Name: Assépticas Técnicas de Laboratório: transferências de volume com pipetas sorológicas e micropipetas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprenda técnicas assépticas de laboratório para transferências de volume usando pipetas sorológicas e micropipetas. Este método demonstra como minimizar contaminação e garantir precisão em experimentos microbiológicos.

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Agradecimentos especiais a Cori Sanders em projetos da IROC para a preparação de ilustrações e Kris Reddi na UCLA para a criação de culturas de amostras para as figuras. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

<ol><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. (1998).</li>
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<li>Disinfectant - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant">http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant</a> (2012).</li>
</ol>

Não tenho nada para revelar.

A técnica asséptica refere-se a um conjunto de procedimentos de rotina feito para prevenir soluções estéreis e culturas de ser contaminado por microorganismos indesejados no laboratório. Tais técnicas são essenciais para as experiências que requerem células em crescimento. Embora um ambiente de trabalho que é completamente estéril não pode ser alcançado, os procedimentos, tais como desinfecção de superfícies de laboratório, criando um campo esterilizado usando um bico de Bunsen, limitando a exposição de culturas não niveladas e meios de comunicação para o ar, esterilizando materiais, tais como frascos, tubos e pipetas de vidro, e evitar o contato de instrumentos esterilizados com os não-estéreis superfícies reduz a possibilidade de contaminação de soluções e culturas em um experimento. O objetivo é que esses procedimentos de precaução para se tornar uma segunda natureza, o que vem com treino e prática, enquanto trabalhava em um laboratório. Transferências de volume com soluções estéreis e culturas, usando instrumentos como pipetas sorológicas e microfoneropipettors são um de muitos tipos de técnicas de rotina feitas em laboratório. Diferentes aplicações experimentais chamar de instrumentos capazes de transferir volumes distintos, mas precisos e exatos. Pipetas serológicos são utilizados em laboratórios de microbiologia para preparar culturas de células que requerem meios preparações envolvem volumes mililitros, enquanto micropipetas são essenciais para as experiências de biologia molecular que necessitam apenas quantidades microlitros de soluções. Quando uma técnica asséptica é praticado com estes instrumentos, a contaminação é minimizado durante as transferências de volume independentemente da quantidade de líquido ou tipo de experimento. Apesar de não ser discutido neste protocolo, um meio de outros vulgarmente utilizados para prevenir a contaminação é trabalhar dentro de uma câmara de fluxo laminar (Figura 10). Este equipamento é crítico para a cultura de tecidos e para experiências realizadas com microorganismos classificados como BLS-2 ou superior. A capela de fluxo laminar contém um HEPA (alta eficiênciaar filtro de partículas) que remove contaminantes do ar a partir do ar que flui para o capô, evitando ar não filtrado a partir da sala de permeando o espaço de trabalho. Digno de nota, um bico de Bunsen não pode ser utilizado dentro de uma câmara de fluxo laminar porque o calor da chama interrompe o fluxo de ar essencial para a funcionalidade do capuz. Muitas vezes, é útil para verificar a qualidade de sua técnica asséptica ao realizar experimentos. Para confirmar as soluções e meios de cultura não ficam contaminados durante a manipulações experimentais, sempre preparar um controlo negativo. Por exemplo, se a preparação de tubos de caldo para o crescimento de culturas bacterianas, não inocular um tubo deixando apenas meios estéreis. Incubar o meio ao lado dos tubos inoculados em seguida inspeccionar tubo de controlo não inoculado para sinais de contaminação, tais como turbidez de crescimento das células não desejadas não intencionalmente introduzido dentro do tubo. Se o tubo de controlo está contaminado, o tubo experimentalé provável estão contaminados, bem como, a experiência e terá que ser repetido. Estas medidas de precaução deve ser feito com cada experimento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Caldo LB </td><td> Difco </td><td> 244620 </td><td> Receita também disponível em referência 6 </td></tr><tr><td colspan="4"> TE Buffer: </td></tr><tr><td> EDTA sal dissódico dihidratado </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> CiDecon </td><td> Decon Laboratories, Inc. </td><td> 8504 </td><td> Desinfetante </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A406 </td><td> Para utilização como desinfectante, preparar a 70% (v / v) com água destilada </td></tr></tbody></table>

assépticas técnicas de laboratório: transferências de volume com pipetas sorológicas e micropipetas

Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors

Os microrganismos estão por toda parte - no ar, solo e corpo humano, bem como em superfícies inanimadas, como bancadas de laboratório e teclados de computador. A onipresença de micróbios cria uma fonte abundante de contaminantes potenciais em um laboratório. Para garantir o sucesso experimental, o número de contaminantes nas superfícies do equipamento e de trabalho deve ser minimizado. Comum entre muitas experiências em microbiologia são técnicas que envolvem a medição e transferência de culturas contendo células bacterianas ou de partículas virais. Para fazê-lo sem entrar em contato com superfícies não-estéreis ou contaminar meios estéreis requer (1) preparar um espaço de trabalho estéril, (2) precisamente definição e precisão de leitura de instrumentos para transferência asséptica de líquidos, e (3) adequadamente manipular instrumentos frascos, garrafas e culturas, tubos dentro de um campo estéril. Aprender esses procedimentos exige treinamento e prática. Na primeira, as acções devem ser lenta, deliberada e controlada com o objetivo de ser para t assépticasechnique para se tornar uma segunda natureza, quando trabalhava no banco. Aqui apresentamos os passos para a medição de volumes por meio de pipetas sorológicas e micropipetas de dentro de um campo estéril criado por um bico de Bunsen. Volumes variar de microlitros (ul) a mililitros (ml), dependendo do instrumento utilizado. Líquidos comummente transferidos incluem caldo estéril ou soluções químicas, bem como culturas de bactérias e stocks de fagos. Seguindo estes procedimentos, o aluno deve ser capaz de: <ul><li> Trabalhar dentro do campo esterilizado criado pela chama do queimador de Bunsen. </li><li> Usar pipetas serológicos sem comprometer a esterilidade do instrumento. </li><li> Aspirar líquidos com pipetas serológicos, precisamente a leitura volumes calibrados através do alinhamento do menisco formado pelo líquido para as marcas de graduação na pipeta. </li><li> Mantenha garrafas de cultura, frascos, tubos e suas respectivas tampas estéreis durante as transferências de líquidos. </li><li> Identificar diferentes aplicações para o plástico contra o vidro pip sorológicoettes. </li><li> Estado limitações de precisão para micropipetas. </li><li> Precisamente e precisa definir volumes de micropipetas. </li><li> Saiba como usar corretamente a primeira parada e segundo em uma micropipeta para aspirar e transferir volumes corretos. </li></ul>

Quando se trabalha num laboratório, é imperativo para minimizar fontes de contaminação. A técnica asséptica refere-se a procedimentos que permitem a transferência de culturas e reagentes evitando ao mesmo tempo o contacto com as superfícies não-estéreis. Pipetas serológicos e usar micropipetas são usados ​​para medir os volumes precisos, sem comprometer a esterilidade das soluções utilizadas em experiências.

Assépticas Técnicas de Laboratório: transferências de volume com pipetas sorológicas e micropipetas

Os microrganismos estão em toda parte: no ar, no solo e no corpo humano, bem como em superfícies inanimadas, como bancadas de laboratório e teclados de computador. O...

