Name: Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a criar bibliotecas mutantes aleatórias e realizar seleções funcionais para evoluir novas atividades enzimáticas em Escherichia coli. Este protocolo combina mutagênese direcionada com triagem eficiente de mutações benéficas.

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Este trabalho tem sido apoiado por K08 prêmio CA116429-04 para MC e por uma concessão do Cancer Conquer Now (preocupação) # fundação 8501

<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este artigo apresenta um protocolo de mutagênese que permite a geração de grandes bibliotecas de mutantes aleatórios sem a necessidade de clonagem ou PCR. Este método baseia-se propenso a erros de replicação de um plasmídeo uma seqüência de interesse. Em teoria, as mutações devem ser em grande parte restrita à 100-300 pb, localizado imediatamente a jusante do interruptor de RNA / DNA, o tamanho do líder vertente intermediários produzidos por Pol I 2,10. Descobrimos que nas condições apresentadas neste protocolo, mutações Pol I ocorrem em todo o plasmídeo, embora diminuindo em freqüência como a distância entre os aumentos plasmídeo ori (Figura 3). Este achado implica que a transição ou &quot;switch&quot; de Pol I Pol III ColE1 durante a replicação do plasmídeo é muito mais gradual do que o anteriormente reportado, pelo menos, nas nossas condições experimentais 2, e concorda com estudos anteriores sugerindo uma redundância funcional entre I e Pol Pol III 11. Nosso protocolo original descrito mutagênese em culturas de líquido (4). Este protocolo produz mutações 0,41 / kb para d &lt;1000, ou seja, dentro da bp 1000 ao lado do RNA / DNA switch (Tabela 1). Hypersaturation deixando a cultura líquido no shaker durante 3 dias sem a adição de qualquer mídia fresco aumenta a freqüência de mutação para 0,70 mutações / kb, mas resulta em muito pobre rendimento plasmídeo (menos de 1% em relação ao dia 1; dados não mostrados) ( Tabela 1). Aqui apresentamos um protocolo simplificado baseado diretamente plating a transformação do plasmídeo em ágar-alvo sólido a 37 ° C (Figura 1). Este procedimento produz a maior freqüência de mutação / ciclo de mutagênese (0,92 mutações / kb para d &lt;1,000) e facilita muito a iteração. Mudanças nas condições de cultura para meios sólidos também afeta o espectro de mutação (Tabela 2). Mutagênese plaqueamento direto reduz a marcada assimetria entre substituições de bases complementares par visto na cultura líquida (compare C → T vs G → A e A → G vs T → C). Por outro lado, plaqueamento direto produzido indels mais (de menos de 0,5% a 4%) e diminuiu o número de mutações A → G em 3 vezes, levando a uma super-representação de G / C mutações (74%). No geral, acreditamos que a maior simplicidade e maior eficiência do protocolo de plaqueamento direto aqui apresentados superam os benefícios do espectro de mutação um pouco mais equilibrada produzidos por mutagênese líquido. Dentro da meta plasmídeo, as mutações geradas pelo nosso método não se restringem à seqüência alvo desejado. No entanto, a evolução do romance de atividades bioquímicas deve ser dependente de mutações no gene alvo, uma vez que representa uma mais qualitativa do que uma mudança quantitativa. Assim, combinando a nossa mutagênese plasmídeo com a triagem de mutantes em placas gradiente capitaliza os pontos fortes do nosso sistema (grandes bibliotecas e disponibilidade de seleção) para a evolução de novas propriedades bioquímicas. Outras aplicações de mutagênese aleatória como a otimização existentes atividades enzimáticas ou randomizing áreas específicas de um gene exigem clonagem seguintes mutagênese aleatória. Neste caso, tendo a biblioteca em um plasmídeo, por oposição a um produto de amplificação PCR melhora a eficiência da clonagem, facilitando a amplificação e restrição. Em suma, nós demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante de um gene-alvo, dado que se destaca por sua simplicidade e pela diversidade das bibliotecas geradas. Nós mostramos como esse método pode ser acoplado com seleções funcionais para a evolução eficiente de novas atividades bioquímicas. Além disso, nossa in vivo gerado bibliotecas podem ser facilmente clonados, permitindo site-specific mutagênese ou otimização das atividades existentes.

