Name: 使用C2C12成肌细胞的生物能简介实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习使用XF 96细胞外流量分析仪检测C2C12成肌细胞的线粒体功能，测量基础呼吸、ATP周转、质子泄漏和备用呼吸能力等关键参数，为细胞能量代谢研究提供可靠方法。

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在本实验中，将C2C12成肌细胞以特定密度接种于Seahorse细胞培养板中。通过测定基础氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），以建立基线水平。
1. 细胞注射
通过连续添加三种不同的化合物，细胞的代谢受到干扰，从而改变其生物能量特征。其中一组作为对照组，加入运行培养基作为对照“化合物”。
<ol>
<li>首次注射的试剂是寡霉素。寡霉素通过阻断F₀部分的质子通道来抑制ATP合成o 部分ATP合酶（复合物V）。在线粒体研究中，它用于抑制状态3（磷酸化）呼吸。在细胞中，可用于区分用于ATP合成的氧气消耗百分比与为克服线粒体内膜天然质子漏所需消耗的氧气百分比。</li>
<li>第二次注射的是FCCP。FCCP（羰基氰化对三氟甲氧基苯腙）是一种离子载体，属于可移动的离子转运体。它是一种解偶联剂，通过跨线粒体膜转运氢离子，绕过ATP合酶（复合体V）的质子通道，从而破坏ATP的合成。这种线粒体膜电位的崩溃导致能量和氧气被迅速消耗，而无法生成ATP。在此情况下，OCR和ECAR均会升高：OCR升高是由于解偶联作用，而ECAR升高则是由于细胞试图通过糖酵解途径生成ATP以维持其能量平衡。 
FCCP 处理可用于计算细胞的“备用”呼吸能力，该能力定义为最大非受控耗氧率（OCR）与初始基础耗氧率之间的定量差值。已有研究提出，即使在最大生理或病理生理刺激条件下仍维持一定水平的备用呼吸能力，是决定细胞活力和/或存活的重要因素。细胞在能量需求增加的情况下应对压力的能力，在很大程度上受线粒体生物能量能力的影响。这种生物能量能力由多种因素决定，包括细胞向线粒体递送底物的能力以及参与电子传递的酶的功能活性。</li>
<li>在第三次注射中，向细胞中加入复合体 I 抑制剂鱼藤酮。这将关闭线粒体呼吸，从而能够分别计算出对呼吸有贡献的线粒体和非线粒体部分。由于线粒体功能受损，可观察到氧耗率（OCR）下降，同时细胞外酸化率（ECAR）相应升高，因为细胞转向更为依赖糖酵解的状态以维持其能量平衡 
鱼藤酮是一种线粒体抑制剂，可阻止电子从复合体I中的铁硫中心（Fe-S）向泛醌（辅酶Q）的转移。复合体I被抑制后，NADH中的势能无法转化为ATP形式的可利用能量。 
</li>
</ol>
2. 试剂和材料
<ol>
<li>寡霉素、FCCP 和鱼藤酮溶液（Seahorse 线粒体应激测试试剂盒）</li>
<li>DMEM 运行培养基（Seahorse #100965-000）</li>
<li>DMSO（Sigma D8418）</li>
<li>蒸馏水（Gibco 15230-170）</li>
<li>校准缓冲液（Seahorse Bioscience）</li>
</ol>
3. 培养基
<ol>
<li>500 mL DMEM (Gibco 11965-092)</li>
<li>10% FBS (Hyclone SH90070.03)</li>
<li>5 mL 青霉素-链霉素溶液 (Gibco 15140-122)</li>
<li>5 mL 丙酮酸钠 (Sigma S8636)</li>
<li>5 mL 谷氨酰胺最大补充液 (Glutamax) (Gibco 35050-061)</li>
</ol> 
4. 接种方案
<ol>
<li>将细胞以每孔 10,000 个细胞 的密度接种于 XF96 细胞培养板中，每孔加入 100 μL 培养基，置于 37°C、含 10% CO2 的培养箱中培养。</li>
<li>细胞在接种后 1 小时内即可贴附于 XF96 细胞培养板。</li>
<li>接种后 24 小时，使用 XF96 对细胞进行检测。</li>
</ol>
5. 检测模板的制备
<ol>
<li>使用分析向导（附录 I），生成具有以下分组布局的模板： 
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Seahorse XF96 分析设置示意图；代谢活性分析；细胞呼吸测量。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 孔板网格布局，标明列和分组分配</li>
</ol>
6. 化合物制备
<ol>
<li>按如下方法在XF DMEM检测培养基中配制以下化合物： 
10 μM 寡霉素，30.0 μM FCCP，20.0 μM 鱼藤酮。 
上述浓度为化合物注入孔中时形成的10倍稀释终浓度。实际工作浓度为： 
1 μM 寡霉素，3.0 μM FCCP，2.0 μM 鱼藤酮
</li>
</ol>
7. 培养基更换与细胞准备
<ol>
<li>将细胞板放置于XF Prep Station上</li>
<li>设定每孔培养基的终体积为160 μL。</li>
<li>在37°C、无CO2的培养箱中孵育60分钟，使细胞与检测培养基预先平衡。</li>
</ol>
8. 加载传感器盒
<ol>
<li>在将化合物加入传感器微孔板之前，先将其预热至 37°C，并按以下方式将化合物加入加样孔中：
<ol>
<li>第 1–4 列：在 A、B 和 C 孔中分别加入 16、18 和 20 μL XF 检测培养基（DMEM）。</li>
<li>第 5–12 列： 
在 A 孔中加入 16 μL 寡霉素 
在 B 孔中加入 18 μL FCCP 
在 C 孔中加入 20 μL 鱼藤酮</li>
</ol></li>
</ol>
9. 实验方案命令
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>命令</td>
 <td>时间（分钟）</td>
 <td>端口</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>校准</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>平衡</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>循环开始</td>
 <td>3X</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>混合</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>等待</td>
 <td>2</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>测量</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>循环结束</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>注入</td>
 <td> </td>
 <td>A</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>循环开始</td>
 <td>2X</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>混合</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>等待</td>
 <td>2</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>测量</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>注入</td>
 <td> </td>
 <td>B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>循环开始</td>
 <td>2X</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>混合</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>等待</td>
 <td>2</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>测量</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>注入</td>
 <td> </td>
 <td>C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>循环开始</td>
 <td>2X</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>混合</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>等待</td>
 <td>2</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>测量</td>
 <td>3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>结束</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. 实验方案命令

