Name: 網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: 学ぶマウス眼の解剖法で網膜色素上皮の全マウントを作成する技術。神経科学や眼科学の研究に応用でき、網膜発生や疾患メカニズムの解明に貢献します。

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この作品は、環境健康科学研究所によってサポートされていました[K22ES012264へAJRB]と米国癌協会InstitutionalResearchグラント[ACS - IRG - 00 - 173 - 04]パイロットprojectaward [AJRBへ]。我々はまたしてはいけないことの例については、原稿と特に映像とアダムブラウンのコメントの重要な読書のためにビショップの研究室のメンバーに感謝。私たちは、私たちに解剖のビデオの撮影用カメラのセットアップ彼の解剖スコープ/ビデオの使用を可能にするためGreehey小児がん研究所の博士ドナルドウェンに感謝。私たちは、シャープと私たちの顕微解剖ツールの修理のためコルテインスツルメンツでDaronブラウンに感謝する。

1。眼球の外から余分な組織を取り除く<ol><li> 35mmディッシュの蓋に1X PBSを注ぐ。レベルは、単に蓋の唇未満である必要があります。 </li><li>ストレートピンセットを使用して、35mmディッシュに蓄積管からの眼（s）を転送する。 1：目は2つの理由のためにPBSに浸漬されています。無関係な組織は、あなたが見ることができるので、目から離れて"フロート"と簡単にそれらを削除し、2になります。懸濁液中のまま解剖時には、目が自然にこの形状ではなく、それに対して作業できるように、その球状の形状を維持します。 </li><li>直角鉗子（45 °と15 °）の両方のペアを使用して、静かに（角膜に向かってすなわち）穀物に対して組織を引っ張って、できるだけ多くの筋肉と結合組織として削除します。いくつかの結合組織が維持されます。努力は、できるだけ少ないとして眼球を圧迫するためになされるべきである。 </li><li>春のはさみについては、15 °の鉗子を交換。 45 °の鉗子との着実な目を保持しながら、残りの筋肉や結合組織だけでなく、視神経を切り取るために春のはさみを使用してください。 *ヒント：トリムして木目に逆らって組織をプッシュするはさみの外側のエッジを使用してください（corneo -強膜の分周に向かって）と。すべての余分な組織を目から除去されるまで操作を続行します。 </li></ol> 2。角膜と水晶体を取り除く<ol><li>角膜を上に向けて、角膜の中心部にある小さな倍を挟まないように45 °の鉗子を使用してください。 </li><li>春のはさみを使用して、フラップの基部に小さな切開を行います。フラップを手放す。 </li><li>目を押し続けると、まだピンセットで、に低い鋏ブレードを挿入し、垂直に切開するとcorneo -強膜除算に向かってカットを行います。角膜と虹彩の両方が切断されるようにアイリスの下に下刃を維持しようとします。 corneo -強膜デバイドのすべての方法を切断しないでください。目に挿入されたはさみをしてください。 </li><li>あなたの45 °の鉗子を使用して、慎重にはさみがcorneo -強膜デバイドと平行になるように、目を回転させ、小さなカットを行います。徐々にすべての道の周りに小さな切開を行う、眼360 °回転させる。再び、虹彩と角膜の両方が切断されるようにアイリスの下で春のはさみの下刃を維持しようとします。離れて目の残りの部分から虹彩と角膜を持ち上げて、それらを捨てる。 </li><li>その側に目を傾け、レンズを強制的に、目の後半に軽く押し下げます。レンズを捨てる。残りのアイカップの内側は滑らかで、不透明になるはずの神経網膜、が並んでいます。 </li></ol> 3。第4四半期に、その結​​果生じるアイカップ、 - "花弁のある"、花のような構造を<ol><li>目は、アイカップの開口部があなたの体に垂直になるように配置する必要があります。安定して位置アイカップにお使い45 °の鉗子を使用してください。 </li><li>あなたの前のあなたの春のはさみを保持しているので、彼らはあなたの体に垂直な、オープンアイカップの上端にあなたの春のはさみの下刃を挿入します。あなたの45 °の鉗子を使用して、慎重に、単一の、ストレートカットが視神経乳頭に向かってcorneo -強膜の除算から作ることができるように、アイカップを合わせます。