Name: Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a identificar janelas temporais críticas na cardiogênese usando células-tronco embrionárias de camundongo. Este ensaio padronizado quantifica a eficiência de diferenciação cardíaca através de corpos embrionários em placas de 96 poços.

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Este trabalho foi financiado pela Veterans Affairs e subvenções NIH 5U01HL100398 e 1R01HL104040.

1. Corpo formação embrionária (EB), utilizando fundo 96-redonda bem placas de microtitulação <ol><li> Cultivar células TE de camundongos em placas de 10 centímetros de cultura de células com o mouse médio de células ES suplementado com LIF. </li><li> Quando as células ES estão prontos para uso (geralmente na confluência 50-70%), remova a mídia ES e lavar as células uma vez com 5ml de PBS estéril. </li><li> Adicionar 2 ml de tripsina 0,05% / EDTA para cada placa e incubar as placas a 37 ° C por 3 ~ 5 minutos, Quench tripsina EDTA com 3 ml de mídia ES. </li><li> Transferência de células para tubos falcon de 50ml e giram a 1000 rpm por 3 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender pellet celular com uma quantidade desejada de EB mídia. </li><li> Conte o número de células e diluir as células a 5 x10 3 células / ml no EB mídia. </li><li> Use pipeta multicanal para adicionar 100μl de EB mídia contendo células em cada poço de 96 - round placas de microtitulação. </li><li> Lugar 96 - rodada placas de microtitulação bem em uma incubadora. </li></ol> 2. Identificação de janelas de tempo crítico da via de sinalização chave (s) para cardiogenesis <ol><li> Adicionar moduladores de vias de sinalização específica e de controle do veículo em cada poço de placas de microtitulação de 96 poços contendo células-tronco embrionárias em momentos diversos, tais como o dia 0, dia 1, dia 2, dia 3 e dia 4, etc Metade dos poços em cada 96 bem-placa (48 poços) são usados ​​para cada ponto de hora de início do tratamento. </li><li> Lavar a moduladores mudando media EB para cada 48 poços em diferentes pontos de tempo de parada. Por exemplo, para obter dois dias de tratamento para as células ES a partir de dia 0, lavar a moduladores no dia 2. Para qualquer tratamento mais de 48 horas, a mudança de mídia EB suplementado com moduladores fresco a cada dois dias até que os pontos de tempo desejado parar. </li><li> Examine contração EB sob um microscópio após o dia 7. Pontuação dos poços com a contratação EBs como positivos para obter porcentagens de contratação para cada EBs cursos tempo diferente de tratamento. </li><li> Os pontos momento crítico para cardiogenesis ES são os prazos em que continha o maior percentual de contratação EBs tratados por moduladores de sinalização quando comparado com o controle do veículo. </li></ol> 3. Verificação de janelas de tempo de sinalização para cardiogenesis em EBs feita a partir de gotas de suspensão <ol><li> Prepare placas de Petri, adicionando com 3-4 ml de PBS para evitar a evaporação. </li><li> Siga os passos 1,1 ~ 1,5 para preparar células-tronco embrionárias em 2.5x10 4 células / ml densidade celular final. </li><li> Despeje a mistura de células bacterianas em prato de fácil acesso. Usando pipeta multicanal, adicione 20 gotas mL (contendo cerca de 500 células) para tampas invertidas. Não permita que as gotas individuais ao toque. Geralmente uma tampa pode caber até 80 gotas. Vire a tampa para trás sobre o prato contendo PBS. Incubar por 24 horas ou 48 horas para permitir a formação EB em uma incubadora. </li><li> Lavar EB formado a partir de gotas de suspensão de cada tampa com 3 ml de mídia e piscina EB 2 tampas de EBs a nova placa de Petri. Adicionar mídia EB para um volume total de 10ml. </li><li> Transferência EBs em suspensão para 0,2% de gelatina revestido de 6 placas bem no dia 4. Em geral 30 EBs são transferidos para cada poço. Adicionar mídia EB para obter o volume de 2 ml final para cada poço. </li><li> Incubar moduladores de sinalização no período de tempo identificados a partir de 96 poços experimentos prato. </li><li> Observe a contração EB sob microscópio após o dia 7 e cardiogenesis pode ser ainda caracterizada por RT-PCR de positividade, e outros, se necessário. </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de gota em suspensão tem sido o método convencional usado para a formação de EB e na diferenciação in vitro. No entanto, é trabalhoso e limita a flexibilidade experimental, devido a preocupações logísticas. Da mesma forma, os resultados são também mais difíceis de validar como a habilidade do pesquisador é crucial para a formação de EB bem sucedido e manipulação como gotas de suspensão. Um método mais simples é formar EBs em uma placa de fundo redondo de 96 poços como um processo de etapa única. Este formato permite a diferenciação in vitro a ser padronizada e pode acomodar mais condições experimentais, devido à facilidade de formação de EB e manipulação downstream (por exemplo, adição ou remoção modulador). Além disso, o formato de 96 poços da placa pode ser otimizado para ser uma ferramenta de triagem eficiente nas células ES mouse.