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

Min Wu、Per Bo Jensen、George W. Rogers 和 David A. Ferrick 均为 Seahorse Bioscience 公司的员工，该公司生产本文所介绍的试剂和仪器。

该实验源自经典的线粒体功能检测方法，可作为研究细胞代谢、线粒体功能及整体生物能量学各种变化的复杂实验设计的基础框架。
本实验中使用的所有化合物均应优化至能够产生最大效应的浓度，即必须通过单独的滴定实验来确定这些数值。这一点对于FCCP尤为重要，因为其滴定曲线通常较为陡峭，过量的FCCP实际上可能降低氧耗率（OCR）的响应。建议测试的典型范围（终浓度）如下：
<ul>
<li>0.1 - 1.0 µg/mL 寡霉素</li>
<li>0.1 - 5.0 µM FCCP</li>
<li>0.1 - 1.0 µM 鱼藤酮</li>
</ul>
请注意，每种化合物（尤其是 FCCP）的反应会受到检测培养基成分（基础类型、[葡萄糖]、[丙酮酸盐]、BSA 的有无等）的影响。此外，如果改变了 XF 检测培养基的成分，则需要重新进行优化。由于 FCCP 的作用，丙酮酸盐的存在及其浓度对于获得最大呼吸能力尤为重要。Seahorse Bioscience 在多种细胞系中观察到，省略丙酮酸盐会消除细胞对 FCCP 产生最大反应（高于基础水平）的能力。通常应测试 1–10 mM 范围内的丙酮酸盐浓度，以确定获得最大呼吸作用所需的最优丙酮酸盐浓度。请注意，可能需要对 [丙酮酸盐] 和 [葡萄糖] 进行“交叉滴定”，以获得实验的最佳培养基条件。
本实验的典型结果如下图所示，分别为氧耗率（OCR）随时间变化的曲线图和细胞外酸化率（ECAR）随时间变化的曲线图：
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="显示对寡霉素、FCCP、鱼藤酮的代谢反应的OCR线图；时间与氧气消耗速率的关系。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 氧气消耗速率（OCR）与时间的关系
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="ECAR 曲线图，显示经寡霉素、FCCP、鱼藤素处理后随时间变化的代谢活性，数据点。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. ECAR 与时间的关系
在此实验中，我们观察到细胞依次加入各化合物后，氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）出现预期的变化。加入寡霉素后，由于线粒体复合物V的ATP合成被抑制，导致OCR下降。由于细胞无法通过氧化磷酸化（OXPHOS）合成ATP，转而依赖糖酵解途径满足ATP需求，因此我们观察到ECAR升高。如前所示，FCCP作为一种解偶联剂发挥作用。由于细胞必须克服线粒体内膜上的质子泄漏，为将过量质子重新泵回线粒体膜内，氧气消耗显著增加，从而导致OCR明显上升。最后，鱼藤酮分别抑制线粒体复合物I和复合物III，导致电子传递链中的电子传递中断，因此氧气消耗量急剧减少。
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="显示基础呼吸、ATP转换和添加抑制剂后呼吸能力的耗氧率随时间变化曲线图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 呼吸参数
除了呼吸和ECAR的预期变化外，还可从这些数据中获得多种呼吸参数。这在上图中进行了总结：
在此，我们可以获得有关细胞基础呼吸的信息，包括用于ATP生成的氧气消耗百分比，以及用于维持质子梯度（由H+泄漏引起）的氧气消耗量。此外，我们还可以获得解偶联呼吸条件下的最大呼吸速率（有时称为备用呼吸能力），最后，我们能够确定非线粒体过程所导致的氧气消耗量。
越来越多的研究正在采用这种线粒体特征分析来评估细胞生物能量学状态、识别线粒体功能障碍，并预测细胞对压力和/或损伤的响应能力。有关该实验方法及备用呼吸能力概念的更多信息和细节，请参见以下文献1-8。

