JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You have trial access to videos in this collection until May 31, 2014.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    כאן אנו מתארים שיטה יעילה cryopreservation הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. פרוטוקול זה פשוט מספק גמישות לדור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

    Date Published: 11/11/2010, Issue 45; doi: 10.3791/2384

    Cite this Article

    Rahman, A. S., Parvinjah, S., Hanna, M. A., Helguera, P. R., Busciglio, J. Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures. J. Vis. Exp. (45), e2384, doi:10.3791/2384 (2010).

    Abstract

    במחקר זה, אנו המתאר פרוטוקול סטנדרטי עבור cryopreservation המוצלחת הפשרת בלוקים רקמת קליפת המוח לייצר תרביות נוירונים מועשר. עבור פרוטוקול זה המדיום הקפאת בשימוש הוא sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) מדולל פתרון שנאגרו של האנק מלח (HBSS). בלוקים של רקמת קליפת המוח מועברים cryovials המכיל את המדיום מקפיא קפוא לאט ב -1 ° C / min במיכל שיעור שבשליטת מקפיא. לאחר ההפשרה עיבוד ניתוק של גושי רקמה קפוא המיוצר באופן עקבי העצבית מועשר תרבויות אשר הציגו צמיחה מהירה מדלקת עצבים במהלך 5 הימים הראשונים בתרבות הרחבה משמעותית של רשת נוירונים בתוך 10 ימים. מכתים Immunocytochemical עם חלבון סמן astrocytic גליה חומצי fibrillary (GFAP) ואת עצבי בטא טובולין סמן המעמד השלישי, גילה מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתרבויות. הדור של תאים עצביים תרבויות מבשר לאחר רקמות לחסום דיסוציאציה הביא המתרחב במהירות neurospheres, אשר הפיק מספר רב של נוירונים האסטרוציטים בתנאים מבדל. זה פרוטוקול cryopreservation פשוט מאפשר לשימור, מהיר ויעיל, ולא יקר של גושי רקמה קורטיקלית במוח, המעניק גמישות משופרת עבור דור מאוחר יותר של תרביות תאים עצביים, astrocyte, ואת עצבי מבשר.

    Protocol

    1. Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים

    חומר הכנה

    1. הכן שנאגרו 1X של האנק תמיסת מלח (HBSS) על ידי דילול לפתרון מניות 10X במים סטריליים (01:09). חנות HBSS ב 4oC.
    2. הכן 10% בינוני DMSO הקפאת ידי דילול DMSO ב HBSS (01:09). המדיום הקפאת צריכה להיעשות טרי לפני cryopreservation ומאוחסן על 4oC עד צונן.
    3. סכין גילוח פלדה משמשת קיצוץ שיטתי של הרקמה. לפני השימוש, סכין הגילוח הוא מעוקר ידי והשקיעה אתנול 70% עבור שעות 2. מיד לפני עיבוד רקמות, יש לשטוף את הסכין עם מים סטריליים 3 פעמים. הימנע עוזבים את הסכין במים סטריליים בסכום מופרז של זמן, כפי שהוא נוטה חמצון.
    4. מיכל הקפאה Nalgene טעון cryovials (2.5 מ"ל) ולאחר מכן הביא לתוך ארון ביולוגי סטרילי. 1 מ"ל של מדיום הקפאת צונן מתווסף בקבוקון אחד. מיכל הקפאה ממוקם אז לפחות 2 שעות בשעה 4oC.