Esta demonstração apresenta técnicas laboratoriais assépticas para transferência de volumes com pipetas serológicas e micropipetadores na bancada do laboratório. Trabalhe dentro do campo estéril criado pela chama de um bico de Bunsen. Selecione o instrumento de transferência de volume apropriado para a aplicação.Em seguida, utilize-os corretamente sem comprometer sua esterilidade, mantendo os reagentes e materiais de cultura estéreis e aspirando líquidos com precisão, considerados em conjunto. Esses procedimentos são essenciais para minimizar as fontes de contaminação e garantir precisão em experimentos básicos. Inicialmente, é difícil ajustar com precisão e ler corretamente os instrumentos, bem como coordenar movimentos com os instrumentos e materiais de laboratório sem comprometer a esterilidade dos líquidos transferidos.Praticar uma técnica asséptica no laboratório é essencial para o sucesso experimental ao trabalhar com espécimes vivos; portanto, invista tempo para aprender esses procedimentos, tornando-os automáticos. Ao trabalhar na bancada, o Dr. Chris Reddy, meu coordenador de laboratório, demonstrará os protocolos. Lave sempre as mãos cuidadosamente com sabão antisséptico e água morna antes de iniciar qualquer procedimento laboratorial. Primeiro, molhe as mãos com água corrente morna.Em seguida, aplique e distribua abundantemente sabão com vigor. Esfregue as mãos gerando fricção em todas as superfícies, incluindo polegares, dorsos dos dedos, dorsos das mãos e sob as unhas. Depois, enxágue completamente para remover o sabão residual e seque com toalhas de papel retiradas de um dispenser.Por fim, com uma toalha de papel nova, feche a torneira e limpe a área de trabalho da bancada do laboratório. Em seguida, retire um lenço desinfetante pré-umedecido do recipiente e passe por toda a área. Deixe o desinfetante evaporar usando uma chama de ignitor.O bico de Bunsen. Ajuste a chama para exibir o cone azul no centro. Organize todos os materiais necessários para o procedimento próximo à área estéril da bancada do laboratório.Além disso, certifique-se de que todos os materiais estejam devidamente rotulados. Existem diversas opções de pipetas serológicas, de plástico ou vidro, descartáveis ou reutilizáveis, com ou sem filtro. Os diferentes tamanhos são calibrados com filtros que funcionam como barreira contra o excesso de volume na pipeta.Observe que as pipetas serológicas também são calibradas de duas maneiras. Pipetas TD marcadas com anéis duplos na extremidade superior são calibradas para que o volume da ponta não seja dispensado. Isso não é mostrado aqui, mas as pipetas TC devem ser sopradas, pois são calibradas para entregar todo o volume. Utilizando técnica asséptica com uma pipeta serológica plástica estéril individualmente embalada, comece pela extremidade tampada e comece a desenrolar cuidadosamente o papel.Não remova toda a manga. Em vez disso, proteja a ponta do cabo da pipeta, cobrindo apenas a parte superior da pipeta acima das marcas de graduação, e fixe um auxiliar de pipetagem, como uma bomba de borracha ou pistola, à extremidade superior da pipeta serológica. Segure o auxiliar de pipetagem com uma mão e remova a manga de papel da pipeta plástica com a outra.Para pipetas serológicas de vidro armazenadas em recipientes metálicos, solte a tampa do recipiente e remova-a, flamejando as extremidades abertas da tampa e do recipiente. Em seguida, coloque a tampa de lado sobre a bancada desinfetada. Segure o recipiente na posição horizontal e agite para que as pontas de uma ou duas pipetas fiquem expostas.Deixe cerca de uma polegada exposta. Deite o recipiente de lado e retire uma pipeta sem tocar nas outras pipetas. Mantenha a ponta inferior da pipeta livre de contato com as mãos e superfícies não estéreis.Prossiga para fixar o auxiliar da pipeta. Em seguida, passe o terço inferior de uma pipeta de vidro através da chama do bico de Bunsen, no cone azul, por um a três segundos. Agora remova a tampa do frasco contendo o meio estéril.Segure-o entre o dedo anelar e a palma da mão enquanto manipula o auxiliar de pipetagem com o polegar, o indicador e o dedo médio da mesma mão; com a outra mão, segure o frasco em um ângulo de 45 graus e passe a borda do frasco pela chama do bico de Bunsen. Introduza a ponteira estéril no meio. Em seguida, aspire utilizando o auxiliar de pipetagem para controlar o fluxo com as marcas de graduação.Monitore o volume aspirado na pipeta para ler com precisão o volume. Mantenha a pipeta verticalmente e observe o menisco do líquido diretamente, ao nível dos olhos. Passe novamente a borda do frasco pela chama do bico de Bunsen.Em seguida, tampe-o. Coloque a garrafa do meio de cultura de lado. Depois, pegue um tubo estéril e, de forma asséptica.Remova a tampa conforme descrito anteriormente. Crie um campo estéril flamejando a borda do tubo. Dispense o meio do pipeta para dentro do tubo, controlando o fluxo da amostra para que não haja respingos.Flame a borda. Novamente, recoloque a tampa e coloque o tubo de lado. Agora remova o auxiliar de pipetagem, descarte as pipetas plásticas em um recipiente designado para objetos perfurocortantes, e imerja as pipetas de vidro em solução de hipoclorito a 10%.Um micropipetador permite medição e dispensação precisas de volumes mínimos, com instrumentos de diferentes tamanhos para faixas de volume específicas. Tubos e ponteiras plásticas pré-esterilizados. Utilize também um lenço umedecido com desinfetante para limpar os micropipetadores. Observação.O Volter mostra três números que devem ser interpretados em relação ao tipo de micropipeta, com precisão refletida no menor gradiente. Observe, por exemplo, que a P 20 é usada para volumes entre 2,0 e 20,0 microlitros. O número superior em preto é para dezenas de microlitros.O segundo número preto indica o volume em microlitros. O número vermelho marca décimos de microlitro, de modo que cada marca de graduação corresponde a um incremento de 0,02 microlitros. Primeiro, gire o botão de ajuste para definir o volume do dispensador conforme indicado no voltagem numérico.Ao diminuir o volume no micropipetador, gire lentamente a roda com o polegar até a marca de graduação. Ao aumentar o volume, gire a roda ultrapassando a marca de graduação desejada em um terço de volta. Em seguida, gire lentamente a roda com o polegar para baixo até atingir o volume pretendido.Use sempre ponteiras descartáveis de plástico estéreis. Encaixe firmemente uma ponteira na extremidade do corpo da micropipeta. Pressione para baixo e gire levemente para garantir uma vedação hermética ao ar.Mantenha o micropipetador na posição vertical. Observe que o micropipetador possui três posições: repouso, primeiro parada e segunda parada.Pressione o botão do êmbolo da posição de repouso até o primeiro detentor para deslocar o ar equivalente ao volume ajustado. Em seguida, mergulhe a ponteira no líquido mantendo o botão pressionado até o primeiro detentor. Libere lentamente o botão para aspirar o líquido para dentro da ponteira.Quando o botão de pressão atingir a posição de repouso, aguarde um momento para que o líquido seja aspirado para dentro da ponteira. Em seguida, remova a ponteira do líquido. Verifique visualmente a extensão do líquido aspirado na ponteira, garantindo que não haja bolhas de ar.Coloque a ponteira em um ângulo de 10 a 45 graus contra a parede do tubo que receberá o líquido. Agora, pressione lentamente o botão do êmbolo até o primeiro batente. Expulsando o líquido.Após um momento, pressione o botão de empuxo até o segundo batente para expelir qualquer líquido residual. Na ponta, prossiga removendo a ponta do líquido e, em seguida, solte o êmbolo para a posição de repouso. Por fim, descarte as pontas no recipiente designado para resíduos cortantes pressionando o botão de ejeção na micropipeta.Primeiro, desligue o queimador de bico. Após guardar todos os materiais e reagentes, passe um lenço desinfetante nas superfícies externas do LabWare antes de movê-los para o local de armazenamento. Em seguida, coloque o vidro contaminado e os resíduos perigosos na destinação adequada para descarte.Prossiga para limpar toda a área de trabalho mais uma vez, permitindo que o desinfetante evapore. Por fim, lave bem as mãos com sabão antisséptico e água morna. Sem uma técnica asséptica, os cultivos podem ficar contaminados e atrasar os experimentos.A transferência asséptica de líquidos utilizando pipetas serológicas é essencial para amplificar culturas bacterianas puras, como este preparo de 25 mililitros de E. coli. Além disso, as pipetas serológicas facilitam a transferência asséptica de líquidos para tubos de ensaio estéreis. