Name: C57BL/6J小鼠乳腺间质细胞和癌细胞的移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 学习使用C57BL/6J小鼠乳腺间质细胞和癌细胞进行正位移植的方法，以研究肿瘤形成过程中的基质-上皮相互作用。该技术为乳腺肿瘤生物学研究提供了可靠的实验模型。

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本项目由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助，资助编号为 R00 CA127357，以及堪萨斯大学癌症中心捐赠基金支持。

1. 从小鼠 C57BL/6J 中分离与提取供体胶原蛋白
<ol>
 <li>采用经 IACUC 批准的方法处死成年正常的雌性 C57BL/6J 小鼠。</li>
 <li>取下尾部并浸入 70% 乙醇中 45 分钟以消毒组织。用纸巾将尾部擦干，用铝箔包裹，并于 -20°C 保存备用。</li>
 <li>将尾部置于无菌环境（如超净工作台）中。使用剪刀在尾根处切开皮肤并从尾部剥离。切除尾部两端各 0.5 至 1 cm 的部分，将剩余尾部分成三到四段。用解剖刀或剃刀片从尾部分离肌腱，并将肌腱进一步分离为单根纤维。</li>
 <li>将肌腱纤维转移至无菌容器中，用无菌蒸馏水清洗。将 5–7 只小鼠尾部的肌腱转移至一个含有 35 ml 无菌去离子水的 50 ml 锥形管中，其中加入 50 单位/ml 青霉素、50 μg/ml 链霉素、250 ng/ml 两性霉素 B，以及由冰醋酸（17 N）原液稀释而成的 0.034 N 醋酸。置于 4°C 摇床上震荡一周以提取胶原蛋白。</li>
 <li>在台式离心机中以 3000 g 离心 15 分钟，沉淀残渣。将上清液（约 30 ml）转移至两个适配 Beckman 50.2 Ti 转子的聚碳酸酯离心管中，于 35,000 g（约 17,000 rpm）离心 1 小时。</li>
 <li>需浓缩上清液以达到 1–2 mg/ml 的浓度。将上清液转移至超滤单元（Ultracel 50 k Amicon），在台式离心机中于 4°C 以 3000 rpm 离心 15 分钟。将滤液转移至无菌锥形管中保存。重复离心步骤，直至体积浓缩至 5–6 ml。</li>
 <li>测定蛋白浓度。我们采用标准 Bradford 法（Biorad），以 BSA 标准品（Biorad）和未稀释样品进行检测。取部分滤液作为阴性对照进行测定。</li>
 <li>通过 6% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（10 个泳道，胶厚 1.5 mm）进一步检测提取物的纯度。在 1.5 ml 离心管中，将 20 μg 样品与 30 μl 1× SDS-PAGE 上样缓冲液混合，缓冲液含 63 mM Tris HCl、10% 甘油、2% SDS 和 0.0025% 溴酚蓝。同时，以鼠尾 I 型胶原蛋白制备等量蛋白作为阳性对照。此外，配制一组 BSA 标准品（2.5、5、10、20 μg），用 PBS 和 1× 上样缓冲液稀释。将所有样品于 95°C 煮沸 5 分钟。</li>
 <li>让样品冷却后，短暂离心（最大转速 10 秒）以收集冷凝液。</li>
 <li>将样品连同分子量标记物一同上样。例如，加入 5 μl Kaleidoscope Biorad 蛋白标准品。以 150 伏电压电泳约 1 小时，直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
 <li>取出凝胶并用考马斯亮蓝染色液染色。染色液配制方法：将 2 g 考马斯亮蓝、75 ml 冰醋酸、500 ml 乙醇溶于去离子水中，定容至 1000 ml。同时按相同配方但不加考马斯亮蓝配制脱色液。加入足量染色液覆盖凝胶，并置于摇床上。</li>
 <li>室温轻柔摇动染色 1 小时，倾去染色液。当脱色液变深蓝色时更换新液。脱色过夜或直至凝胶上条带清晰分离。观察两条胶原蛋白条带（分子量分别为 90 kDa 和 130 kDa），并与标准品及对照组比较条带强度。必要时使用凝胶成像系统记录图像。</li>
</ol>
2. 从小鼠正常组织和PyVmT C57BL/6J小鼠中分离和培养供体乳腺癌细胞及成纤维细胞
<ol>
 <li>在10周龄后，当PyVmT转基因小鼠中肿瘤明显且可触及时，采用经IACUC批准的方法处死年龄匹配的雌性正常小鼠或PyVmT转基因小鼠。</li>
 <li>将小鼠仰卧置于平坦表面，并使用胶带固定四肢。</li>