    ניקוי, קיצוץ, ועל הקפאת

    1. רקמת המוח להיות קפוא הוא ניקה של קרום קרום המוח וכלי הדם. השתמש טיפים מחט סטרילית כדי להסיר בזהירות פסולת הרקמה תוך כדי עבודה על גבי שקית קוביות קרח. רקמה נוקה יש לשטוף קלות HBSS קר הועבר בצלחת פטרי חדש קיצוץ.
    2. עבודה על גבי שקית קוביות קרח, השתמש סכין גילוח לעקר במהירות כדי לקצוץ את הרקמה לתוך כ 1 3 בלוקים מ"מ. עבודה עם מנות קטנות של רקמה לנקות את תוצאות זמן שליטה טובה יותר על הליך החיתוך, וכתוצאה מכך גדלים גוש אחיד יותר.
    3. לאט לאט להוסיף רקמה קצוץ לתוך 50 מ"ל של HBSS בצינור חרוטי 50 מ"ל. בעדינות ולשטוף את צלחת פטרי עם HBSS כדי לאסוף כל גושי רקמה הנותרים. אפשר גושי רקמה לרדת לחלק התחתון של הצינור, יצירת רקמה ארוזים בצורה רופפת לחסום גלולה.
    4. בעוד הרקמה שיקוע, להביא את מיכל הקפאה מקורר בעבר cryovials לתוך ארון הבטיחות הביולוגית. פותח את הפקק כל cryovials כדי לזרז את התהליך של הוספת רקמה.
    5. אחרי הכל את גושי רקמה התיישבו, לשאוב בעדינות HBSS עודף, משאיר שכבה דקה מאוד של המדיה מעל גלולה. צנטריפוגה אינה מומלצת, מכיוון שהדבר יגרום גושי רקמה לדבוק זה בזה, הולכת ופוחתת באופן משמעותי את יעילות מקפיא.
    6. לאט לאט לאסוף 200 μL מהחלק התחתון של הרקמה רפויה לחסום גלולה באמצעות קצה פיפטה עם פתחים רחבים (לחתוך קצה במספריים סטריליות). העברת את החומר cryovial אחד לעבור הרקמה, הבא שוב איסוף מהחלק התחתון של גלולה. זה חיוני כי ההליך כולו הקצאת רקמה לא לוקח יותר מ 3-4 דקות לכל מיכל ההקפאה. הדבר מבטיח כי רקמות חשוף DMSO לתקופה רק זמן קצר לפני ההקפאה. לאחר העברת רקמה על צלוחיות, במקום מיכל הקפאה במקפיא-80oC במשך לפחות 4 שעות. לחלופין, מיכל הקפאת ניתן להשאיר ולינה -80 מעלות. חזור על תהליך זה עבור כל מיכלי הקפאה הנותרים.
    7. מעבירים את cryovials ממיכל ההקפאה (ים) cryobox ובמקום במיכל חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

    2. הפשרה ו culturing של בלוקים קפואים רקמות קליפתיים

    חומר הכנה

    1. יום אחד לפני ההפשרה דגימות רקמה, poly-L-ליזין צלחות פטרי מצופה / coverslips מוכנים. באופן כללי, עבור נוירונים בקליפת המוח אנו מכינים מאכלים מצופה 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​או 1 מ"ג / מ"ל. הוסף מספיק poly-L-ליזין פתרון (שנעשו חיץ borate) באופן מלא לכסות את החלק התחתון של המנה. אם coverslips זכוכית נדרשים, להבטיח כי הם שקועים לחלוטין מתחת פתרון poly-L-ליזין. דגירה של לפחות 12 שעות. לפני השימוש, לשטוף ביסודיות את הכלים עם כמות ליברלית של מים סטריליים 3 פעמים, 5 דקות כל אחד.
    2. HBSS חם משמש לניקוי הרקמות מופשר, וכן לנתק את הרקמה השעיות לתוך התא. נפח HBSS צורך ישתנה בהתאם לכמות רקמות להיות מופשר, אבל בדרך כלל 1 cryovial מדללים ב 50 מ"ל של HBSS ויהיה ניתק ב 10 מ"ל של HBSS.
    3. שינוי של Dulbecco בינוני הנשר עם 10% ברזל בתוספת שור עגל בסרום (EBS) ו -1% אנטיביוטי / antimycotic (AA) תערובת (DMEM (++)) צריך להיות ממוקם בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים.
    4. בינוני ציפוי (NB (+++)) צריכה להיעשות טרי לפני השימוש. בינוני זה הוכן על ידי הוספת 1% אנטיביוטי / antimycotic בתוספת B27 ותוספי N2.

