Name: 遺伝子デリバリーの患者の組織及び審査のex vivoでの文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T18:00:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: 学ぶ患者組織スライスを用いた遺伝子導入法とIVISバイオルミネセンスイメージングによる遺伝子発現解析。がん遺伝子治療の臨床応用に向けた厳密なプレクリニカルモデルの構築手法です。

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この作品は、コーク南診療所ビクトリア大学病院乳ファンド、アイルランド癌協会（CRI07TAN）とコークがん研究センターで賄われていた。 CMVプロモーターの転写制御下で複製無能な組換えアデノウイルス5粒子が教授アンドリューベイカー、グラスゴー大学から親切な贈り物だった。

メディアと試薬の調製<ol><li> 抗生物質溶液 リン酸塩は、200 U / mlペニシリン、200μg/ mlのストレプトマイシン、5μg/ mlのfungizoneで緩衝食塩水（PBS） </li><li> コレクションと治療培地 200 U / mlペニシリンとダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、200μg/ mlのストレプトマイシン、5μg/ mlのfungizone </li><li> 培地 10％熱不活性化ウシ胎児血清を含むコレクションの培地</li></ol> I.組織の収集と保管患者組織採取のための承認は、コルクの教育病院の臨床研究倫理委員会から入手したものとインフォームドコンセントは、患者の手術前日から入手した。肝臓の組織は、悪性疾患に対する部分肝切除を受けた患者から得た。 <ol><li>新鮮な患者組織は、外科的切除の時点で得られる。 </li><li>組織は、4℃（組織が生存率の有意な損失なしで最大12時間冷蔵保存されることがあります、しかし、即時処理が推奨されています）で、コレクションのメディアに格納されています。 </li></ol> II。組織切片の調製と文化スライスは、ビブラトーム（ライカ、ドイツ）を用いて行った。組織スライスシステムは、製造業者の指示に従って使用されていました。組織のスライス標本を70％2 - プロパノールで洗浄器具を使用して無菌フードの下で行われた。スライス厚が2000ミクロンに設定し、22〜26 rpmで往復刃を使用してカットされます。 <ol><li>組織は、抗生物質溶液で3回洗浄する。 </li><li>組織は、非毒性接着剤（Dermabond）を使用して、取り付けの段階に添付されます。 </li><li>スライス厚が設定され、スライスは、22〜26 rpmで達成されます。 </li><li>スライスは37 6ウェル培養皿（ウェルあたりつのスライス）の培養培地中で加湿環境で、5％CO 2とCに保持されます。 </li></ol> III。組織切片への遺伝子デリバリー<ol><li>スライスは2時間℃で治療前に37℃でプレインキュベートされています。 </li><li>培養液は、治療の培地に置き換えられます。 </li><li>スライスは、直接ウイルスベクター（ウイルス粒子Ad5.CMVluc [1 × 10 9]25μlの）で注入されています。また、粒子は、受動的注入のために、培地に添加してもよい。 </li><li>インキュベーションの2時間後、血清を培地に添加される。 </li></ol> IV。生物発光分析による遺伝子発現の解析<ol><li>スライスは、ルシフェリン基質を100μl（3 mg / ml）を注射する。 </li><li> 6ウェル培養皿は、ステージ上に配置し、10分間インキュベートする。 </li><li>スライスは、高感度（図1）で5分間撮像される。 </li></ol> V.代表の結果<img src="/files/ftp_upload/2378/2378fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。IVISの検出システムを用いて患者の肝臓のスライスの生物発光イメージング。