 <li>在胸腺和腹股沟乳腺乳头之间做倒T形切口，向后拉开皮瓣以暴露乳腺组织。取出乳腺组织，并用手术剪将其剪成小块。</li>
 <li>配制100 ml酶消化液，包含：200 mg胰蛋白酶、500 mg胶原酶、4 mg DNA酶、100,000单位透明质酸酶，溶于含抗生素的无菌PBS中，先在冰上孵育过夜，随后在37°C孵育3小时。</li>
 <li>向每个样品中加入含10%胎牛血清（FBS）的PBS 10 ml，在台式离心机中以1500 rpm、4°C离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
 <li>小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于5–7 ml PBS/10% FBS中。重复离心和洗涤两次。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于10 ml DMEM培养基中，培养基含10% FBS、50 单位/ml青霉素、50 μg/ml链霉素和250 ng/ml两性霉素B，并接种至I型胶原包被的10 cm培养皿中。胶原包被方法：取1 ml储存液（1.5 mg/ml）加入39 ml用无菌蒸馏水或PBS稀释的0.02 N乙酸中，混匀。每10 cm培养皿加入5 ml胶原工作液，室温孵育至少10分钟。吸除多余胶原液，未使用的培养皿用Parafilm密封后于4°C保存一周。</li>
 <li>每周更换培养基2–3次。组织消化成功的表现为出现被梭形成纤维细胞包围的上皮细胞灶。</li>
 <li>通过选择性胰蛋白酶消化分离成纤维细胞和上皮细胞。吸除培养基，用PBS洗涤细胞一次。加入1 ml 0.25%胰蛋白酶/0.54 mM EDTA，室温孵育。成纤维细胞比上皮细胞贴附更松散。2分钟后在显微镜下观察成纤维细胞脱落情况；此时成纤维细胞应呈悬浮或变圆状态，而上皮细胞灶仍贴附于培养皿表面。</li>
 <li>轻轻敲击培养皿使成纤维细胞松动，再缓慢加入含血清的培养基10 ml，吹打收集成纤维细胞。</li>
 <li>将含有成纤维细胞的培养基转移至15 ml锥形管中，按步骤5）所述条件离心。将细胞重新接种至胶原包被的10 cm培养皿中，并重复选择性胰蛋白酶消化过程，直至成纤维细胞与上皮细胞完全分离。</li>
 <li>通过免疫荧光染色检测细胞纯度，上皮细胞标志物如CK14和CK18，成纤维细胞标志物如α-平滑肌肌动蛋白（α-sma）。</li>
</ol>
3. 培养细胞的免疫荧光染色
<ol>
 <li>将玻璃盖玻片放入6 cm培养皿中，在超净工作台中通过紫外线照射5至10分钟进行灭菌。</li>
 <li>在室温（RT）下，用1-2 ml工作浓度的胶原蛋白溶液覆盖盖玻片，孵育10分钟。吸除多余液体。</li>
 <li>胰酶消化后，每份样品接种200,000个上皮细胞或成纤维细胞。加入3-5 ml完全培养基，于37°C孵育24小时。</li> 
 <li>吸除培养基，用PBS洗涤细胞，随后在-20°C的冰甲醇中固定7分钟。</li>
 <li>用PBS洗涤细胞两次以去除乙醇，并在室温下用含1% FBS的PBS溶液封闭1小时，封闭液体积为1-2 ml。</li>
 <li>使用镊子将盖玻片取出，放置于一个大而浅的容器中，容器表面覆盖Parafilm或其他疏水性材料。</li> 
 <li>用封闭液将以下一抗按1:100稀释：抗平滑肌肌动蛋白抗体（α-sma）、抗CK14抗体（基底上皮标志物）、抗CK18抗体（腔面上皮标志物）。</li>
 <li>在室温下，直接将100 μl抗体溶液滴加至盖玻片上，孵育1小时。另设一份细胞盖玻片仅加入封闭液作为空白对照，用于后续二抗对照实验。</li>
 <li>吸除一抗，直接向盖玻片上滴加1 ml PBS进行洗涤。吸除液体后重复洗涤3-5次。</li>
 <li>在封闭液中稀释以下二抗：抗小鼠Alexa 488抗体按1:100稀释，抗小鼠生物素化抗体按1:500稀释，抗小鼠Alexa 568抗体。</li> 
 <li>用铝箔包裹装有盖玻片的容器。直接向各盖玻片滴加100 μl相应的二抗：α-sma样品使用抗小鼠Alexa 568，CK14染色样品使用抗小鼠生物素化抗体，CK18染色样品使用抗小鼠Alexa 488。盖好容器以避免样品暴露于可见光下。</li>
 <li>吸除二抗，并参照步骤9）用PBS洗涤。除CK14染色样品外，其余样品均保留在PBS中。</li> 
 <li>将Alexa 568标记的链霉亲和素按1:500比例溶于PBS中。将CK14染色的样品在室温避光条件下与链霉亲和素-Alexa 568孵育30分钟。随后参照步骤9）用PBS洗涤。</li>
