Name: 使用荧光免疫化学检测爱德华ictaluri（一毛虫）样品 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 学习使用间接免疫组织化学和荧光显微镜技术在斑点叉尾鮰组织中定位爱德华氏菌的方法。该技术通过单克隆抗体标记细菌，帮助研究人员原位观察病原体分布，为水产养殖疾病管理提供重要工具。

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作者希望感谢 Michelle Banes 提供的技术支持，以及 Petrie-Hanson 博士、Eels 博士和 Timothy Brown 在免疫组织化学方法的建立和实施过程中给予的帮助。本项目由美国农业部 CRIS 项目（编号：MISV-0801310）和密西西比州立大学兽医学院资助。

1. 细菌攻击
<ol>
<li>在30°C条件下，于脑心浸液肉汤中振荡培养细菌过夜。</li>
<li>停止鱼缸中的水循环，并按1:100的比例加入肉汤（例如，每升水加入10 ml）。</li>
<li>孵育一小时后，重新启动鱼缸中的水循环，以冲洗掉残留的细菌。</li>
</ol>
2. 取样
<ol>
<li>采样时间点和器官取决于研究目的，但在本研究中，我们采用以下感染后时间点进行采样：1、6、16、24、36、48、60、72、96、110、125 和 175 小时。</li>
<li>在每个时间点，通过将六尾鱼浸入含有 MS222 的水中实施安乐死，并采集以下器官（所选器官基于对该感染过程的已有认知）：鳃、沿侧线的后部肌肉、肠道、脾脏、肝脏、胃、心脏、头肾和躯干肾。</li>
<li>采样后，立即将器官装入组织学包埋盒中，并在1%甲醛溶液中浸泡固定两小时。</li>
<li>经过两小时固定后，将包埋盒从甲醛转移至50%乙醇中，保存至包埋前。</li>
<li>使用 Sakura Tek Tissue-Tek VIP 3000 组织处理机（Sakura Tek, Torrance, California）对器官进行石蜡包埋过夜处理，并使用 Leica RM2255 切片机（Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois）切片至5μm厚度。</li>
</ol>
3. 脱蜡切片
<ol>
<li>将切片浸入盛有Clear-Rite的染色缸中，约5分钟，以使所有石蜡完全溶解。取出支架，沥去多余的石蜡溶剂。</li>
<li>将切片浸入第二个盛有Clear-Rite的容器中，持续5分钟。使用数次后，更换第一个容器中的溶剂，并在第一个和第二个容器之间交替使用。</li>
<li>将切片浸入100%酒精中，以去除石蜡溶剂。</li>
<li>将切片浸入第二个盛有100%酒精的染色缸中。</li>
<li>将切片浸入盛有70%酒精的染色缸中。</li>
<li>将切片浸入流动的自来水，以彻底去除所有酒精残留。</li>
</ol>
4. 缓冲液的配制
<ol>
<li>通过将 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4 和 0.2 g KH2PO4 溶解于 1 升蒸馏水中，并调节 pH 至 7.4，制备磷酸盐缓冲液。</li>
<li>通过将 900 ml PBS 加入 100 ml 蒸馏水中，将 PBS 稀释至 0.9X。</li>
<li>在 50 ml 0.9X PBS 中加入 2 ml 小鼠血清、200 μl Triton-X 100 和 500 μl BSA，制备封闭血清。</li>
<li>通过将 2.1 g NaHCO3 和 4 g NaCl 溶解于 500 ml 蒸馏 H2O 中，并滴定至 pH 8.2，制备 50 mM 碳酸氢盐缓冲液。</li> 
</ol>
5. 免疫组织化学
<ol>
<li>将切片浸入0.9X PBS中进行复水。</li>
<li>将载玻片在封闭血清中孵育30分钟。</li>
<li>在避光湿盒中，室温下用Ed9（以封闭血清按1:100稀释）孵育切片2小时。</li>
<li>用PBS漂洗切片4次，每次10分钟。</li>
<li>在避光湿盒中，室温下加入50 μl二抗（山羊抗小鼠FitC标记抗体；用封闭血清按1:500稀释），孵育2小时。</li>
<li>用碳酸氢盐缓冲盐水漂洗切片3次。</li>
<li>用去离子水短暂漂洗切片。</li>
</ol>
6. 封片
<ol>
<li>将载玻片置于黑暗处干燥数分钟。</li>
<li>使用Permafluor进行封片。</li>
<li>将封片介质置于阴凉避光环境中干燥，最好过夜。</li>
</ol>
7. 显微镜
<ol>
<li>组织切片已准备好在荧光显微镜下观察。在本实验中，我们使用了配备三色（FitC；MCA Texas-Red）滤光片的 Olympus BX51 显微镜，并使用了 Picture Frame 软件（MicroFire, Goleta, California）。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
由于鱼类组织的自发荧光很强，这些组织在三色滤光片下会呈现橙色，从而为细菌提供了一个方便的背景。
在此背景下，经FitC染色的单个细菌将呈现为明亮的绿色点状，且在200倍放大下可辨认其杆状形态（图1）。
切片不良可能导致假阳性结果（源于清洗步骤中的问题），此时会观察到大量细菌均匀地出现在载玻片上。
<img src="/files/ftp_upload/2687/2687fig1.jpg" alt="显微镜下的肌纤维结构，10 µm 比例尺，用于分析的标记点 a 和 b。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 显示两个E. ictaluri（箭头 a 和 b）的肌肉切片显微图像（200倍）。
<img src="/files/ftp_upload/2687/2687fig2.jpg" alt="鱼类组织学示意图：荧光显微镜、抗体染色、细菌攻击、组织切片。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2.实验整体方案