<table><tbody><tr><td>carbenicilina</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>0,1 mg/ml final</td></tr><tr><td>tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>0,05 mg/ml final</td></tr><tr><td>cloranfenicol</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>0,03 mg/ml final</td></tr><tr><td>Ágar LB Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Ágar mole</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>Preparado in loco</td></tr><tr><td>Acridina Laranja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>Emulsão de Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>Placa quadrada 100x100x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Placa redonda 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio 25x75x1 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporador 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos com folga de 2 mm</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Kit Zippy de mini-preparação</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagênese e funcional protocolos de seleção para a evolução dirigida de proteínas em e. coli</em

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

A geração eficiente de diversidade genética representa uma ferramenta valiosa molecular que pode ser usado para rotular a síntese de DNA, para criar assinaturas única molecular, ou a evoluir proteínas no laboratório. Aqui, apresentamos um protocolo que permite a geração de grandes (&gt; 10 11) bibliotecas mutante para uma seqüência alvo. Este método é baseado na replicação de um plasmídeo codificando ColE1 a seqüência desejada por uma variante de baixa fidelidade da DNA polimerase I (LF-Pol I). O alvo do plasmídeo é transformada em uma cepa de E. mutator coli e semeadas em meios sólidos, rendendo entre 0,2 e 1 mutações / kb, dependendo da localização do gene alvo. Freqüências mais altas de mutação são alcançados por iteração deste processo de mutagênese. Em comparação com métodos alternativos de mutagênese, nosso protocolo destaca-se pela sua simplicidade, como nenhuma clonagem ou PCR estão envolvidos. Assim, nosso método é ideal para a rotulagem de mutação de plasmídeos ou modelos I, com Pol ou para explorar grandes seções de espaço de seqüência para a evolução das actividades não presentes no alvo original. O rígido controle espacial que PCR ou randomizado oligonucleotídeos baseados em oferecer métodos também podem ser alcançados por meio da clonagem posterior de seções específicas da biblioteca. Aqui nós fornecemos protocolos mostrando como criar uma biblioteca de mutantes aleatórios e como estabelecer droga baseada em seleções em E. coli para identificar mutantes exibindo novas atividades bioquímicas.

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

A geração eficiente de diversidade genética representa uma ferramenta molecular inestimável que pode ser utilizada para marcar a síntese de DNA, para criar moléculas únicas...

