制备和使用艾滋病毒感染主的CD4 + T细胞作为靶细胞，自然杀伤细胞的细胞毒性检测

该程序的总体目标是评估 NK 细胞对 HIV 1 感染细胞的细胞毒性反应。这是通过首先从静脉血中分离和感染 CD 4 阳性 T 细胞来实现的。然后从同一供体中分离出自然杀伤细胞。

接下来，将未感染的 CD、四个阳性 T 细胞从受感染的细胞中分离出来。最后，在两种测定之一中，感染细胞和 NK 细胞分别用作靶标和效应子，以评估 NK 细胞的细胞毒性。最终，可以获得的结果表明，NK 细胞可以通过上调 CD 1 0 7 来响应 HIV V one 感染的细胞，这种表达是通过流式细胞术分析确定的，或者是通过 γ 计数器检测到的铬 51 释放。

这种方法可以回答 HIV one 领域的关键问题，例如 NK 细胞对 HIV V one 感染的细胞有反应。哪些受体配体相互作用在 NK T 细胞相互作用中很重要 HIV one 病毒蛋白是否调节 NK 细胞对 H 的反应 HIV V one 感染细胞 刺激 从人外周血中分离并受到抗 CD 3、抗 CD 28 偶联珠子刺激的 CD 四个阳性 T 细胞 72 小时。通过血细胞仪计数所得的 T 细胞群，然后将培养物分成两组，大约是 10 的两倍，将 6 个 T 细胞分成 15 毫升锥形管，用作未感染的对照组，并将 CD 4 阳性 T 细胞悬液的剩余部分放入感染组的 50 毫升锥形管中。

将两组在 300 G 下在 22 摄氏度下离心 10 分钟，然后吸出 snat Resus。将 50 毫升试管中的 CD 四个阳性 T 细胞直接悬浮在含有病毒的培养液中，并添加多脑至终浓度为 10 毫克/毫升。然后在 20 至 25 摄氏度下以 1200 倍 G 离心感染细胞 2 小时。

在这里，细胞以 5 的倍数被 DHIV 3 感染。旋转感染完成后，去除上清液，并以每毫升 10 倍至 6 的密度重悬感染细胞。在 RPMI 中，补充每毫升 100 单位 IL 2。

然后将未感染的细胞和新感染的细胞在 6 孔板中培养 72 小时。如果使用复制无能病毒感染细胞，或者如果使用复制无能病毒，则持续 5 到 7 天，收集含有受感染 CD 的 4 个阳性 T 细胞培养物的上浆，并在 22 摄氏度下以 300 G 离心细胞 10 分钟，休息吸出上浆和 Reese。将沉淀悬浮在含有 2% FBS 和 2 毫摩尔 EDTA 的 2 毫升 PBS 中，并使用 CD 4 阳性阳性分离试剂盒在血细胞仪上对细胞进行计数。

取出 CD，四个阳性未感染的 T 细胞。按照制造商的说明分离 CD 四个阳性 T 细胞，但每个细胞使用 A 1 抗 CD 4 B。然后使用死细胞去除试剂盒从含有死细胞群的纯化病毒中去除死细胞。

根据制造商的说明，收集活的 T 细胞群，并将纯化的细胞以 300 G 离心 10 分钟。打开中断后，取出 snat resus，悬浮颗粒。在一毫升 RPMI 中，完成细胞并计数：外周血 NK 细胞首先从 CD 的同一供体中分离出四个阳性 T 细胞。

培养过夜后，用血细胞计数器对 NK 细胞进行计数，以 300 G 离心 10 分钟，打开休息开关，然后复苏，将细胞悬浮在 RPMI 中，完成，将最终浓度调整为 10 至 6 个细胞/毫升。接下来，收集纯化、感染和对照未感染的 T 细胞悬液，以 300 G 离心 10 分钟。打断后，去除 SANE 并重悬沉淀。

在 RPMI 中，以 2 倍 10 至 6 个细胞每毫升完成，阳性对照约为 2 倍 10 至 6 个 NK 裂解易感。本视频中使用 K 5 62 细胞，将 K 5 62 细胞以 300 G 离心 10 分钟，然后取出 snat 并重悬沉淀。在 RPMI 中，以每毫升 10 至 6 个细胞的两倍完成。

洗涤所有细胞群并按其实验浓度重悬后，将 NK 细胞与 K 5 62 细胞、未感染的 T 细胞或 HIV 感染的 T 细胞放在一起。在 96 孔 V 底板的单个孔中，每种靶细胞类型仅使用一个重复来测量非特异性 NK 细胞脱颗粒。仅将 100 μL 的 NK 效应细胞和 100 μL 的培养基加入一个中。

加入荧光染料偶联的抗 CD 1 0 7 A，将抗体以 10 μL 的体积溶入每个孔中，并以 20 G 离心板 2 分钟，在 22 °C 下休息。然后在孵育后将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 4 小时。将板以 400 G 离心 5 分钟，在 22 摄氏度下休息，然后使用装有 P 200 吸头的 2 毫升吸液管取出 SANE。

接下来，向每个孔中加入 100 μL 流式缓冲液，然后在冰上用抗 CD 3 14 20 Pacific blue 抗体和抗 CD 56 A PC 抗体对细胞染色 20 分钟。细胞染色后，向每个孔中加入 200 μL 流式缓冲液，并以 400 G 离心板 5 分钟。在 22 摄氏度时打开中断，小心地从每个孔中吸出流式缓冲液。