すべてのカットはcorneo -強膜デバイドに垂直でなければならず、指定されない限り、それに切断することなく、できるだけ視神経乳頭に近いもの行く必要があります。 </li><li>あなたの体との直角度を維持し、アイカップを180 °回転させる。第二垂直カットを作るステップ3.2での技術を使用してください。 </li><li>アイカップを回転させ、さらに2つのカットをするために3.2で説明した技法を繰り返す。すべての4つのカットが可能な限り離れて90 °に近くする必要があります。いくつかのばらつきがあるだろうので、目が完全に球形ではないことに留意してください。 </li></ol> 4。八花弁の花のような構造になる、半分に四つの"花びら"のそれぞれをカット<ol><li> 35mmディッシュからきれいなスライドに等分アイカップを転送する。上向きにアイカップで、45 °の鉗子で、その下にスクープ。慎重に液体から持ち上げますときれいなスライド上に置きます。 </li><li>直角鉗子の両方のペアを使用して、軽く上向きに神経網膜と、目を開く。外さないでください神経網膜 - それはあなたがそれに対して動作していないので、目がその球面形状の一部を維持するのに役立ちます。また、誤って以下の手順で破損しているからRPEを保護します。 </li><li>花びらの一つがあなたの体に垂直になるまで、スライドを回転させます。 </li><li>そっと花びらの角をつかむ、あなたの15 °の鉗子を使用してください。花びらのコーナーは、ない神経網膜や網膜色素上皮角膜にする必要があります。それはその曲率を維持できるように、静かにコーナーを持ち上げます。 </li><li>花びらとスライドの間に春のはさみの底刃を挿入します。 、ストレート、シングル垂直カットが視神経乳頭に向かってcorneo -強膜の除算から作ることができるようラインアップしてはさみを。できるだけwithouとして視神経乳頭の近くにカットtはそれに切断。それがスライド上にあるできるように、花びらを手放し。 </li><li>次の花びらはあなたの体に垂直になるように、スライドに90 °回転させます。ステップ4.5を繰り返します。 </li><li>さらに2回のステップ4.5と4.6を繰​​り返します。結果として得られる構造は、8花弁の花のようになります。 </li></ol> 5。神経網膜を削除します。 <ol><li>ピペット試料上に1 × PBS 100〜200μL。これは、RPEからそれはがしするとオフ付着から神経網膜を防ぐことができます。 </li><li>通常は神経網膜が緩くRPEに添付されます。しかし、それだけで神経網膜としないRPEを削除するには、練習やスキルを取る行います。直角鉗子の他のペアで（押したまま）目の残りの部分を安定化しながらゆっくりと斜め鉗子一対の神経網膜の花びらを把握する。離れて目の残りの部分から神経網膜を引っ張る。全体の神経網膜が削除されるまでこの手順を続行します。 *ヒント：目を固定するために視神経乳頭にあなたの15 °の鉗子の先端を貼る。その後、神経網膜の下になる方向に掃引する45 °の鉗子を使用し、それを持ち上げ、。それはcorneo -強膜デバイドに向かって視神経乳頭から神経網膜を持ち上げることが最善です。アイリスの緩んでいる残骸を引き離すようにしてください。アイリスは、非常に粘着性であり、そうでなければRPEに陥ることができる。 </li><li> 1X PBSで試料を洗浄します。ピペットは100〜200検体への1X PBSμLとそれをバックアップ吸う。 PBSを捨てます。ほこりやごみを除去するために、必要に応じて手順を繰り返します。 </li></ol> 6。あなたのスライド上の試料（s）をマウントします。 <ol><li>ピペット長方形の形状で、新しいスライド上に90％グリセロールの80〜90μL。グリセロールのであって、長方形のスミアを作るために、ピペットチップの側面を使用してください。 （これは、1つのスライドに2つのRPEを取り付けるための手順です。） </li><li>試験片の下15 °の鉗子の下アームを挿入します。ゆっくりと解剖のスライドから試料を持ち上げます。 </li><li>ゆっくりとグリセロールに試料を下ろします。優しくて、試料の下からそれを引き出すように鉗子が小刻みに動く。 </li><li>他の試料のためのステップ6.1から6.3を繰り返します。 </li><li>長辺があなたの体に垂直になるようにスライドを回転させます。それがスライドに触れているように、スライドに45 °の角度であなたのカバーガラスを保持する。彼らが触れるまでグリセロールの塗抹標本に向かって移動する。カバーガラスとスライドの間の接触を維持し、ゆっくりとスライドの端に向かって、離れて汚れからカバーガラスを移動する。スライドとカバーガラスの長辺までのラインが平行になるように。親指と人​​差し指の間にカバーガラスの角を保持する。 </li><li>もう一方の手で15 °の鉗子を拾う。腕のクルックのカバーガラスの上部（無料）エッジクレードル。非常にゆっくりと、カバーガラスを下げます。連絡先はカバーガラスとグリセロールとの間で行われると、停止し、移行するグリセロールを待ちます。この下げ、RPE全体マウントが完全に覆われるまで待ってを繰り返します。これは、気泡を捕捉から高粘度のグリセロールを防ぐためです。カバーガラスを押し下げてはいけません - グリセロールは、密着性が非常に悪くなり、その下から絞り出すなります。 </li><li>透明なマニキュアと、カバーガラスとスライドが出会う周囲塗料。 </li><li>乾燥するために空のラックの上にスライドを配置。 </li></ol> 7。代表的な結果： この手順の結果は、花のように見えるとはかなり対称的でなければならない構造でなければなりません。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。黒やアグーチの動物から野生C67Bl/6Jマウス。RPEから全体のマウントRPEは、色でダークブラウンでなければならず、滑らかな表面を持つ必要があります。それは、花びらの地形の起伏に気づくのは正常です。どんなGIVE試料の色素は、RPEおよび基礎となる脈絡膜の両方の色素沈着の可変密度に起因する多少の変数があります。白い矢印は、脱色性の"チャンネル"を指している - これは正常であり、眼の基礎となる血管系によるものです。 RPEおよび基礎となる脈絡膜の両方の物理的な損傷に青い矢印を指しています。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。希薄マウスからの全マウントRPE。希薄な動物から採取した検体は、ほとんど透明からカフェオレに色の範囲で指定できますし、いずれかの標本は、ここで黒丸で示された、その中でばらつきを持っているようです。一般的には、若い動物から採取したRPEはもっと明るいし、以前の動物から採取したものは暗いです。黒い矢印は、脱色表示される、基礎となる血管系、のいくつかを示します。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。ファロイジン染色は、RPEへの物理的な損傷を検出するために使用することができます。。ファロイジン染色では明らかに上皮の六角形の形状を示す、細胞膜の概要を説明します。黒いマウスから（）の例。希薄マウスから（B）の例。 <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。希薄マウスからの悪い解剖RPE。（A）ブラケットには、および/ ​​または折り畳みを座屈引き起こす可能性が広すぎる角膜のマージンを、示している。黒い円の中には目の後ろから削除されていない余分な組織の過剰な量を見ることができます。サンプルが希薄な動物からのものであるので、彼らは特に明白です。左下の花びらは、部分的に折り返しています。 （B）これは全体のマウントは、風車の外観を持っています。黒い矢印は、作成されたカットのいくつかを示します。視神経乳頭に向かってcorneo -強膜デバイドからのカットの多くは、直径に合っていません。 （C）黒矢印はカットが接線に直径と垂直に沿って、行われている方法を示している。

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

RPEは、相同性指向修理のin vivoアッセイでは、p 国連検定のサイトです。 P 国連アッセイは、相同性指向修理の周波数の異なるDNA損傷の1,2およびDNA損傷のシグナル伝達と修復遺伝子3,4,5の効果を研究するために使用されています。このアッセイでは、RPE 1の単一セルのイベントを検出する、高感度です。また、開発6時の相同性指向修理のイベントのタイミングの違いを検出することができます。マウスの眼は、視神経7から外側に放射状に発達し、そのため、視神経乳頭からのイベントの相対距離は、それらが発生した開発の時間に相関する。 RPEはまた、網膜の発生や網膜疾患を研究する人々への関心のです。 RPE細胞を培養することができますが、その際に重要な制限事項があります。大人のRPE細胞は有糸分裂後7ですと予想in vitroでうまく増殖しな...