<ul><li> Rato CGR8 células são usados ​​principalmente. </li><li> ES médio: media GMEM suplementado com 10% inativado pelo calor FBS, 2 mM L-glutamina, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, e 200 U / ml murino LIF. </li><li> EB médio: Prepare media IMDM com 20% inativado pelo calor FBS, 1,6 mM L-glutamina, 0,08 mM 2-mercaptoetanol, e 1X MEM não-solução de aminoácidos essenciais. </li></ul>

modificado embrionárias de camundongos com células-tronco ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Diferenciação das células-tronco pluripotentes é rigidamente controlado por regulação temporal e espacial de várias vias de sinalização chave. Um dos obstáculos à sua compreensão tem sido os métodos variados em correlacionar as alterações dos principais eventos de sinalização para a eficiência diferenciação. Descrevemos aqui o uso de um tronco embrionárias de rato ensaio de células (ES), com base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. Marcando para a contratação de corpos embrionárias (EBs) em um formato de placa de 96 poços, podemos rapidamente quantificar a eficiência cardiogênico e identificar janelas de tempo crucial para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP em um curso de tempo seguintes tratamentos modulador específico. O principal descrito aqui não se limita a indução cardíaca por si só, e pode ser aplicado para o estudo de muitas outras linhagens celulares. Além disso, o formato de 96 poços tem o potencial de ser desenvolvido como um alto throughput, ensaio automatizado para permitir o teste de hipóteses mais sofisticado experimental.

Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.

Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

A diferenciação de células-tronco pluripotentes é rigorosamente controlada pela regulação temporal e espacial de múltiplas vias de sinalização fundamentais. Um dos obstáculos...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar a regulação temporal crucial necessária para a diferenciação de cardiomiócitos em células-tronco embrionárias de camundongo. Isso é alcançado primeiramente pela formação de corpos embrionários em uma placa de fundo redondo com 96 poços, a fim de padronizar a formação de EBs como segundo passo. Moduladores proteicos ou químicos são adicionados aos EBs ao longo de um período de tempo predeterminado, o que permitirá o controle temporal das vias em estudo.Em seguida, os EBS contráteis são quantificados manualmente para determinar a eficiência de indução de diversos esquemas de modulação de sinal. São obtidos resultados que mostram os requisitos temporais de vias de sinalização essenciais para a diferenciação de cardiomiócitos, com base na porcentagem de EBS contráteis formados e na confirmação utilizando o método de gota suspensa. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como as gotas suspensas, é que ela padroniza e simplifica um procedimento intensivo em mão de obra e permite uma leitura direta para quantificação.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia de células-tronco, como identificar a coagulação sinalizadora essencial que orienta a diferenciação para o tipo celular desejado. Para iniciar este procedimento, cultive células-tronco embrionárias de camundongo em placas de cultura celular de 10 centímetros com meio para células-tronco de camundongo suplementado com fator inibidor de leucemia. Quando as células ES estiverem com 50 a 70% de confluência, estarão prontas para uso.Remova o meio ES e lave as células uma vez com cinco mililitros de PBS estéril. Adicione dois mililitros de tripsina 0,05% EDTA a cada placa e incube as placas a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, interrompa a ação da tripsina com EDTA adicionando três mililitros de meio ES por placa e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros.Centrifugue a 1000 rotações por minuto durante três minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular com a quantidade desejada de meio EB. Conte o número de células e, em seguida, dilua as células até cinco vezes 10 elevado a três células por mililitro.No meio EB, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de meio EB contendo células em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo redondo. O número de placas de 96 poços necessário dependerá do número de condições e pontos temporais do experimento. Coloque as placas de microtitulação de 96 poços com fundo redondo em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para identificar janelas temporais críticas de vias de sinalização-chave para a cardiogênese.Moduladores de vias de sinalização específicas são adicionados às células ES. Nas placas de 96 poços com fundo redondo, adicione o modulador de sinalização, que é diluído no meio, em cada poço em diversos pontos temporais. Metade dos poços em cada placa de 96 poços é utilizada para cada ponto temporal inicial do tratamento.Um controle com veículo é adicionado às outras 48 poças para cada ponto temporal. Em diferentes momentos de parada, vamos remover os moduladores de sinalização de cada poça trocando o meio de cultura, e deve-se ter grande cuidado ao fazer isso para evitar perturbar os corpos embrionários em diferentes pontos temporais de parada. Remova os moduladores trocando o meio dos corpos embrionários para as poças. Incline a placa de 96 poças em aproximadamente 10 graus e remova suavemente o meio da poça com uma pipeta multicanal.Em seguida, adicione novamente o meio EB sem modulador a cada poço para qualquer tratamento com duração superior a 48 horas. Troque o meio EB suplementado com moduladores frescos a cada dois dias até o tempo desejado de término. Sete dias após a indução dos EBS, transfira as células ES para placas de 96 poços e examine a contração dos EBs sob microscópio.Marque como positivos os poços com EBS contráteis para obter as porcentagens de EBS contráteis para cada curso temporal de tratamento diferente. As janelas temporais de sinalização para a cardiogênese identificadas nos experimentos com placas de 96 poços podem ser verificadas em EBS formados a partir de gotículas suspensas, para produzir gotículas de EB pendulares. Primeiro, prepare as placas de Petri adicionando três a quatro mililitros de PBS para prevenir posterior desvio das gotículas.Em seguida, uma suspensão de células ES preparada com densidade final de 2,5 vezes 10 à quarta células por mililitro é despejada em uma placa bacteriológica para fácil acesso. Usando uma pipeta multicanal, adicione gotas de 20 microlitros de células ES nas tampas invertidas das placas de Petri. Não permita que as gotas individuais entrem em contato umas com as outras.Normalmente, uma tampa pode acomodar até 80 gotas. Em seguida, vire a tampa novamente sobre a placa de Petri contendo PBS e incube por 48 horas em um incubador com 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a formação de EBs. Após 48 horas, lave os EBs formados a partir das gotas suspensas de cada tampa com três mililitros de meio para EB.Puxe duas tampas de EBS para um novo recipiente de Petri. Incube o recipiente de Petri por quatro dias em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. No quarto dia, transfira os EBS em suspensão para placas de seis poços revestidas com gelatina a 0,2% em geral. Trinta EBS são transferidos para cada poço; incube com moduladores de sinalização no período determinado a partir dos experimentos em placa de 96 poços, sete dias após a formação das gotas suspensas.Observe o EBS ao microscópio para verificar a contração dos EBs. Células ES cultivadas nos poços de fundo redondo de uma placa de 96 poços formarão EBS, conforme mostrado nesta imagem representativa de um EB formado no quarto dia. Os pontos temporais críticos para a cardiogênese de ES são as janelas temporais que contêm a maior porcentagem de EBS contráteis tratados com moduladores de sinalização, quando comparados ao controle com veículo. Aqui é mostrado um foco espontaneamente contrátil de cardiomiócitos formado a partir de células ES tratadas com morfina dorsal no décimo dia de diferenciação em uma placa de microtitulação de 96 poços.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar de forma eficiente a regulação temporal crítica e as janelas temporais das principais vias de sinalização na cardio gênese de células-tronco embrionárias.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Aqui nós apresentamos um protocolo para a formação de uma população celular usando estímulos elétricos e mecânicos, emulando a fisiologia cardíaca. Esta estimulação eletromecânica aumenta o potencial de cardiomyogenic das células tratadas e é uma estratégia promissora para mais terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.

Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

A combinação de poração a laser e matrizes de microeletrodos (MEA) permite registros semelhantes ao potencial de ação de cardiomiócitos primários cultivados e derivados de células-tronco. A forma de onda fornece uma visão superior do modo de ação dos compostos de teste do que as gravações padrão. Ele vincula patch-clamp e leitura de MEA para otimizar ainda mais a pesquisa de segurança cardiovascular no futuro.

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Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

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Aprenda a identificar janelas temporais críticas na cardiogênese usando células-tronco embrionárias de camundongo. Este ensaio padronizado quantifica a eficiência de diferenciação cardíaca através de corpos embrionários em placas de 96 poços.

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