações musculares que podem interferir nas gravações. Lave cinco vezes com solução de banho normal.

Remova parte da camada superficial do músculo em cinco a seis segmentos, raspando suavemente com a lateral de um pino de tungstênio. Transfira o peixe para um microscópio vertical localizado em uma gaiola de Faraday para proteger o ruído elétrico. O microscópio está equipado com uma longa distância de trabalho de platina fixa, objetiva de 40 x e zoom de 0,5 a quatro x.

O microscópio é montado em um estágio de tradução XY motorizado. Para mover a preparação entre nervo e músculo sob alta potência, o uso de óptica de contraste de interferência diferencial ajuda a visualizar os neurônios sob zoom de 0,5x. Use uma pipeta de 15 mícrons de diâmetro largo para remover o músculo sobrejacente e expor a medula espinhal.

A pressão negativa é aplicada através de uma seringa descartável de três cc e as células musculares são removidas uma a uma. Este procedimento é repetido para cinco a seis segmentos dorsais do músculo esquelético. A mesma pipeta larga de javali é usada para remover também as duas camadas superiores do músculo ventral para obter o músculo esquelético rápido alvo.

Isso completa a preparação para gravações emparelhadas e o zoom do microscópio é aumentado para aproximadamente 1,6 x. Os segmentos limpos são escaneados para localizar os neurônios cap. Cada segmento HEMI da medula espinhal contém um grande neurônio motor de tampa de 10 mícrons de diâmetro.

Este soma em forma de lágrima está localizado superficialmente sob a raira espinhal, perto do mimo mais extremo do limite segmentar. Um neurônio cap é escolhido para registro e o segmento de mimo associado, o campo muscular alvo ventral é escaneado para verificar a integridade. Dois eletrodos de patch são posicionados para registro, um para o neurônio e um segundo para o músculo.

O eletrodo superior tem um cone raso para penetração da dura-máter espinhal resistente e uma abertura de ponta de aproximadamente dois mícrons. O eletrodo inferior tem um cone mais acentuado para gravação de grampo de tensão de baixa resistência do músculo esquelético. Posicione o eletrodo do neurônio em um ângulo de aproximadamente 30 graus para penetrar na dura-máter espinhal.

Cerca de meio segmento rostral ao neurônio da tampa selecionado avança o eletrodo usando um manipulador de acionamento axial enquanto aplica uma pressão positiva suave e contínua de aproximadamente 60 milímetros de mercúrio. À medida que o eletrodo rompe a dura-máter, o neurônio cap pode ser deslocado pela perfusão do eletrodo, exigindo um reajuste do foco. Quando o eletrodo toca o neurônio cap, a pressão positiva do SOMA é liberada e geralmente resulta na formação imediata de um giga selo.

No entanto, em alguns casos em que uma vedação não se forma, torna-se necessário aplicar uma leve pressão negativa. Após a formação da vedação, o potencial do eletrodo é ajustado para menos 80 milivolts e a aplicação de pressão negativa rompe a membrana celular. O neurônio cap é caracterizado por uma resistência de entrada de 140 a 180 mega ohms e um potencial de ação que ultrapassa mais 40 milivolts.

Isso é testado injetando etapas de despolarização aumentando incrementalmente sob a pinça de corrente até que o potencial de ação seja provocado. Em seguida, o microscópio é realocado para o músculo ventral usando o tradutor motorizado XY. Sob alta potência, uma célula muscular rápida é escolhida do campo alvo.

O eletrodo muscular é avançado em direção à célula muscular alvo sob pressão positiva, que quando liberada forma um giga selo, o potencial do eletrodo é ajustado para menos 50 milivolts para inativar os canais de sódio. E sob sucção suave, a membrana celular é rompida. Uma queda na resistência de 100 a 200 mega ohms e o aparecimento repentino da entrada de grandes sinais transitórios capacitivos para testar o par.

O registro do neurônio motor é despolarizado por injeções incrementalmente maiores de corrente até que um potencial de ação seja provocado. Neste ponto, uma corrente de placa terminal deve ser eliciada na estimulação contínua do músculo do neurônio motor a um hertz, resultando em correntes de placa terminal sem falha. À medida que a frequência do estímulo é aumentada para 100 hertz, as correntes da placa terminal flutuam em amplitude e sofrem depleção funcional dentro de 10 segundos após a estimulação.

Normalmente, o registro de neurônios é estável por até uma hora, mas as células musculares se deterioram conforme refletido como um aumento na resistência em série. Quando isso ocorre, o experimento é encerrado ou outra célula muscular é fixada. Todas as gravações devem ser concluídas dentro de uma hora.

Uma vez masterizado um par, a gravação pode ser concluída dentro de uma a meia hora. Também é possível obter um ou dois pares adicionais nos segmentos vizinhos. Um dia típico de gravação produzirá de dois a três pares.

As gravações do músculo esquelético do neurônio motor emparelhado oferecem uma oportunidade única de explorar o funcionamento fundamental da transmissão neuromuscular. Quando usado em conjunto com linhas de peixes mutantes de motilidade, pode identificar a fonte da disfunção neuromuscular e fornecer novos insights sobre os mecanismos subjacentes às doenças humanas, como a síndrome metastática.