    הערה: שמות מדיה שצורפה צלבים (+) מצביעים על הכללת תוספי הרכב הבסיס של התקשורת. בטקסט הזה, DMEM (+ +) מציין DMEM EBS פלוס 10% פלוס 1% AA, בעוד NB (+++) מציין NB plלנו 1% AA פלוס B27 פלוס N2.

    הפשרה ו culturing

    1. הסר את cryovials מהטנק חנקן נוזלי במהירות להפשיר על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד רק קרח גלולה קטנה הוא ציין את הבקבוקון בתוך התוכן.
    2. בעדינות להעביר את תוכן הבקבוקון 50 מ"ל של HBSS חם צינור חרוטי. השתמש קצה פתח רחב בעדינות כדי לסלק כל גושי רקמה שנותר תקוע cryovial. הפוך את הצינור 3-4 פעמים ולאפשר הרקמה לאט לאסוף בתחתית. רקמות צריכה להתיישב מהר, אבל אם בלוקים קטנים מדי זה לא יכול להתרחש ואור צנטריפוגה (~ 200 x ז) ​​מומלץ.
    3. לשאוב HBSS עודף.
    4. הוסף 10 מ"ל של HBSS חם רקמת גלולה ו 300 μL של טריפסין 0.25% ו 50 μL של DNAase. דגירה של אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 5 דקות, ולאחר מכן מקום שייקר מסלולית מוגדר 80 סל"ד ו - 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות.
    5. לאחר תקופה זו, להביא את גושי רקמה לתוך ארון בטיחות ביולוגית להשתמש פיפטה 10 מ"ל בזהירות להתסיס את גושי רקמה עד ההשעיה תא מעונן נוצר. לבטל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM חם (+ +) כדי השעיית התא.
    6. צנטריפוגה התאים ניתק ב 1200 x g עבור 5 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant, resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של DMEM חם (+ +) ולכמת מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
    7. פלייט תאים פולי-L-ליזין מנות מצופה. בדרך כלל, מנה 60 מ"מ יהיה מצופה 1x10 6 תאים.
    8. אפשר התאים לצרף צלחת / coverslips במשך שעה בערך 1 ב בתרבית רקמה חממה. מומלץ לעקוב אחר התקדמות מצורף צלחת אחת כל 10 דקות עד מצורף יעיל הוא ציין. ואז, בעדינות להחליף את מדיום עם טרי DMEM (++).
    9. לאחר 24 שעות, להחליף את DMEM (+ +) עם חם NB (+++). שינויים בינוני חלקית (50%) מתבצעות כל 5 ימים עם טרי NB (+++). תרבויות בריא בדרך כלל מראים סימנים של בידול וצמיחה של תהליכים לאחר 24 שעות. בתנאים אלה, וביצוע שינויים בינוני חלקית כל 4-5 ימים, התרבויות יכול להישמר במשך תקופות ממושכות של זמן עד 4-6 שבועות.
    10. עבור הדור של תאים עצביים מבשר (NPCs), פרוטוקול דומה משמש למעט שאחרי צנטריפוגה, DMEM ללא EBS משמש. תאים הם מצופה ב-T-25 צלוחיות ב DMEM/F12 (01:03) בתוספת B27 ו EGF (20 ng / mL) כדי לאפשר היווצרות של neuropheres. כדי לבדל את NPCs, neurospheres הם מצופה על laminin (10 UG / mL) coverslips מצופה DMEM/F12 (01:03) בינוני בתוספת N2.