<table><tbody><tr><td>ストレートピンセット</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>先端: .08 x .04 mm 材質: INOX</td></tr><tr><td>45&amp;#x00B0;ピンセット</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>先端: .05 x.01 mm 材質: INOX</td></tr><tr><td>15&amp;#x00B0; &quot;アップ&quot;ピンセット</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>先端: .1 x.06 mm 材質: INOX</td></tr><tr><td>スプリング剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>複合先端幅 0.3mm 刃渡り 3mm 材質: ステンレス鋼</td></tr><tr><td>双眼解剖顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>落射照明を使用</td></tr><tr><td>ファロイジン</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

網膜色素上皮（RPE）はちょうど（ロッドとコーン）光受容体を含む神経網膜の下に、哺乳類の目の後ろに位置しています。 RPEは、密接にちょうどその上の神経網膜と色素立方細胞と関連付けますの単分子層である。この協会は、網膜疾患を研究する研究者に関心のRPEになります。 RPEはまた、相同性に向けられたDNA修復、P 国連アッセイの in vivoアッセイのサイトです。マウスの眼には、その小型サイズ（直径3.5ミリメートル程度）とその球形のために解剖することは特に困難です。この記事では詳細にRPEの全マウントをもたらす眼の解剖のための手順を示しています。この手順では、我々は目の球状構造、反対ではなく、操作する方法を示しています。簡単に言うと、結合組織、筋肉、および視神経は、眼球の後ろから削除されます。その後、角膜と水晶体が削除されます。次に、戦略的なカットが残っている組織の重要な平坦でその結果を作られています。最後に、神経網膜が優しくも、根底にある脈絡膜と強膜に接続されているそのままRPEを、明らかに、リフトオフさ。この全体のマウントは 、p 国連アッセイを実行したり、RPE組織の免疫組織化学または免疫評価のために使用することができます。

マウスの眼の解剖の正式なデモンストレーションは、網膜色素上皮の全マウントをもたらす。

網膜色素上皮（RPE）は哺乳類の眼の最背面に位置し、光受容細胞（桿体および...）を含む神経網膜の直下に存在しています。

私の名前はアリソン・クラボンです。テキサス州サンアントニオにあるUTヘルスサイエンスセンターのグリー小児がん研究センターで、アレックス・ビショップ博士の研究助手として勤務しています。本日は、網膜色素上皮の全量を回収するための齧歯類眼球の解剖方法について実演します。この組織は、網膜の発達や疾患の研究において重要であり、生体内（in vivo）での相同組換え修復（HDR）アッセイの実施部位でもあります。それでは、始めていきましょう。こちらが解剖準備が整った眼球です。まず、手技全体を通して指標として使用する解剖学的構造を確認しましょう。これは希釈された動物の眼です。こちらが眼の反対側にある視神経です。これが角膜です。角膜を通して虹彩が見えています。眼球後方の白い部分は強膜です。したがって、この領域は角膜強膜境界と呼ばれます。解剖の最初のステップは、筋肉結合組織や視神経などの不要な組織を除去することです。次に、円周状に切開して角膜を取り除きます。この時点で、レンズを押し出すことで中空の眼球カップになります。次に、角膜強膜境界から視神経乳頭に向かって4箇所の切開を行います。