<ol><li>Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlumb%2C+JA+%22Fish+Diseases+and+Disorders%22">Fish Diseases and Disorders</a>. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).</li>
<li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+RJ+%22Fish+Pathology%22">Fish Pathology</a>. , third ed, WB Saunders. (2001).</li>
<li>Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).</li>
<li>Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+35S-Labeled+Edwardsiella+ictaluri+into+Channel+Catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aquatic+Animal+Health%22%5BJournal%5D)">Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish.</a> Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).</li>
<li>Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+bioluminescent+Edwardsiella+ictaluri+for+noninvasive+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring.</a> FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Edwardsiella+ictaluri+in+channel+catfish%2C+Ictalurus+punctatus+%28Rafinesque%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque).</a> Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).</li>
<li>Areechon, N., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+in+Channel+Catfish%2C+Ictalurus+punctatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+World+Mariculture+Society%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus.</a> Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).</li>
<li>Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri.</a> Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).</li>
<li>Thune, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signature-Tagged+Mutagenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+Identifies+Virulence-Related+Genes%2C+Including+a+Salmonella+Pathogenicity+Island+2+Class+of+Type+III+Secretion+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).</li>
<li>Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bioluminescence+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).</li>
<li>Hook, E. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHook%2C+EW+%22Principles+and+Practices+of+Infectious+Diseases%22">Principles and Practices of Infectious Diseases</a>. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).</li>
<li>Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+monoclonal+antibodies+in+the+indirect+fluorescent+antibody+technique+%28IFA%29+for+the+diagnosis+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri.</a> Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案详细描述了一种技术，用于 原位 鲶鱼病原体的可视化 Edwardsiella ictaluri 在组织学切片中。据我们所知，这是首次描述的此类方案。
根据我们的经验，最关键的步骤是按照本方案第4.4步所述对抗体进行充分洗涤，因为洗涤不充分可能导致假阳性结果。
解释该技术结果的主要问题在于组织的自发荧光。然而，研究发现使用三通道滤光片基本解决了这一问题，因为绝大多数非特异性荧光出现在绿色荧光光谱范围之外。此外，尽管该技术具有较高的灵敏度，但仍可能无法检测到较低的细菌载量。

<table><tbody><tr><td>脑浸液肉汤</td><td>BD Biosciences</td><td>237200</td><td></td></tr><tr><td>MS222</td><td>Argent Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>全鼠血清</td><td>Cappel</td><td>55989</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠FitC</td><td>SouthernBiotech</td><td>1010-04</td><td></td></tr><tr><td>Permafluor</td><td>Lab Vision</td><td>Ta-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9625</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr></tbody></table>

使用荧光免疫化学法检测 edwardsiella ictaluri 在斑点叉尾鮰（channel catfish）中i. punctatus样本

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

尽管 Edwardsiella ictaluri 是斑点叉尾鮰的主要病原体 Ictalurus punctatus 近三十年前被发现 1,2据这些作者所知，迄今为止尚未开发出任何方法以实现 原位 组织切片中细菌的可视化
尽管先前的研究已通过平板计数法3、放射性标记法4或生物发光细菌5在体内确定了细菌的定位，但这些研究大多仅在整体器官水平上进行，仅有一项例外6。这一局限性尤为值得关注，因为E. ictaluri具有复杂的感染周期1,7，并拥有多种毒力因子8,9。E. ictaluri与其宿主之间的复杂相互作用在许多方面类似于伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）10，二者同属一个分类学科。
本文介绍一种利用单克隆抗体Ed9通过间接免疫组织化学法检测细菌的技术，该抗体由Ainsworth et al.11描述。
简而言之，将封闭血清作用于石蜡包埋的组织切片，以防止非特异性结合。随后，切片与一抗孵育：E. ictaluri 特异性单克隆抗体 Ed9。洗去多余的一抗后，加入 FITC 标记的二抗。再次洗涤后，切片使用荧光专用封片介质封片。 
这使得能够在斑点叉尾鮰组织的组织学切片中原位检测到E. ictaluri。