    3. נציג תוצאות

    תרבויות בריא תציג צמיחה בידול משמעותי לאחר 5 ימים שלאחר ההפשרה ובדרך כלל לייצב את הצמיחה שלה על ידי 10 ימים (איור 1). מכתים Immuncocytochemical של תרבויות אלה מגלה האסטרוציטים רבים (איור 2 א) ו נוירונים (תרשים 2B) הן האדם חולדה תרבויות עצבי ראשוני. פרוטוקול זה מתאים גם לדור של NPCs כמו ריחוף ללא neurospheres (איור 3A), אשר בתנאים הבחנה, תוצאה בתרבויות באיכות גבוהה מעורבת (איור 3B, C).

    איור 1
    באיור 1. בתרביות תאים של רקמות קפוא קליפת המוח האנושי. קפוא חוסם רקמת קליפת המוח האנושי הם מופשרים, מצופה על poly-ליזין coverslips מצופה גדל במשך 10 ימים. ביום 5 הרחבת התא ניכר וביום 10 confluency מושגת. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר.

    איור 2
    איור 2. מכתים Immunocytochemical של תרביות תאים. (א) תרבויות הוכתמו החלבון סמן גליה גליה חומצי fibrillary (GFAP, חיצים עבה). (ב) נוירונים התגלו עם עצבי בטא טובולין סמן III (TIII, חיצים דקים). (ג) הן האדם בתרבויות עכברוש להראות גליה שפע נוירונים לאחר 10 ימים בתרבות. נוגדנים העיקרי: עכבר אנטי GFAP (1:1000) ו הארנב נגד TIII (1:1000). נוגדנים משני: אנטי עכבר Alexa 594 (1:500) ואנטי ארנב Alexa 488 (1:500). מכתים גרעינים: Hoestch כחול (1:1000). בר קנה מידה: 50 מיקרומטר.

    איור 3
    איור 3. דור neurospheres. (א) הרקמה הקפואה היה מעובד כמתואר לעיל ואיפשר להפיץ כמו neurospheres. (ב) Neurospheres היו על coverslips מצופה זכוכית בתנאים המבדילים גדל במשך 10 ימים, וכתוצאה מכך התאים נודדות הרחק neurosphere. (ג) שני נוירונים האסטרוציטים נמצאים בשוליים של הרחבת neurosphere מבדל. Counterstaining גרעיני, נוגדנים ראשוניים ומשניים לשמש באיור 2.

    Discussion

    Cryopreservation מציע הזדמנות לבנק היקר דגימות רקמות המוח לשימוש עתידי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוטה אך יעילה ליצור שתי נוירון מועשר תרבויות תאים עצביים מאבני מבשר קפוא רקמות המוח. הליך זה חסכוני ימנע את העלויות של טכניקות מסורתיות cryopreservation לנצל יותר יקר שיעור שבשליטת מקפיאים. הפרוטוקול מאפשר לדור של תרבויות העצבית קיימא שלאחר ההפשרה על ידי מתן אמצעי מהיר אך יעיל להקפיא בלוקים רקמות. תהליך הקפאה כולו יכול לקחת קצת כמו 20 דקות. בנוסף תרבויות עצבי ראשוני, תוך שימוש בשיטה זו רקמת בלוקים יכולים גם להיות מופשר ליצור NPCs גדל כמו neurospheres צף חינם. בהקשר זה, היעדר נסיוב במדיום הקפאת שלנו מבטיחה כי התאים נשמרים במצב לא מובחן. בתנאים הבחנה, המיוצר neurospheres מהרחבת להראות קפוא רקמות שיעורי הבחנה דומה מאוד neurospheres שנוצר מרקמות טריות.

    Disclosures

    אין ניגודי אינטרסים הכריז.

