使用荧光免疫化学检测爱德华ictaluri（一毛虫）样品

1。细菌的挑战

1. 细菌在一夜之间成长为30 ° C摇脑心浸液肉汤。
2. 停止在鱼缸水的循环和添加肉汤100 1浓度（每升10毫升，例如）。
3. 一小时后孵化，在坦克重新启动的循环水，其余的细菌冲洗出来。

2。采样

1. 采样时间和器官取决于研究的目的，但在我们的研究中，我们使用以下采样点：1，6，16，24，36，48，60，72，96，110，125和175小时后感染。
2. 在每一个时间点，安乐死六个鱼浸泡在水含MS222和样品（采样机关的选择是对什么是已知的感染过程中的）以下机关：鳃，沿侧线，肠，脾后的肌肉，肝，胃，心，头肾和躯干肾。
3. 采样后，立即组织学磁带加载机关和两个小时在1％福尔马林浸泡。
4. 固定两个小时后，从福尔马林50％的乙醇，在那里，直到嵌入保持磁带转移。
5. 石蜡嵌入机关通宵使用纸巾- Tek的贵宾3000组织的处理器（樱花TEK，托兰斯，加利福尼亚州）和部分在5μm的，使用了Leica RM2255 microtone（徕卡显微系统，班诺克本，伊利诺斯州）。

3。切片脱蜡

1. 沉浸在明确的仪式，让所有的蜡溶解约5分钟，一个充满染色槽部分。电梯机架和排出多余的蜡溶剂。
2. 沉浸在一个明确的仪式5分钟，第二个容器的部分。经过几次的使用，取代溶剂之间的第一和第二的容器中的第一个容器和备用。
3. 沉浸在100％的酒精部分，除去蜡溶剂。
4. 沉浸在第二个100％的酒精槽部分。
5. 浸入70％的酒精槽部分。
6. 沉浸在运行的自来水，消除酒精的所有痕迹的章节。

4。缓冲液的制备

1. 准备磷酸盐缓冲生理盐水溶解到1公升的蒸馏水和pH值8.0 g氯化钠，氯化钾0.2克，1.15克钠₂ HPO ₄和0.2克的_KH 2 _PO 4至7.4 。
2. PBS稀释到0.9倍，加入900毫升的PBS到100毫升的蒸馏水。
3. 准备阻止加入2毫升小鼠血清的血清200μLTRITON - X 100和500μLBSA的50毫升的0.9倍PBS。
4. 准备50 mM的碳酸氢盐缓冲液是由溶解在500毫升蒸馏水H _{2 O} 2.1克碳酸氢钠₃和4 g氯化钠和滴定，pH值8.2准备。

5。 Immunhistochemistry

1. 补充水分在0.9倍PBS浸泡的部分。
2. 孵育30分钟，在阻断血清的幻灯片。
3. 孵育Ed9（100阻断血清稀释1）在一个不透明的湿盒内室温两小时的部分。
4. 冲洗部分PBS中4次，每次10分钟。
5. 在一个不透明的湿盒内室温孵育50μL二次抗体（羊抗鼠FITC标记的抗体，阻止血清稀释500倍）在两小时的部分。
6. 冲洗部分缓冲液中的碳酸氢盐的3倍。
7. 在去离子水冲洗部分简要。

6。安装

1. 离开幻灯片，在黑暗中干燥几分钟。
2. 安装使用permafluor。
3. 安装介质来过夜，在黑暗阴凉的环境中，干燥，优先许可。

7。显微镜

1. 组织切片观察，荧光显微镜下。在我们的实验中，我们使用奥林巴斯BX51显微镜配备了三重（FITC; MCA得克萨斯红）过滤器。相框软件（MicroFire，Goleta，加利福尼亚州）。

8。代表性的成果：

由于鱼组织的自体荧光是如此之高，这些组织会出现下脐橙的三滤，方便地提供了一个细菌的背景。

在此背景下，个体FITC染色细菌会出现明亮的绿色圆点，在200X棒状将识别（图1）。

坏的部分，可以构成假阳性（由于在冲洗阶段的问题），在这种情况下，会出现大量的细菌统一目前在幻灯片上。

图1一块肌肉的显微照片显示两个五部分。 ictaluri（箭头A和B）（200X）。

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图2实验的总体方案 。