<table><tbody><tr><td>寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 溶液</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Seahorse 线粒体应激测试试剂盒</td></tr><tr><td>DMEM 运行培养基</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>校准缓冲液</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用c2c12成肌细胞的生物能量谱分析实验

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

测量细胞代谢并理解线粒体功能障碍的能力，使全球科学家能够推进其研究，以深入认识线粒体功能在肥胖、糖尿病、衰老、癌症、心血管功能及安全性毒性中的作用。
细胞代谢是指细胞摄取底物（如氧气、葡萄糖、脂肪酸和谷氨酰胺），并通过一系列酶促控制的氧化还原反应将底物转化为能量的过程。这些细胞内生化反应可生成ATP，并向胞外环境释放热量以及乳酸和CO2等化学副产物。
通过测量细胞消耗氧气的速率，可以深入了解细胞的生理状态及其状态变化，该速率是线粒体呼吸的指标，即氧气消耗速率（OCR）。细胞还通过糖酵解产生ATP，即在不依赖氧气的情况下将葡萄糖转化为乳酸。在培养孔中，乳酸是质子的主要来源。通过检测细胞周围细胞外环境因释放质子而引起的酸化，间接测量所产生的乳酸，可得到细胞外酸化速率（ECAR）。
在本实验中，将C2C12成肌细胞以特定密度接种于Seahorse细胞培养板中。测定基础氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），以建立基础代谢速率。随后通过依次加入三种不同的化合物，对细胞进行代谢干扰，从而改变细胞的生物能量特征。
该检测方法源自一种经典的线粒体评估实验，可作为构建更复杂实验的基础框架，用于研究线粒体的生理与病理生理功能，并预测细胞对各种应激和/或损伤的响应能力。