 <li>将DAPI按1:500比例溶于PBS中。吸除样品中的PBS，加入DAPI溶液，在室温避光条件下孵育10分钟。</li> 
 <li>用PBS冲洗样品。在载玻片上滴加100 μl Prolong抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片细胞面朝下覆盖在载玻片上。倾斜盖玻片使其一角先接触封片剂，缓慢放下以避免产生气泡。</li>
 <li>使用免疫荧光显微镜观察样品。样品应避光保存，以保护免疫荧光信号，信号可稳定维持约2周。</li> 
</ol>
4. 准备用于移植的胶原包埋细胞
<ol>
 <li>为了将细胞包埋于胶原蛋白中，需降低胶原蛋白的pH值，以通过加入凝固液实现聚合。通过将100 ml 10倍浓度Earl's平衡盐溶液（EBSS）与2.45 g NaHCO₃、7.5 ml 1 M NaOH及42.5 ml无菌蒸馏水混合，制备凝固液。使用连接至无菌瓶的瓶顶式0.22微米滤器进一步灭菌。</li>
 <li>将胶原蛋白（储存浓度为1 mg/ml）与凝固液按初始4:1比例混合。每构建一个移植物，取100 μl胶原蛋白与25 μl凝固液于一个Eppendorf管中混合。短暂涡旋或反复吹打混匀样本。</li> 
 <li>以5–10 μl为增量，逐次加入胶原蛋白或凝固液，并充分混合，直至混合液中的酚红染料变为浅粉色至橙色，表明pH已接近中性。黄色提示酸性pH，深粉色则提示碱性pH。将混合液置于冰上，防止提前聚合。</li> 
 <li>通过胰蛋白酶消化法从培养板中分离成纤维细胞和上皮细胞。首先吸除培养基，并用5 ml PBS洗涤。每块培养板加入1 ml含0.25%胰蛋白酶/0.54 mM EDTA的HBSS溶液。成纤维细胞在室温下孵育2–5分钟，上皮细胞在37°C下孵育2–6分钟。轻敲培养板使细胞脱落，并在显微镜下观察细胞是否脱离。通过向培养板中加入9 ml完全培养基终止胰酶消化反应，并将细胞转移至无菌15 ml锥形离心管中。</li> 
 <li>取50 μl细胞悬液，用血细胞计数板计数细胞。记录每管细胞的总体积（约10 ml）。</li>
 <li>在室温下以1500 rpm离心5分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，将细胞重悬于完全培养基中，浓度调整为100,000个细胞/100 μl。例如，将500,000个细胞重悬于500 μl完全培养基中。</li>
 <li>在另一离心管中混合250,000个基质细胞（250 μl）与100,000个肿瘤细胞（100 μl）。微型离心机1000 rpm离心10秒，用移液器吸除上清液。向细胞沉淀中加入50 μl已调节好的胶原蛋白溶液。反复吹打使细胞均匀分散。将50 μl细胞-胶原混合液滴加至无菌6 cm组织培养皿中，形成圆形液滴。将移植物在37°C孵育10分钟，使其聚合。</li>
 <li>将培养皿倾斜一定角度，沿一侧缓慢加入5 ml完全培养基，轻柔覆盖移植物。轻轻倾斜培养皿，使培养基均匀覆盖移植物表面。</li>
 <li>在37°C孵育24小时。随后立即进行移植。</li>
</ol>
5. 在 C57BL/6J 小鼠中进行胶原包埋细胞的正位移植
<ol>
 <li>制作移植手术用的细玻璃棒。使用本生灯加热玻璃巴斯德移液管，用镊子将其一端拉伸至直径2–3 mm。冷却后，用70%乙醇灭菌。</li>
 <li>通过高压灭菌和70%乙醇对以下手术器械进行灭菌：精细手术剪、钝头手术剪、钝头镊、细镊、伤口夹、伤口缝合钉</li>
 <li>使用异氟烷回收装置，以2-3%异氟烷麻醉小鼠。平均O2 通过鼻罩使用的流速为1 L/分钟。</li>
 <li>将小鼠仰卧位固定，用胶带或其他可移除的粘合剂固定四肢。使用化学脱毛剂（如Nair）去除毛发。用棉签以由外向内旋转的方式交替擦拭70%乙醇和碘伏，对腹部进行消毒。</li>
 <li>用一只手用钝头镊子夹住乳腺部位的皮肤。另一只手用钝头手术剪，在腹股沟乳腺的第9和第10乳头之间或第4和第5乳头之间做一个倒T形切口，以暴露乳腺。</li>
 <li>在淋巴结或乳腺动脉下方用小型外科弹簧剪做一个袋状切口。</li>
 <li>用镊子从培养皿中取出胶原移植物，用无菌擦拭纸轻轻蘸去多余液体，再用细玻璃棒将胶原移植物完全推入囊袋内。</li>
 <li>使用2号肠线可吸收缝线或皮肤钉合器缝合皮瓣。</li>
 <li>让小鼠在笼中恢复。</li>
 <li>每周至少对小鼠进行两次监测，通过触诊检查肿瘤。当肿瘤直径达到1 cm时，处死小鼠。采集组织用于分析。 </li>
</ol>