これにより、4枚の花弁を持つ花のような構造になります。次に、これら4枚の花弁のそれぞれを中央で切り分け、8枚の花弁を持つ花のような構造にします。この段階では、球状であるため、一部にたわみが生じることがあります。これを解消し、より平坦なホールマウントを実現するには、たわみが生じている箇所をわずかに超える程度の短い切り込みを8箇所入れることで対処できます。ワークステーションに、100 µLまたは200 µLピペットと対応するチップ、X-P-B-S-A 35 mmディッシュ、スライドガラスおよびカバーガラス、スライド作成用の90% glycerolおよび透明のマニキュア、スライド乾燥用ラック、Kim wipes、および廃棄容器を用意してください。これらの一般的な材料に加えて、専用のマイクロダイセクションツールセットが必要です。ストレートピンセットおよび45度角度付きピンセットは、解剖中の眼球の保持、回転、および全般的な操作に使用します。また、15度角度付きのピンセットは、眼球の取り扱いおよび操作に使用します。最後に、スプリングシザー（バネ付き鋏）を1本用意してください。一般的な鋏ではなく、必ずスプリングシザーを使用することが非常に重要です。また、解剖を開始する前に、背筋を伸ばして座った状態で、目が接眼レンズと同じ高さになるよう椅子の高さを調整してください。顕微鏡での前傾姿勢は肩や背中の痛みの原因となり、解剖の質を低下させます。まず、35 mmディッシュの蓋にXPBSを1滴注ぎます。次に、解剖予定の眼球をディッシュに移します。これは野生型C 57ブラックマウスの眼球です。直径約3.5 mmと非常に小さいことがわかります。強膜の不透明さにより、青みがかった色を呈しています。解剖の最初のステップは、筋肉の結合組織や視神経など、眼の周囲にある不要な組織をすべて除去することです。ここでは、左手に45度ピンセットを、右手に15度ピンセットを持っています。一方のピンセットで眼を固定し、もう一方で組織を剥がして取り除きます。大きな組織片が剥がれたときは、ピンセットをキムワイプで丁寧に拭き取ってください。その際、眼球を押しつぶしたり突き刺したりしないよう注意してください。懸濁状態でこの解剖を行う利点の一つは、眼球から離れて浮遊する結締組織を容易に確認できることです。最終的に、ピンセットで組織をこれ以上除去できなくなる点に達します。15度の角度付きピンセットをスプリング剪刀に持ち替えてください。スプリング剪刀を使用して、視神経を切り離します。ブレードの外縁を使用して、組織を角膜・強膜境界に向かって前方に押し出します。その後、トリミングを行い、キムワイプでハサミを轻轻に拭き取ります。もう一度確認しましょう。組織が盛り上がっている場合は、ハサミの外側のエッジを使用して、組織を角膜強膜境界方向へ押し出します。トリミングを行い、ハサミの鈍い方のエッジで組織の断片を前方に押し出しながら、不要な組織がすべて除去されるまでトリミングを繰り返します。通常、眼球上には2本の強靭な組織帯が存在します。1つ目は角膜強膜境界に固定されており、2つ目はトリミングされている様子が示されています。ここは角膜強膜境界と視神経乳頭のほぼ中間点にあたります。解剖の次のステップは、角膜と水晶体を除去することです。45度ピンセットを使用して、角膜のほぼ中央でフラップをかき上げます。次に、スプリングシザーを用いてフラップの基部に小さな切開を加えます。シザーの下刃を切開部から虹彩の下に挿入します。角膜強膜境界に向かって切開しますが、境界まで切り込まないようにしてください。次に、眼球を360度ゆっくりと回転させながら、周囲全体に小さな切開を加えます。ハサミを虹彩の下に維持し、角膜と虹彩を同時に切除するようにしてください。ここで示すように簡単に操作できるようになるには、多くの練習が必要です。角膜を除去した後、眼球を横に向け、眼球の外側を軽く押して水晶体を押し出します。残りの構造は、次にカップ状になります。眼球を4等分にする必要があります。