<ol><li>van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+liver+slices+as+a+new+model+to+study+toxicity-induced+hepatic+stellate+cell+activation+in+a+physiologic+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu.</a> Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).</li>
<li>Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+primary+culture+of+epithelial+cells+derived+from+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours.</a> Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).</li>
<li>Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+model+system+for+evaluation+of+conditionally+replicative+adenoviruses+therapeutic+efficacy+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity.</a> Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).</li>
<li>Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+in+vivo+optical+imaging+of+the+lacZ+and+luc+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice.</a> Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、 生体外での患者の組織培養法と非固定のヒト組織内遺伝子送達の評価のための生物発光検出システムを説明します。方法は、培養組織スライスのシンプルかつ再現可能な方法を提供しています。それは、悪性組織を含めてヒト組織の様々に無傷のヒト組織への遺伝子デリバリーの研究、遺伝子送達の解析を可能にし、敬意を持つ個々の患者の間で変動度の高い効果に関する重要な情報を提供できるとして、それはかなりの可能性を秘めています遺伝子の取り込みに。さまざまながんの種類は、DNAの取り込みとその後の転写及び翻訳を含む、細胞の成功導入遺伝子の発現の異なる段階の有効性に影響を変化している可能性があります。これらの手順は、例として、ウイルスベクターを使用して、ビデオアニメーションで説明されています。生物発光検出システムは、組織の犠牲を必要とせず、個々のスライス内の遺伝子発現の迅速かつ正確な定量化を示しています。このような本研究で採用さのような複製無能なベクトル、の場合、発光は細胞による遺伝子発現に直接関係しています。 このモデルシステムは、前臨床試験に入る患者の組織への遺伝子デリバリーに関する貴...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ホタルルシフェリン</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dermabond</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビブロトーム</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 A</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子デリバリーの患者の組織及び審査のex vivoでの文化

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

このビデオでは、遺伝子デリバリーの研究のためのex vivoでのモデルのような患者組織の使用について説明します。手術時に得られた新鮮な患者の組織を培養にスライスされ、維持されます。 ex vivoのモデルシステムは、そのまま患者の組織や遺伝子発現に遺伝子の物理的な配信を可能にIVIS検出システムを用いて生物発光イメージングにより解析される。生物発光検出システムは、組織の犠牲を必要とせず、個々のスライス内の遺伝子発現の迅速かつ正確な定量化を示しています。このスライスの組織培養系は、正常および悪性組織を含む組織のさまざまなタイプが使用され、私たちは無傷の組織の均質性と個々の患者間の変化度の高い効果を研究することができますすることができます。このモデルシステムは、動物モデルに代わるものとして、臨床試験に入る前に補完的な臨床モードなど、特定の状況で使用することができる。

この記事では、遺伝子デリバリー研究やIVISの生物発光イメージング法を用いて遺伝子発現のその後の分析のための患者の組織切片の文化を説明します。

本ビデオでは、遺伝子導入の研究におけるex vivoモデルとして、患者組織を利用する方法について説明します。手術時に採取した新鮮な患者組織を...

皆さん、こんにちは。サイモン・レゲンロンです。私はアイルランドのコアがん研究センターの外科レジストラの一人です。本日ご紹介する手法は、遺伝子導入の研究に患者の生体組織を用いるものです。遺伝子治療は、がん治療において期待される治療アプローチを提供します。しかしながら、近年の臨床試験では、動物モデルで得られた結果を再現することができずにいます。動物とヒトの間で組織生理学に差異が生じる主な理由は、腫瘍の不均一性と腫瘍表現型の違いにあると考えています。私が今回実演するex vivo患者組織モデルは、現在利用可能な中で最も厳格な前臨床モデルです。このモデルでは、患者の組織を薄い切片にスライスし、これらの切片をin vitroで維持します。このモデルを用いて多くの遺伝子導入法をテストすることが可能です。私が使用しているウイルスベクターとDNA構築物は、CMVプロモーターの転写制御下でホタルルシフェラーゼを発現させるため、生物発光イメージングによって遺伝子発現量を定量化できます。それでは、開始しましょう。このモデルに必要な材料は、新鮮なヒト組織、Vibratom組織切片作成システム、および評価対象となる物理的遺伝子導入法です。超音波診断装置、6ウェル組織培養プレート、27ゲージの穿刺針、非毒性接着剤、ウイルス性または非ウイルス性の遺伝子導入ベクター、血清を含む培地および培養液を用意します。組織ブロックは、DermaBondなどの接着剤を用いてスライスステージに固定します。スライスを容易にするため、組織はスライス中にPBSに浸漬させます。組織は氷上に置き、30分間冷蔵保存します。本ケースで必要とされるスライス厚である2 mmを設定し、スライスを切り出します。20 RPMで回転させ、37 °Cで2時間インキュベーションした後、スライスを6ウェルプレートで培養します。ウイルスベクターをスライスに直接注入します。その後、スライスを37 °Cのインキュベーターで24時間インキュベートします。翌日、スライスを用いて遺伝子発現の解析を行いますが、ここではルミネッセンスイメージングを用います。

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Medicine

医学

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療薬として期待されています。治療前に患者から得られた生体組織標本の感染力を把握する能力は、この治療的アプローチのユニークな利点です。このプロトコルは、のための組織を処理する方法について説明します。...