6. 代表性结果：
从小鼠C57BL/6J中分离和提取胶原蛋白
这些步骤改编自文献1。从5-7条小鼠尾部提取胶原蛋白，最终体积为6 ml时，蛋白浓度约为1-1.5 mg/ml，总蛋白量为6-9 mg。通过考马斯亮蓝染色，在上样自小鼠尾部提取样品的泳道中检测到约90 kDa和130 kDa的条带，分别表明存在I型胶原蛋白和前胶原蛋白（图1）。
从正常及 PyVmT C57BL/6J 小鼠中分离并培养乳腺癌细胞和成纤维细胞。
实验步骤改编自文献2。PyVmT 癌细胞与成纤维细胞可通过细胞形态的差异以及特定上皮和间充质标志物的表达进行区分。PyVmT 癌细胞呈铺路石样形态，共同表达腔面上皮标志物 CK18 和基底上皮标志物 CK14，但不表达 α-sma（图 2）。乳腺成纤维细胞体积较大，呈纺锤形表型，高表达 α-sma，但不表达 CK14 或 CK18（图 2）。这些结果表明，采用所述实验步骤所获得的成纤维细胞和上皮细胞纯度均超过 95%。
在 C57BL/6J 小鼠中进行胶原蛋白包埋细胞的正位移植
这些方案改编自3, 4当任一实验组的肿瘤直径达到1.0 cm或约60天时，处死细胞移植受体小鼠。单独移植PyVmT细胞在30–40天后即可形成可触及的肿瘤，60天时平均肿瘤质量为0.335克；而将PyVmT癌细胞与乳腺成纤维细胞共同移植，则在60天时平均肿瘤质量达到0.630克，表明成纤维细胞促进了肿瘤生长（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig1.jpg" alt="SDS-PAGE 凝胶电泳结果，显示 BSA 蛋白浓度分析，范围为 5–20 µg。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 小鼠尾部 I 型胶原提取物的考马斯亮蓝染色分析。 BSA（约 66 kDa）由箭头指示。商品化大鼠尾胶原（20 μg 蛋白）和纯化的小鼠尾胶原（20 μg 蛋白）由方框标出（分别为约 130 kDa 和约 90 kDa 的蛋白）。Std = 分子量标准。
<img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig2.jpg" alt="免疫荧光图比较上皮细胞与成纤维细胞中的CK14、CK18、α-sma。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 供体PyVmT乳腺癌细胞与成纤维细胞的免疫荧光染色。 图a和图b为PyVmT乳腺癌细胞经CK14和CK18抗体免疫染色的结果。图c为成纤维细胞经α-sma抗体染色的结果。图像显示DAPI叠加，放大倍数为20倍。
<img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig3.jpg" alt="柱状图比较平均肿瘤质量（g）并带误差线；Pmt 单独处理组与 Pmt+NAF 联合处理组的结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3. C57BL/6J 小鼠在有或无成纤维细胞存在条件下的乳腺肿瘤发育情况。 从小鼠体内分离移植了 PyVmT 癌细胞并在有或无乳腺成纤维细胞存在条件下生长的乳腺肿瘤，并进行称重。数据表示为均值±标准误。每组 n=6。