そのために、眼球を横向きに置き、スプリングシザーの下側の刃を挿入します。視神経乳頭に向かって縦方向に切開しますが、乳頭まで完全に切らないようにしてください。この操作を行う際は、両腕を体の横に下げ、ハサミを体および眼の切開線に対してほぼ垂直に、体の正面に保持します。1回目の切開の真向かいに2回目の切開を入れてください。滑らかな切開ができるよう、時間をかけて位置を合わせてください。複数回切断すると切り口がギザギザになることがありますが、慎重に並べて切れば目立ちません。眼球が本来の形状を維持しているため、この球状の形態に抗うのではなく、それに沿って作業できている点に注目してください。PBSに浸した状態で保持し、以降の解剖はスライドグラス上で行います。45度角度付きピンセットで眼球をそっと支え、PBSから持ち上げてください。眼球を新しいスライドガラス上に置きます。2組の角度付きピンセットを使用し、慎重に眼球を展開します。眼球の周囲に角膜と虹彩のわずかな縁があることに注意してください。ここは操作時に保持するのに便利です。次に、4枚の花弁をそれぞれ半分に切断します。眼球を回転させ、花弁の1枚が身体に対して垂直になるようにします。15度の角度がついた鉗子で、花弁の角を把持します。わずかに持ち上げ、角膜強膜境界から視神経乳頭に向かって切開します。これらの切開線は接線に対して垂直にする必要があります。接線とは、直径に対して垂直な線のことです。したがって、切開は目の直径に合わせて行う必要があります。次に、次のペダルが身体に対して垂直になるようにスライドを回転させ、同様の手順を繰り返します。ペダルの角をつかみます。わずかに持ち上げて切断します。4つの大きな花弁すべてを半分に切断するまでこれを繰り返します。白い物質は神経網膜であり、RPEの直上に位置しています。神経網膜はRPE（網膜色素上皮）を保護できるため、すべての切開が完了するまでそのままにしておいてください。ペダルがわずかに湾曲していることに注意し、無理に矯正しようとしないでください。正確に一度で切断できるよう、時間をかけて位置を合わせます。眼球は丸いため、折れ曲がりやすい傾向にあり、これを防ぐ必要があります。8か所にショートカット（切り込み）を入れることができます。各花弁に1箇所ずつ行います。前の4箇所の切断と同じ基本戦略を用います。花弁の端を持ち上げて切断しますが、この場合は花弁の長さの約半分までだけ切断してください。すべての切断が完了したら、神経網膜を取り除くことができます。ここでは、検体に1×PBSを数滴加えています。RPEを乾燥させないようにしてください。神経網膜は、その下にあるRPEと緩く結合している必要があります。そのため、非常に簡単に剥離させることができます。ただし、通常は角膜強膜境界部では付着したままになります。眼球内部において、この部分は毛様体と呼ばれる凹凸のある隆起になっています。15度鑷子の先端を視神経乳頭に挿入して標本を固定しながら、神経網膜を剥離させることができます。毛様体は、剥離した暗い色素沈着組織である網膜色素上皮（RPE）の端を示しています。ここは虹彩であり、RPEではありません。虹彩は非常に粘着性が高く、神経網膜が剥がれやすくなっている場合や、その残骸が RPE に付着して残っている場合に、折りたたまれて RPE に張り付く可能性があるため、可能な限り多く除去することを推奨します。おそらく2つのうちのいずれかの原因で問題が生じたと考えられます。眼球の固定が不適切であった（固定時間が長すぎたか短すぎた）か、あるいは解剖前の保存期間が長すぎたかのどちらかです。ここで取り出しているペダルには、まだショートカットが適用されていません。RPEの端から約3分の1の位置にペダルがあることがわかります。これが、8つのショートカットが推奨される理由です。神経網膜をすべて除去した後、ピペットを用いてRPEを100から200 µLのPBSで数回洗浄し、すべてのゴミや破片を取り除きます。新しいスライドグラス上に、90% glycerolを80から90 µL、長方形になるように滴下します。