O objetivo geral deste procedimento é criar uma biblioteca de mutantes aleatórios para uma sequência de DNA alvo específica e identificar e caracterizar rapidamente os mutantes utilizando uma seleção funcional semi-quantitativa. Isso é realizado primeiramente transformando um plasmídeo com uma origem de replicação contendo a sequência alvo na linhagem mutadora coli. Após o plaqueamento e incubação das células durante a noite, elas são colhidas e o plasmídeo alvo é isolado para obter a biblioteca de mutantes; em seguida, a biblioteca de mutantes é transformada em uma linhagem repórter para caracterizar as mutações na segunda parte do protocolo. Uma placa de crescimento em gradiente é montada e culturas bacterianas da linhagem repórter são inoculadas em uma placa de Petri separada contendo ágar mole.O passo final do procedimento é carimbar e transferir essas culturas bacterianas para o gradiente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações no perfil fenotípico de uma sequência-alvo específica por meio de diferenças no crescimento em um gradiente de fármaco. Este vídeo apresenta um método para a evolução direcionada de proteínas em *E. coli*.Esse processo imita a evolução natural na geração de bibliotecas aleatórias de nutrientes, seguida por uma seleção que restringe essa diversidade. Assim, melhora nossa capacidade de gerar novas atividades bioquímicas para fins industriais ou biomédicos. Este procedimento possui duas componentes: a geração de uma biblioteca mutante aleatória e a seleção funcional para obter mutações com ganho de função. A demonstração deste procedimento será feita por Jennifer Allen, uma técnica do meu laboratório.Antes do início deste protocolo, células eletrocompetentes JS200 expressando uma variante de baixa fidelidade da DNA polimerase uma ou polimerase de baixa fidelidade, uma, que foram previamente preparadas conforme descrito no protocolo escrito, essas células contêm um alelo termossensível da polimerase uma, de modo que a atividade da polimerase de baixa fidelidade predomina a 37 graus Celsius, construa um plasmídeo alvo contendo uma origem de replicação de coli, uma, com a sequência alvo clonada adjacente à origem de replicação. A polimerase de baixa fidelidade inicia a replicação do plasmídeo coli, uma, introduzindo assim mutações para iniciar a mutagênese.Combine 40 microlitros de células eletrocompetentes e entre 30 e 250 nanogramas de DNA plasmidial alvo em uma lacuna de dois milímetros. Realize a eletroporação com pulso vet, misturando a solução na eletroporadora a 1800 volts. Verifique a constante de tempo ou TC para garantir condições uniformes de ativação para cada amostra.Idealmente, TC equivale a cinco a seis milissegundos. Deixe a mistura de DNA celular recuperar em um mililitro de caldo LB durante 40 minutos a 37 °C sob agitação a 250 RPM. Obtenha uma placa de Petri LV agro de 100 milímetros pré-aquecida a 37 graus Celsius, contendo antibióticos apropriados para seleção de ambos os plasmídeos, e plaque as células recuperadas em uma diluição apropriada para obter uma concentração próxima à de um gramado, definida como um número distinto, porém incontável, de colônias, conforme mostrado neste exemplo.Após incubação durante a noite, colete as colônias bacterianas das placas de Petri com caldo LB. Isole o plasmídeo, o DNA das células coletadas; o plasmídeo resultante constitui a biblioteca de mutantes aleatórios.Realize uma digestão por restrição cortando a biblioteca de plasmídeos com uma enzima de restrição que linearize tanto o plasmídeo alvo quanto o polo. Em um plasmídeo, execute um gel analítico de aro no DNA plasmidial isolado para confirmar a qualidade e a quantidade. Após a verificação dos plasmídeos, digira um micrograma da biblioteca com uma enzima de restrição que linearize o plasmídeo do polo, mas não corte o plasmídeo alvo.Após a digestão com enzima de restrição ser concluída, purifique a biblioteca utilizando um kit de purificação de DNA. Por fim, transforme a biblioteca purificada em uma linhagem repórter para caracterizar as mutações. Para iniciar o preparo do gradiente, marque 10 faixas espaçadas uniformemente ao longo de uma borda da base da placa de Petri quadrada.Coloque a placa em uma inclinação de modo que a borda inferior marcada fique elevada sete milímetros. Despeje 25 mililitros de ágar LB morno, misturado bem com uma concentração apropriada do agente seletivo, na placa inclinada. Esta é a camada inferior do gradiente.Certifique-se de que o ágar LB recobre a placa de Petri de modo que a extremidade elevada marcada da