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<li>Guzman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracarotid+injection+of+fluorescence+activated+cell-sorted+CD49d-positive+neural+stem+cells+improves+targeted+cell+delivery+and+behavior+after+stroke+in+a+mouse+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model.</a> Stroke. 39, 1300-1306 (2008).</li>
<li>Duda, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+transplantability+of+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differential transplantability of tumor-associated stromal cells.</a> Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).</li>
</ol>

动物实验：
动物实验严格按照堪萨斯大学医学中心IACUC委员会制定的指南和规定进行。

通过移植模型已证实成纤维细胞在肿瘤进展中的功能作用，其中将癌相关成纤维细胞与良性乳腺上皮细胞共同移植可导致肿瘤生长和侵袭性增强5。传统的移植方法通常使用SCID或裸鼠，将来自不同遗传背景小鼠或不同物种的间质细胞和上皮细胞进行共移植。免疫缺陷小鼠缺乏功能性T细胞，而T细胞在通过识别肿瘤特异性抗原并进而靶向清除肿瘤细胞、抑制转移扩散方面发挥关键作用6。此外，近期研究表明，成纤维细胞在调控免疫细胞募集过程中具有重要作用7, 8，这表明有必要开发新的研究方法，以更清晰地理解乳腺肿瘤进展过程中间质细胞与上皮细胞相互作用的机制。本文所述实验流程展示了一种可靠的方法：分离并培养乳腺上皮细胞和间充质细胞，并将其原位移植到免疫功能健全的小鼠体内以形成乳腺肿瘤。采用所述方法，我们已在不同实验组和不同终点条件下成功移植超过40只小鼠，移植成功率超过97%，证明了该系统的可靠性。本系统中乳腺成纤维细胞对肿瘤生长的影响与先前报道的将成纤维细胞与乳腺癌细胞共同移植至肾包膜下的研究结果一致9。在本报告中，我们对该系统存在的问题关注较少。若最终胶原原液浓度过低而无法用于包埋细胞，可...

<table><tbody><tr><td>C57BL/6N 小鼠</td><td>Harlan Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyVmT 转基因小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002374</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3039603PR</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR international</td><td>10000113873</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-30-001</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2645-20</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 超滤离心管，Ultracel 50k</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905008</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TI 转子专用离心管</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB 40236</td><td></td></tr><tr><td>10x EBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1X，0.25%，含 HBSS（无钙、无镁）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP101 25</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ml</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidoscope 蛋白标准品</td><td>Bio-Rad</td><td>1610375</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545-78</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR international</td><td>101400-042</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白抗体 S-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-7558</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#945;-平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td></td></tr><tr><td>CK14 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-53253</td><td></td></tr><tr><td>CK18 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠二抗</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA9200</td><td>由 Fisher 分销</td></tr><tr><td>抗小鼠 Alexa-568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Alexa-488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-Alexa-488</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Prolong 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P-36930</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>91400-12</td><td></td></tr><tr><td>精细弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>#5 精细镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>肠线铬制缝合线</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9326254</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042-815</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406P 4</td><td></td></tr><tr><td>碘伏</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹</td><td>Fisher Scientific</td><td>12032-07</td><td></td></tr><tr><td>伤口缝合钉</td><td>Fisher Scientific</td><td>12031-07</td><td></td></tr></tbody></table>