なお、これは22×50 mmのカバーガラスに最適なグリセロール量であり、使用するサイズに応じて調整してください。他のサイズのカバーガラスを使用する場合は、ピペットチップを用いてグリセロールを広げてください。グリセロールに気泡が入らないように注意してください。もし気泡が入った場合は、端まで移動させて消してください。15度のピンセットの下アームをRPEの下に滑り込ませて慎重に持ち上げ、RPEをゆっくりとグリセロールの中へ下ろします。RPEはグリセロールの上に浮き、わずかに丸まったりねじれたりすることがあります。ピンセットを使用してRPEを伸ばし、RPEの表面にグリセロールをなじませてください。気泡が生じた場合は、カバーガラスを約45度の角度に保持し、気泡を端まで移動させて消滅させてください。カバーガラスをグリセロールの端に接触させます。次に、それをスライドの端へ移動させます。カバーガラスの下端を親指と人差し指で保持し、反対側の端を15度ピンセットで支えます。接触した直後、カバーガラスを非常にゆっくりとスライドに向けて下ろします。RPEがある位置で降下を止め、グリセロールが広がるようにします。その後、カバーガラスをゆっくりとさらに下げてください。カバーガラスを下げる速度が速すぎると、スライド内に気泡が混入してしまいます。ここでは、カバーガラスをゆっくりとRPEに接触させ、グリセロールが広がるようにしながら下げていきます。カバーガラスを素早く離すと、気泡が混入するのがわかります。透明なマニキュアをたっぷりと使い、カバーガラスの端をスライドガラスに固定します。外周全体を隙間なく接合してください。これはC 57ブラックマウスの典型的な網膜色素上皮（RPE）です。ここに示されているように、下層の血管が見えるのは正常です。また、色素が薄いように見えるパッチ状の部分など、色素沈着に多少のばらつきが見られるのも正常です。しかし、このような明確なスポットは、RPEおよびその下層にある脈絡膜への物理的な損傷に起因する可能性が高いと考えられます。目の脈絡膜もまた色素を有しているため、脈絡膜が健全なままであれば、黒色のRPEへの損傷が気づかれない可能性があります。これは希釈マウスの典型的なRPEです。示されているように、血管が見え、色の濃い部分や薄い部分など、色素沈着に多少のばらつきがあります。しかし、希釈RPEで損傷を確認することはほぼ不可能です。これらの小さな斑点は損傷なのか、それとも正常な色素沈着の変動なのか。この疑問を解決するために、固定と染色の実施を推奨します。これにより、サンプルの取り扱いが粗すぎないかを確認できるはずです。この染色は細胞膜を明確に描き出すため、損傷部位が明白になりますが、実際にはRPE（網膜色素上皮）はかなり弾力性があり、角膜を持って眼球を扱う限り、損傷を与える可能性は低いです。ここに多くの問題があるホールマウント標本がありますが、その中でも最も軽微なのは、ここに示されている角膜の余白が広すぎることです。これにより、波打った組織がたわんだり折れたりすることがあります。また、眼球の背面に大量の外来組織が残っているのが確認できます。このペダルは部分的に折りたたまれており、ここではRPEが部分的に裂けているのがわかります。もう一つの問題は、この眼がピンホイールのような外観を呈していることです。ここに切開の角度を書き込みました。しかしながら、本来あるべき状態はこの通りです。切断は接線に対して垂直に、かつ直径に沿って行う必要があることを覚えておいてください。以上で、網膜色素のホールマウント標本を作成するためのマウス眼球の解剖方法についての実演を終わります。上皮細胞の操作において、最も重要なことは正しい姿勢を維持することですが、同時にリラックスして行うようにしてください。このビデオがお役に立ち、今後の実験がすべてうまくいくことを願っております。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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