Трансфекции правам нервные стволовые клетки с Amaxa Nucleofector

Примечание: Обратитесь к пассажей правам нейронных стволовых клеток статьи ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) и подсчет правам нейронных стволовых клеток статьи ( http://www.jove.com / индекса / Details.stp? ID = 262 ), чтобы узнать, как ресуспендирования и считать hNSPCs.

Подготовка

1. Убедитесь, что Есть много клеток для трансфекции (несколько миллионов клеток для каждого ДНК для трансфекции).
2. Пальто блюдо культуры тканей, в которые трансфекции клетки будут посеяны, с 10 мкг / мл человеческого фибронектина ночь перед трансфекции. Право, прежде чем начать трансфекции протокола, удалите фибронектин, промыть посуду с PBS, и место культуры средств массовой информации в блюдо. Оставьте блюдо в 37 ° C культуре ткани инкубатора для теплого СМИ. Кроме того, место 1 мл культуральной среды в инкубаторе предварительного теплой до 37 ° C.
3. Место ДНК (ы) для трансфекции, и трансфекции решение (от Amaxa), на льду.

Трансфекция

1. Вымойте определенное количество клеток с PBS (мы обычно используем ~ 5 х 106 клеток на трансфекции). Гранул клетки центрифугированием (1000 оборотов в минуту (~ 200xg) в течение 5 минут), удалить как можно больше PBS насколько возможно, и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл трансфекции решение обеспечены трансфекции комплект. Передача клеточной суспензии в 1,7 мл трубки Эппендорф.
2. Добавьте 5 мкл ДНК (~ 5-10 мкг ДНК на трансфекции) к клеточной суспензии и аккуратно перемешать.
3. Использование Amaxa мини-пипетки, передачи клеточной ДНК смесь в кювет трансфекции Amaxa. Убедитесь, что 1 мл подогретого питательных сред для следующего шага. Кроме того, удалить ячейки блюдо с питательной среды из инкубатора и поместить его в капот культуры ткани.
4. Место кювету в Nucleofector, вращать колесо по часовой стрелке, а затем выберите программу "-033". Нажмите клавишу Enter.
5. Успешной трансфекции указывается наличие очень плотный слой пузырьков в верхней части раствора в кювете. Добавить 500 мкл теплой СМИ в кювет, и используя Amaxa мини-пипетки, передача трансфекции клеток в блюдо с подогретого СМИ. Промойте кювету с более теплым медиа и добавьте промыть к тому же блюдо. Место блюдо с ячейками в 37 ° C культуре ткани инкубатора.

Этот протокол описывает сравнительно быстрого и эффективного трансфекции процедура hNSPCs. Используя эту процедуру, мы получили начальные эффективность трансфекции ~ 35%. Клетки трансфекции с помощью этой процедуры можно использовать для краткосрочных исследованиях (временно трансфекции клеток) или для долгосрочного исследования, если выбор агента используется для создания стабильно трансфицированных населения. Мы вызвали стабильно трансфицированных клеток, в которых ~ 70% от клетки экспрессируют экзогенных белков. В временно трансфекции hNSPCs, мы наблюдаем продолжающееся проявление экзогенных белков в течение ~ 7 дней.