c57bl/6j小鼠乳腺基质细胞与癌细胞移植

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

基质细胞（包括成纤维细胞）对乳腺肿瘤进展的影响已通过小鼠模型得到充分记录，尤其是通过将基质细胞与上皮细胞移植到小鼠乳腺中的方法。目前的移植模型通常需要使用免疫缺陷小鼠，以应对基质细胞与上皮细胞之间不同的遗传背景。为了维持两种不同细胞类型之间稳定的细胞间相互作用，常使用细胞外基质进行包埋，但这类基质通常包含Matrigel或大鼠尾胶原，二者均为具有免疫原性的基质材料。由于免疫缺陷小鼠缺乏功能性T细胞，因而无法准确评估基质细胞对乳腺肿瘤进展的影响。 体内，对药物研发和疗效具有重要意义。此外，免疫缺陷小鼠成本高、繁殖困难，且需要特殊的饲养条件。为克服这些障碍，我们建立了一种将基质细胞与上皮细胞原位移植到同种遗传背景小鼠体内的方法，以诱导稳定成瘤。该体系包括从供体C57BL/6J小鼠中获取正常乳腺成纤维细胞、癌相关成纤维细胞、PyVmT乳腺癌细胞以及胶原蛋白。将上述细胞嵌入胶原基质后，移植至雌性C57BL/6J小鼠的腹股沟乳腺腺体中。单独移植PyVmT细胞后30至40天即可形成可触及的肿瘤。移植60天终点分析显示，与单独移植PyVmT细胞相比，联合成纤维细胞共移植可促进乳腺肿瘤的生长。尽管本研究使用了来自C57BL/6J小鼠的细胞与基质材料，但该细胞与基质的分离方法及移植策略可适用于不同遗传背景的小鼠，体现出良好的通用性。综上所述，该体系可用于研究基质细胞与上皮细胞之间的分子相互作用，并克服了免疫缺陷小鼠模型中的关键局限性。

在本报告中，我们展示了一种从小鼠乳腺中分离和培养供体细胞的系统，并将这些细胞原位移植到受体小鼠体内，以分析乳腺肿瘤发生过程中间质与上皮之间的相互作用。

C57BL/6J小鼠乳腺基质细胞与癌细胞移植

基质细胞（包括成纤维细胞）对乳腺肿瘤进展的影响已通过小鼠模型得到充分证实，特别是……

本实验的总体目标是移植MA间质细胞和上皮细胞，以研究移植后间质-上皮相互作用对肿瘤形成的影响。首先取C57黑六小鼠的尾部组织并提取供体胶原，接着从正常和/或M-M-T-V-P-Y-V-M-T转基因小鼠中分离并培养供体成纤维细胞和上皮细胞。然后将这些细胞嵌入胶原中，并在C57黑六背景上接种于组织培养板中，形成圆形凝胶栓。最后，将包埋在胶原中的细胞移植到受体小鼠腹股沟记忆腺的脂肪垫中。与现有的方法（例如条件性基因敲除小鼠的构建或移植至免疫缺陷小鼠）相比，该系统具有多项优势。其中一项优势是该系统相对容易建立。另一个优点是，受体小鼠具有完整的免疫系统，使研究人员能够分析在乳腺肿瘤进展过程中特定分子以及间质与上皮相互作用的功能。演示这些技术的是我实验室的研究助理 Diana Lambert。使用经 IACUC 批准的方法处死五至七只成熟的正常雌性 C57BL/6 小鼠后，取其尾部并浸泡于 70% 乙醇中 45 分钟以进行消毒。用纸巾将尾部擦干，用铝箔纸包裹，并在-20摄氏度下保存备用。在超净工作台中，先用剪刀剪去尾尖，然后在尾根处切开皮肤，并将其从尾部剥离。从尾部两端各去除 0.5 至 1 厘米，并将剩余尾部切成三到四段。解剖尾部的肌腱并分离成单根纤维。使用解剖刀或剃刀刀片，将纤维放入小型韦伯船中。接下来，将肌腱纤维转移至无菌容器中，并用无菌蒸馏水洗涤。然后吸除大部分液体。将含有纤维的剩余水分倒入移液船中，再将其转移至含有35毫升冰醋酸的50毫升锥形管中。用含青霉素、链霉素和两性霉素的无菌去离子水按1:500稀释。将混合物置于4°C摇床上孵育一周以提取胶原蛋白。在4°C条件下，以3000 ×g 离心15分钟，使用台式离心机沉淀残渣。将上清液转移至两个适用于 Beckman 50.2 TI 转子的聚碳酸酯管中，在 35,000 G 和 4 °C 条件下离心一小时，将上清液浓缩至每毫升含 1 至 2 毫克蛋白。然后将其转移至超滤离心单元（Amicon Ultra Cell 50 K）中，在 4 °C、3000 转/分钟条件下离心 15 分钟。重复离心操作，直至体积减少至 5 至 6 毫升。将滤液转移至无菌的锥形管中，并在4°C下保存。使用标准Bradford法检测蛋白质浓度。提取物的纯度也可通过6% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样本来检测，以分离供体记忆细胞和成纤维细胞进行后续处理。选用年龄匹配的10周龄雌性正常小鼠或P-Y-V-M-T转基因小鼠，其肿瘤已明显且可触及。采用经IACUC批准的方法，在胸腺和腹股沟乳腺的乳头之间做倒T形切口，将皮肤向后拉平以暴露乳腺组织。取出乳腺组织，用刀片或手术剪将其剪成小块。配制100毫升酶消化液混合物。详细操作步骤请参见书面方案。将组织在冰上与混合液孵育过夜，随后在37°C下孵育三小时。每个样本中加入5 mL含10%胎牛血清的PBS，于