使用装有 200 微升微量移液器吸头的 2 毫升吸液管，确保不干扰沉淀，再次洗涤细胞，然后复苏，将沉淀悬浮在 200 微升 1% 多聚甲醛的无钙和无镁 PBS 中。最后，将细胞悬液转移到流管中，并通过向每个流管中添加大约 100 微升的 1% 多聚醛的无钙和无镁 PBS 溶液，使管中的总体积达到 300 微升。然后使用事实 diva 软件通过流式细胞术读取 10 到第四个 NK 细胞事件的两次，并使用 FlowJo 软件标记纯化的 HIV V 1 个感染和未感染的 T 细胞靶标，每 10 个微居里 51 个盐水中的铬到 6 个细胞中，在 37 摄氏度下放置两个小时，在 15 毫升锥形管中加入 5% 二氧化碳作为阳性对照， 还用 100 微居里铬 51 标记 6 个细胞的 10 到 6 个细胞中 2 小时。

在相同的培养条件下。使用 RPMI complete 使每个细胞群的染色溶液的最终体积达到 500 μL。在标记目标细胞时，使用 PerkinElmer 网站上的通用放射性衰变计算器计算添加到目标细胞中的铬 51 的体积。

从培养物中取出先前分离的 NK 细胞并计数，将 NK 细胞以 300 G 离心 10 分钟，然后重新悬浮在 RPMI 中，将所得细胞悬液完全分成三个 15 mL 锥形管。将细胞密度调整为第一管 10 倍/毫升/毫升 5 倍/毫升，第二管细胞密度调整为 2.5 倍 10 倍/毫升五倍/毫升，将细胞密度调整为每毫升 10 倍/毫升 5 倍/毫升。在第三管中，NK 细胞将分别以 1 比 1、2.5 比 1 和 5 比 1 的比例用作效应细胞铬 51 释放测定。

从培养箱中取出现在标记的靶细胞，并向每个试管中加入 4.5 ml RPMI complete。将试管以 300 G 离心 10 分钟。然后小心地将上清液倒入放射性废液容器中，不要干扰沉淀。

再洗涤目标细胞两次，以去除所有未吸收的铬 51。第三次洗涤的上清液可以丢弃在非放射性液体废物的容器中。现在，在 RPMI 中重悬靶标，使其最终细胞密度为每毫升 10 到 5 倍，显示为铬 51 释放测定的典型设置示例。

请注意，每组一式三份，将 100 微升标记的目标分装到 96 V 底孔板的每个指示孔中，最终细胞数为每孔 10 至第四个目标细胞。接下来，以适当指示的效应靶细胞比例向靶细胞中加入 100 微升 NK 悬浮液。然后将 100 微升靶标添加到相应的孔中，其中最大和自发释放组不存在效应细胞。

自发释放组补充另外 100 μL RPMI 完全，以 20 G 离心板 2 分钟，休息后，然后将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 4 小时。孵育 4 小时后，向接受最大释放孔的每个孔中加入 5 微升 1 比 10 稀释的人红细胞在 RPMI 完全液中，然后向最大释放孔中加入 100 微升 10% ESAL 硫酸钠，并以 400 G 离心板 5 分钟。为了对细胞进行上颚，为每个实验孔和对照孔标记一个 γ 计数器管。

在 96 孔板上，从每个孔中收获 100 微升无细胞 super name，并将每个孔中的 super name 放入预水平管中。在珀金埃尔默 24 70 自动伽马计数器中测量每根试管中铬 51 的含量。以下散点图显示了用于分析 CD 1 0 7 结果的典型流式细胞术门控策略。

脱颗粒测定。首先对单个细胞进行设门，不包括 FSCA 与 FSCH 图上的团块或双合体。接下来，绘制为 FSCA 与 SSC 的单细胞门在淋巴细胞群上设门，再次由粉红色的 coval 表示。

然后将淋巴细胞门绘制为 CD 3 14 20 与 CD 56 阳性和 CD 3 14 20 阴性群体上的 CD 56 门控，如垂直粉红色椭圆所示。这里将 NK GA 绘制为 CD 1 0 7 A 与 CD 56 的关系，以可视化以下两个图中脱粒的 NK 细胞，评估自然杀伤细胞对 HIV 1 感染细胞的细胞毒反应的代表性结果如下所示。通过表达表面 CD 的 NK 细胞的百分比评估 NK 细胞在没有靶标的情况下脱颗粒的能力以及对 K 5 62 细胞、原代 CD 4 阳性 T 细胞和 HIV 感染的原代 T 细胞的反应，每个象限中的数字代表该图中总 NK 细胞的百分比。

评价 NK 细胞对 K 5 62 细胞、未感染的 CD 4 个阳性 T 细胞和 HIV 1 感染的 T 细胞在肩峰 51 释放试验中的作用能力，效应细胞靶细胞比例为 2.5 比 1、5 比 1 和 7.5 比 1 发育后。这项技术为 HIV V one 生物学领域的研究人员铺平了道路，以探索自然杀伤细胞如何对 HIV 感染患者的 HIV one 感染细胞做出反应。