提供了一种用于分析细胞线粒体功能的方法描述。该方法生成的线粒体功能谱可在一次实验中测量四个线粒体功能参数：基础呼吸速率、ATP偶联呼吸、质子漏和备用呼吸能力。

使用C2C12成肌细胞的生物能量谱分析实验

测量细胞代谢并理解线粒体功能障碍的能力，已使全球科学家能够推进其在……领域的研究

以下实验的总体目标是通过使用XF 96细胞外通量分析仪测量氧化代谢的多个参数，来检测活细胞和分离线粒体中线粒体的功能状态。这些参数包括基础呼吸、ATP转换、质子泄漏以及最大呼吸或备用呼吸能力。实验通过向C2C12成肌细胞依次添加特定的线粒体呼吸调节剂，测定氧气消耗速率（OCR，即呼吸的指标）的变化，以及葡萄糖转化为乳酸的过程（通过糖酵解生成ATP）来实现这一目标。细胞中的另一条主要能量通路也通过ECAR或细胞外酸化率来测量。可以获得线粒体功能分析结果，这些结果揭示了线粒体功能在决定细胞寿命中的核心作用。大家好，我叫David Nichols。在我的整个职业生涯中，我一直是一名线粒体研究领域的科研工作者，而我在研究中使用过的最重要设备就是氧电极。如果你能够在不同条件下测量分离线粒体的耗氧速率，就能获得极为重要的信息。当你转向细胞研究时，尤其是培养在多孔板或盖玻片上的细胞，传统的经典方法便不再适用。这是一个重大难题，几年前通过开发一种多孔板检测方法得以解决，该方法使我们能够在多孔板体系中并行研究细胞的呼吸作用。今天您将看到的是一个非常简单但信息丰富的实验，我们设计该实验旨在监测培养细胞中线粒体基本生物能量功能。首先，在XF 96细胞培养板中接种细胞，每孔10,000个细胞，加入100微升培养基，置于37摄氏度、含10%二氧化碳的培养箱中培养。接种细胞24小时后，可使用XF 96分析仪进行检测。向导将生成一个具有以下分组布局的模板：第1至第12列均包含10,000个C2C12细胞。蓝色的第一组作为对照细胞。红色的第二组将给予寡霉素（oligo Mycin）、FCCP 和 roone 药物。接下来，按照方案书面部分的描述，使用 X-F-D-M-E-M 检测培养基配制化合物。寡霉素、FCCP、鱼藤酮。这些化合物已预先分装在XF细胞线粒体应激测试试剂盒中。使用XF加样工作站，将培养基更换为DMEM运行培养基。最后，将细胞置于37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育60分钟，使细胞在向传感器微孔板加入可注射化合物前，预先与检测培养基达到平衡。将化合物预热至37摄氏度后，按以下方式加入加样孔中：对于第1至第4列，在A、B和C孔中分别加入16、18和20微升XF检测培养基或DMEM。对于第5至第12列，在A孔中加入16 µL的liga mycin，在B孔中加入18 µL的FCCP，在C孔中加入20 µL的rot known。接下来，定义实验方案：将循环次数设置为3次，混合时间为3分钟，检测时间也为3分钟。然后，点击“开始”。按照屏幕上的说明操作，在校准完成后提示用户何时加载试剂盒。根据用户提示，添加用于实验的细胞板，然后单击继续，运行检测程序。实验结束后取出培养板。本检测方法源自经典的线粒体功能分析实验，可作为研究各种化合物对细胞代谢、线粒体功能及整体生物能量活动影响的复杂实验设计框架。在此，我们观察到细胞经各化合物依次处理后，其耗氧率呈现出预期的反应变化。由于阻断了线粒体复合体V的ATP合成，寡霉素处理导致ATP水平下降。由于细胞在寡霉素处理后无法通过氧化磷酸化合成ATP，因此转而依赖糖酵解来满足其对ATP的需求。因此，我们观察到细胞外酸化率（ECAR）增加，这是糖酵解增强的指标，与先前研究结果一致。FCCP作为一种解偶联剂，可消除质子回流的限制。呼吸作用加快，此时受限于电子传递。最后，已知的抑制剂抑制了线粒体复合物Ⅰ，导致电子传递链中的电子流动停止，因此氧气消耗量显著减少。通过该过程可获得细胞基础呼吸的信息，用于ATP生成的耗氧百分比，以及因质子泄漏而用于维持质子梯度的耗氧量。此外，我们还可以在解偶联呼吸条件下获得最大呼吸速率，有时也称为备用呼吸能力。最后，我们能够确定非线粒体过程所消耗的氧气量。您刚刚已在 Seahorse 实验中观察到这一点。XF 96 是一系列实验，可提供大量关于细胞线粒体生物能量学的信息。其中最基本且至关重要的实验，我们称之为实验一，可提供关于基础呼吸、ATP 转换、线粒体质子泄漏以及备用呼吸能力的信息。这些参数可为您提供有关细胞内线粒体生物能量状态的基本信息。

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生物学

使用C2C12成肌细胞的生物能简介实验

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从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

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人外周血单个核细胞的冷冻保存与生物能量学评估

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