placa contenha aproximadamente um milímetro de ágar LB, e a parte inferior contenha cerca de oito milímetros. Tampe a placa com a tampa KU para ventilação e deixe o ágar solidificar por 10 a 15 minutos. Após a camada inferior de ágar LB ter endurecido, transfira a placa para uma superfície plana.Em seguida, despeje 25 mililitros de ágar LB morno sem o agente seletivo para recobrir a superfície do primeiro ágar, certificando-se de cobrir toda a camada inferior. Tampe a placa com a tampa KU para ventilação e, então, deixe o ágar solidificar por 10 a 15 minutos para realizar a transferência por carimbo das bactérias. Primeiro, obtenha culturas bacterianas da linhagem repórter e dilua-as para apresentar densidades celulares idênticas, com uma densidade óptica a 600 nanômetros inferior a 1,0.Em seguida, transfira dois mililitros de ágar-ágar líquido em equilíbrio a 42 graus celsius para o fundo de uma placa de Petri redonda de 100 milímetros, pipete 40 microlitros da cultura bacteriana para dentro do ágar-ágar mais macio e, então, misture movimentando suavemente a placa. Revesta a borda longa da lâmina de microscópio de vidro com a mistura de ágar-ágar mais macio. Em seguida, alinhe a borda revestida da lâmina com a marca inferior no recipiente com gradiente.Toque a lâmina na superfície do ágar. Um toque suave é suficiente para transferir uma fita do ágar macio para a superfície do gradiente. Em seguida, a lâmina é colocada de lado para limpeza e reutilização.Repita este processo. As amostras restantes e os controles experimentais devem ser incluídos em cada placa com gradiente. Se vários gradientes estiverem sendo utilizados, incube a placa com gradiente virada para baixo durante a noite a 37 graus Celsius. Os tempos e temperaturas de incubação podem variar para diferentes cepas bacterianas de leitura, mas a incubação durante a noite a 37 graus Celsius geralmente é suficiente para o crescimento visível.Por fim, obtenha imagens e analise o crescimento celular conforme descrito no protocolo escrito. Abaixo estão imagens de uma linhagem repórter transformada com P-G-F-U-V não mutado ou com uma biblioteca mutante de PG FPUV que foram submetidas ao processo. Após quatro rodadas de mutagênese, colônias escuras ou fracas indicam plasmídeos contendo mutações que inativam a GFP.Esta figura representa a frequência de mutações ao longo da sequência neutra do plasmídeo alvo em intervalos de 100 pares de bases. Observe que as mutações ocorrem em toda a sequência do plasmídeo, mas com maior frequência próximo à origem de replicação. Aqui, o crescimento de mutantes é mostrado em um gradiente de droga.A distância crescida em direção ao topo do gradiente indica o perfil diferencial de resistência à droga entre os mutantes. Neste exemplo, bibliotecas de plasmídeos da desmetilase oxidativa humana ABH dois foram triadas em busca de mutantes com resistência aumentada ao metil metano sulfonato, utilizando gradientes de seleção com drogas. Duas. Tais bibliotecas, representando duas e quatro iterações do protocolo de mutagênese, são mostradas em comparação com o tipo selvagem parental e o vetor vazio.A linha branca denota o limite acima do qual colônias mutantes individuais foram isoladas. Para análise fenotípica adicional, mutantes da beta-lactamase, R 1 64 H e E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, previamente identificados utilizando mutagênese P um com baixa fidelidade e seleção astri e m, são mostrados em 0,4 micrograma por mililitro e em quatro microgramas por mililitro. A proteção conferida pelo gradiente de cefotaxima contra a cefotaxima é indicativa de atividade de beta-lactamase de espectro estendido.Observe que a enzima beta-lactamase do tipo selvagem não confere proteção em relação às células que expressam um vetor vazio. Portanto, esses mutantes representam uma adaptação ou a evolução de uma nova atividade bioquímica. Aqui apresentamos uma combinação poderosa de mutagênese e seleção funcional para a geração dessas novas atividades bioquímicas.Uma seleção funcional pode ser obtida por meio de seleção com drogas ou por complementação genética, aproveitando nossa capacidade de gerar grande diversidade genética. A patogênese pode precisar ser restrita a uma sequência específica para otimizar atividades proteicas preexistentes ou para patogênese direcionada a sítios. Isso pode ser facilmente realizado por clonagem.Além disso, a mutagênese pode ser desacoplada de uma seleção funcional para obter ataques característicos ou pegadas mutacionais.

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