Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

O objetivo geral do procedimento é estudar o aprendizado e a memória em adultos Esso Melan Gaster primeiro para determinar se as moscas sofrem de déficits locomotores. Eles são testados nos impostos geográficos negativos. O comportamento da tática fotográfica positiva do ensaio é então verificado colocando moscas em um labirinto em T e registrando a latência para se mover em direção à câmara iluminada favorecida.

Moscas com fototaxia positiva são então condicionadas a associar a câmara iluminada ao sabor amargo do quinino. Em última análise, as moscas são testadas em quão bem elas associam o estímulo aversivo com a câmara iluminada, fornecendo uma medida de aprendizado e memória. Ola, bem-vindo ao laboratório X.

Hoje vamos demonstrar a você dois ensaios comportamentais comumente usados para estudar neurodegeneração e drosófila. Primeiro, mostraremos o ensaio de supressão de fototaxia aversiva demonstrado a você por Wil Fredo sala, um estudante de graduação em nosso laboratório e eu, que será seguido pelo ensaio de impostos geográficos negativos demonstrado a você por Kaiwan, um estudante de pós-graduação em nosso laboratório. Mantenha as moscas no meio de levedura de melaço de ágar fubá padrão a 25 graus Celsius em um ciclo de luz escura de 12 horas.

No dia da oclusão, classifique as moscas virgens em grupos de 20. As moscas virgens são identificadas por sua cor clara e uma mancha esverdeada escura localizada na parte inferior do abdômen. As moscas devem ser transferidas para um frasco novo a cada três dias, e as moscas irmãs devem ser usadas para minimizar as diferenças decorrentes de origens genéticas.

10 a 20 grupos por genótipo ou tratamento devem ser testados em um estudo de taxas geográficas. Para começar, classifique as moscas fêmeas e machos em grupos de 10. Essas moscas devem ser testadas separadamente.

Uma vez que o comportamento é significativamente influenciado pelo gênero. Aguarde pelo menos uma hora após a anestesia antes de prosseguir para garantir que a atividade locomotora não seja prejudicada. Assim que as moscas estiverem perfeitamente preparadas, alinhe as aberturas de dois frascos de poliestireno vazios, unindo-os verticalmente no frasco inferior.

Meça oito centímetros da parte inferior e desenhe um círculo ao redor da circunferência. Agora que o aparelho foi montado, transfira um grupo de 10 moscas para o frasco inferior. Rejunte imediatamente os frascos e aclimate as moscas por um minuto antes do teste.

Depois que as moscas se acomodarem, bata-as suavemente no fundo do frasco e meça o número de moscas que sobem acima da marca de oito centímetros em 10 segundos. O número de moscas por grupo que ultrapassou esta marca é registado como uma percentagem do total de moscas. Repita este procedimento 10 vezes por grupo, permitindo que as moscas descansem por um minuto entre as tentativas.

Seis horas antes do ensaio PS, classifique, as moscas fêmeas em frascos de poliestireno contendo papel de filtro umedecido com água. Esta etapa garante que as moscas estejam famintas e mais perceptivas ao sabor aversivo. Neste ensaio, uma solução de quinino serve como estímulo aversivo.

Preparar uma solução de trabalho de um micromolar a partir de um molar de 0,1 molar. O labirinto em T consiste em uma coluna central com um alçapão e duas câmaras laterais, uma câmara escura e uma câmara iluminada. Na marca de dois milímetros, use uma serra manual para cortar a extremidade fechada de dois tubos de centrífuga de plástico de 15 mililitros, encaixar adaptadores de conector em cada extremidade e selar a conexão com paraforme.

Enrole um tubo com papel alumínio para fazer a manutenção da câmara escura. Monte os TMAs aparafusando as câmaras iluminadas e escuras em cada lado da coluna central. Com o alçapão no meio fechado, conclua a configuração conectando uma fonte de luz ao adaptador da câmara de luz diretamente Antes de realizar o ensaio, transfira cada mosca de um grupo de 10 para um tubo de centrífuga vazio de 15 mililitros e tampe levemente para evitar a fuga.

Em seguida, desparafuse a câmara escura dos TMAs. Transfira uma única mosca para o tubo e insira-a imediatamente de volta no labirinto. Apague as luzes da sala e acenda uma lâmpada vermelha.

Deixe a mosca se aclimatar na câmara escura por 30 segundos e, em seguida, ligue lentamente a fonte de luz que ilumina a câmara iluminada. Uma vez aceso, abra o alçapão que separa as duas câmaras. Se a mosca caminhar até a câmara iluminada em 10 segundos, é considerada positivamente tática fotográfica e está pronta para ser treinada.

A falha em responder dessa maneira indica um problema no sistema visual e requer exclusão do ensaio. Assim que a fototaxia positiva for confirmada, toque a mosca de volta para a câmara escura, feche o alçapão e desligue a luz durante um 32º período de descanso. Prepare o estímulo aversivo colocando o papel de filtro na câmara iluminada e pipetando um mililitro de solução de quinino no papel de filtro.

Garantir que todo o papel de filtro esteja completamente úmido com estímulos aversivos. Para começar a condicionar lentamente, abra o alçapão e acenda a luz. Permita que a mosca entre na câmara iluminada com aroma de quinino.

Após um minuto, toque a mosca de volta para a câmara escura. Repita este procedimento nove vezes para um total de 10 tentativas de condicionamento. Normalmente, enquanto o tipo voa, evite a câmara iluminada após três a cinco tentativas de treinamento imediatamente após o treinamento.

Realize cinco testes de teste. Se a mosca treinada não entrar na luz da câmara em 10 segundos, ela é registrada como uma passagem. A taxa de aprovação em cinco tentativas consecutivas é registrada e designada.

PC zero. Após o treinamento e as gravações iniciais do PC zero, cada mosca é colocada de volta em seu arquivo de alimento numerado original e mantida de lado por seis horas. Seis horas após o treinamento, realize cinco tentativas de teste adicionais, conforme demonstrado anteriormente, essa taxa de aprovação representa o PC seis e é uma medida da memória de curto prazo.

No ensaio de geotaxas negativas, o número de moscas que cruzam a marca de oito centímetros é convertido em porcentagem e apresentado como a taxa de aprovação de escalada. Mais de 10 tentativas, como visto aqui à direita, macho ou fêmea de 10 dias voa sobre a expressão. A tau humana tem déficits locomotores significativos em comparação com a GFP de correspondência etária sobre a expressão de moscas à esquerda.

O desempenho no ensaio de supressão de fototaxia aversiva é representado pela taxa média de aprovação ou pela porcentagem de tentativas de evasão bem-sucedidas. Sobre o total de ensaios voa sobre a expressão de tau mostrada aqui à direita pálida para associar a luz a um sabor amargo quando comparada ao grupo controle à esquerda, tanto imediatamente após o treinamento quanto quando testado, seis horas depois Após este procedimento, as amostras podem ser coletadas para análise imuno-histoquímica para responder a perguntas adicionais sobre diferenças morfológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar o aprendizado e a memória e voar amigos.

E lembre-se, é tudo sobre você.