本文描述了一种利用间接免疫组织化学方法对斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）组织切片中的原位Edwardsiella ictaluri进行标记的实验流程，其中以单克隆抗体Ed9作为一抗，荧光素FitC标记的抗体作为二抗。该方法可通过荧光显微镜检测该细菌的存在。

使用荧光免疫化学法检测 Edwardsiella ictaluri 在斑点叉尾鮰（channel catfish）中I. punctatus样本

虽然爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）是斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的主要病原体，并且近三十年前已被发现1,2，但迄今为止，尚无……

本实验的总体目标是对爱德华氏菌（Edward Cella ilu）进行标记，并利用显微镜在鲶鱼组织切片中对其进行原位观察。该目标首先通过用细菌感染鱼类来实现，随后取其器官进行取样，经石蜡包埋、切片及脱蜡处理。随后，使用一抗和二抗对细菌进行标记。最后，通过显微镜观察进行可视化。最终，可获得显示细菌在组织中存在及分布情况的免疫荧光显微镜结果。大家好，我叫Simon Manto，今天我们所要介绍的技术是在我的博士论文中开发的。与定量PCR或生物发光等方法相比，该技术的主要优势在于能够原位观察器官内的细菌，研究其定位以及与宿主细胞的相互作用。为了用细菌感染鲶鱼，首先在BHI肉汤中于30°C过夜培养爱德华氏菌（Edward Cella TLU）。接下来，停止鱼缸中的水循环，并加入浓度为百分之一的细菌培养液。让水静置孵育一小时，然后重新启动循环以冲洗掉残余的细菌。采样时间点和待采集的器官取决于研究目的以及对所分析的特定感染过程的已知信息。本研究中，我们从以下各个时间点的六条鱼中采集了指定的器官。器官取出后，立即放入组织学包埋盒中的1%甲醛溶液中固定两小时。随后将样品转移至50%乙醇中保存，直至进行后续处理。将器官包埋于石蜡中并进行切片，然后脱蜡。切片后的样本放入盛有二甲苯的染色缸中，浸泡约五分钟，使石蜡溶解；取出切片架，沥去多余的石蜡溶剂。随后将切片浸入第二个盛有二甲苯的容器中，继续浸泡五分钟。接着，将切片浸入纯乙醇中两次。为去除石蜡溶剂，将切片转移至70%乙醇中。最后，在进行免疫组织化学染色前，用自来水冲洗以彻底去除乙醇残留。根据本方案的书面部分配制以下缓冲液和溶液：0.9 × 磷酸盐缓冲液封闭血清和50 ER 碳酸盐缓冲液。接着，将切片浸入0.9 × PBS中10至15分钟以进行复水。将切片在封闭血清中孵育30分钟。然后在室温下，于避光湿盒中用EIC特异性的ED九抗原一抗孵育2小时。用PBS冲洗切片4次，每次10分钟。然后在室温下于避光湿盒中孵育切片，加入50 µL二抗，孵育2小时。用碳酸氢盐缓冲盐水冲洗切片3次。最后用去离子水短暂冲洗，以进行封片。在避光条件下干燥数分钟，然后使用封片剂（如 PermaFluor）进行封片。将封片剂置于阴凉、避光环境中过夜干燥。最后，在荧光显微镜下观察切片。我们使用配备三色滤光片的奥林巴斯BX 51显微镜，因为鱼类组织的自发荧光很强，在三色滤光片下这些组织会呈现橙色，从而为细菌提供便利的背景对比。经Fitsy染色的单个细菌将显示为明亮的绿色小点，在200倍镜下可辨认出其杆状形态。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何利用间接免疫化学方法对脑干中的核团进行标记。一旦熟练掌握，该技术可在五到六小时内完成，具体时间取决于需要标记的切片数量。然而，其中许多步骤涉及较长的孵育时间，因此您实际上可以同时进行其他工作。与此同时。

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