mammary-transplantation-stromal-cells-carcinoma-cells-c57bl6j

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科研

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医学

C57BL/6J小鼠乳腺间质细胞和癌细胞的移植

本文展示了 DeOme KB 等（1959 年）建立的方法以及 Brill B 等（2008...

乳腺上皮移植操作步骤

本文讨论了通过将乳腺癌细胞注射到雌性小鼠的乳腺脂肪垫中来建立乳腺癌模型的方法。示例方案展示了原位注射的操作过程。...

乳腺脂肪垫原位注射：建立小鼠乳腺癌模型

该视频展示了在小鼠模型中进行乳腺癌原位接种的技术。与皮下注射或非手术注射相比，该技术具有更高的成瘤率，且肿瘤大小和形态的变异性更小。...

原位注射：将组织特异性癌细胞植入成年小鼠

通过腺病毒-Cre激活乳腺导管系统中的潜伏突变，可导致具有临床相关性的转移性乳腺癌。引入YFP启动子可实现对远端转移性肿瘤细胞的追踪。该模型可用于研究潜伏性转移、抗肿瘤免疫反应，以及设计治疗乳腺癌的新型免疫疗法。...

通过腺病毒-Cre靶向导管上皮启动转移性乳腺癌：一种新型的乳腺癌转基因小鼠模型

癌症是一种复杂的疾病，其发展受到肿瘤周围组织以及局部促炎和抗炎介质的影响。因此，与皮下注射模型相比，原位注射模型可能更适用于研究癌症进展，以更好地模拟人类疾病的病理过程。...

将乳腺癌细胞正位注射至小鼠乳腺脂肪垫以研究肿瘤生长

目前尚缺乏用于评估靶向乳腺癌转移的辅助治疗的临床前模型。为解决这一问题，我们建立了一种de...

De Novo 乳腺癌转移的临床前小鼠模型的外科手术操作与方法学

我们介绍了一种利用生物发光技术量化肿瘤负荷的小鼠原位乳腺癌模型和根治性乳房切除术模型，以模拟人类乳腺癌的进展过程。...

建立小鼠原位转移性乳腺癌模型及实施小鼠根治性乳房切除术

本文介绍一种简单、微创且易于操作的方法，将乳腺癌细胞植入小鼠乳腺脂肪垫中。该小鼠原位乳腺癌模型具有适当的乳腺脂肪垫微环境，可用于研究癌症的多个方面。...

将乳腺癌细胞原位注射至小鼠乳腺脂肪垫

本研究提出了一种先进的方案，通过检测绿色荧光蛋白和生物发光信号，并结合定量分子检测技术，精确评估肿瘤负荷。...

利用原位乳腺癌模型研究三阴性乳腺癌

本文介绍了一种移植方法，可将供体大鼠乳腺上皮细胞移植至受体动物的肩胛间白色脂肪垫中。该方法可用于研究宿主和/或供体对乳腺上皮发育的影响，且无需预先清除内源细胞，从而扩展了该技术的应用范围。...

大鼠乳腺上皮细胞移植至肩胛间白色脂肪垫

源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。...

原位移植乳腺肿瘤作为乳腺癌的临床前模型

学习使用C57BL/6J小鼠乳腺间质细胞和癌细胞进行正位移植的方法，以研究肿瘤形成过程中的基质-上皮相互作用。该技术为乳腺肿瘤生物学研究提供了可靠的实验模型。

C57BL/6J小鼠乳腺基质细胞与癌细胞移植

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