腫瘍溶解性ウイルスと生きている組織のex vivoでの感染

ニワトリ胚網膜細胞培養物は、感光体の生物学の研究のための貴重なツールを構成しています。私たちは文化の前に網膜のプラスミドエレクトロポOVOの元に基づいて、効率的な遺伝子導入技術を開発しました。この技術はかなりこのシステムの実現可能な遺伝子操作を行う、現在利用可能なプロトコルを介してトランスフェクション効率を向上させます。...

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：元オボエレクトロポレーションアプローチ

私たちは、胚マウスの内耳からの蝸牛外植片の分離と培養を説明する方法を提示します。 また、方形波エレクトロポレーションによる蝸牛外植片への遺伝子導入法も示しています。in...

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

このプロトコルは、遺伝子組み換え、注射可能なスフェロイドを使用した細胞移植システムについて説明しています。細胞スフェロイドをマイクロパターン化した培養プレート上で培養し、遺伝子導入後にポリプレックスナノミセルを用いて回収します。このシステムは、移植された細胞からの宿主動物への長期にわたる導入遺伝子発現を促進しながら、細胞の本来の機能を維持します。...

遺伝的に改変された細胞移植のためのマイクロパターン培養プレート上スフェロイド細胞に対する遺伝子導入

デュピュイトラン病（DD）は、手のひらの線維増殖性疾患である。ここでは、三次元（3D）培養系においてDDから培養切除標本のプロトコルを提示する。このような短期培養系は、3次元構造の保存および線維性組織の分子特性を可能にする。...

人間デュピュイトラン<em&gt;エクスビボ</em筋線維芽細胞と細胞外マトリックス相互作用の研究のために&gt;文化

脱細胞化したラット肝臓の再細胞化細胞外マトリックスは、ウイルスまたはウイルスベクターの分布と導入遺伝子発現を研究するためのヒト化された3次元ex...

ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

このプロトコルは、自家細胞移植を介して代謝性疾患モデルを治すため豚肝細胞分離とex...

豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチ ウイルス媒介性遺伝子治療

ここでは、遺伝子操作されたマウスモデル由来腫瘍において、インビボで胚致死性である遺伝子ノックアウトを行い、そのノックアウトが腫瘍の成長、増殖、生存、遊走、浸潤、およびトランスクリプトームに及ぼす影響をインビトロおよびインビボで評価するためのプロトコルを提示する。...

悪性末梢神経鞘腫瘍細胞におけるフロックス対立遺伝子の Ex vivo アブレーションによる腫瘍形成における遺伝子機能の定義

このプロトコルは、マウスの心臓の発達における心臓細胞のエレクトロポレーションベースのトランスジェネシスのための詳細な方法論的フレームワークを示しています。ここで提供されるビデオアセットは、この汎用性の高い手法の学習を容易にします。...

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

本プロトコルは、遺伝子治療のために間葉系幹細胞(MSC)由来の細胞外小胞バイオミメティクスを製造・精製する方法を導入することを目的としています。ナノ小胞はMSC由来の脂質二重層に閉じ込められ、目的遺伝子を保持する組換えAAVを腔内に封じ込めています。このナノベシクルは生 体内...

遺伝子送達の強化を目的とした間葉幹細胞膜包覆ナノ小胞の開発

学ぶ患者組織スライスを用いた遺伝子導入法とIVISバイオルミネセンスイメージングによる遺伝子発現解析。がん遺伝子治療の臨床応用に向けた厳密なプレクリニカルモデルの構築手法です。

遺伝子デリバリーの患者の組織及び審査のex vivoでの文化

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