    Acknowledgements

    מחקר זה נתמך על ידי תרומות של תוכנית המחקר הזדמנויות לתואר ראשון ב UCI (AR ו-SP) ומענקים ממדינת קליפורניה יוזמת מחלת אלצהיימר לבין המכון הלאומי לבריאות בארה"ב להעניק אין. HD38466, מחקר מחלת האלצהיימר מרכז המענק לא. AG16573 (JB)

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11995-073 High gluclose 1X
    Bovine calf serum supplemented Hyclone SH30072.03 For culture medium
    Neurobasal-A Medium (1X), liquid Invitrogen 1088-022
    B27 Supplement Invitrogen 17504-044 Supplement for Neurobasal medium
    N2 Supplement Invitrogen 17502-048 Supplement for Neurobasal medium
    Trypsin (10X) Cellgro 25-054CI Tissue dissociation
    Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) Sigma-Aldrich D4527-30KU Tissue dissociation
    Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) GIBCO, by Life Technologies 14065 Cleaning tissue, washes, and freezing medium
    Poly-L-Lysine- 500mg Invitrogen P2636 Substrate for adhesion of neuronal cells
    antibiotic-antimycotic (100X), liquid Invitrogen 15240-062 To prevent contamination
    Large orifice pipette Tips (1-200 ul) Fisher Scientific 02-681-141 To prevent shear stress to cells
    Graduated pipette tips (101-1000 ul) USA Scientific, Inc. 1111-2721
    21 G1 precision guide needles BD Biosciences 305165 To clean tissue
    10 ml pipette USA Scientific, Inc. 1071-0810 Individually wrapped
    50 ml tubes USA Scientific, Inc. 926-9-04
    Single edge razor blade Smith & Nephew Inc. 67-0238 To chop tissue
    60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160 For general culture
    100 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0010 For cleaning tissue
    Cryogenic box Nalge Nunc international 5026-1010
    Freezing container Nalge Nunc international 5100-0001 "Mr. Frosty"
    2.0 ml cryogenic vials Nalge Nunc international 5012-0020
    DMSO Fisher Scientific D128-500 For freezing medium
    Ethanol 200 proof Sigma-Aldrich E7023 For sterilizing razor blade

    References

    1. Robbins, R.J., et al. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol 107, 208-213 (1990).
    2. Ware, C.B., Nelson, A.M. & Blau, C.A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques 38, 879-880, 882-873 (2005).
    3. Paynter, S.J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull 75, 1-14 (2008).
    4. Thirumala, S., Gimble, J.M. & Devireddy, R.V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med 4, 224-232 (2010).

    Comments

    3 Comments

    Dear Dr. Busciglio,

    I am planning to thaw a frozen mouse cortical tissue block. Looking
    for a suitable protocol, I came across your paper entitled
    "Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of
    Highly Enriched Neuronal Cultures" (Journal of Visualized Experiments,
    2010). I have a question regarding the thawing and culturing protocol:
    On p. 2, you suggest resuspend the tissue pellet in 10 mL HBSS
    supplemented with trypsin and 50 uL DNAse (step 4). Which DNAse
    concentration should be used?

    Your prompt reply will be much appreciated.

    Thank you in advance,
    Reply

    Posted by: Or K.July 30, 2013, 8:37 AM

    Depending on the activity of the DNAse batch, the concentration that we use ranges from 50 to 80 µg/ml --

    We apologize for the omission of this information in the report --
    Reply

    Posted by: Jorge B.July 30, 2013, 2:08 PM

    Dear Dr. Busciglio,
    You did a great work and this protocol is really easy and cheap (to me). I am using mice cortical neurons in my research on ischemic stroke and these neurons should be extracted from E15-E16 pups. Each pregnant mice cost me about $ 200 and therefore if I can use neurons from adult mice according to your protocol, that will be great. I have many questions please if you can clarify:
    1- What were the ages of rats from which the brains were taken?

    2- According to your experience in this feild, can I applicate this protocol on mice cortices?

    I am very grateful for your reply and clarification.
    Sincerely,
    Qasim Alhadidi
    U. of Toledo, College of Pharmacy
    Dr. Zahoor Shah lab.
    Reply

    Posted by: Qasim A.December 7, 2013, 1:04 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter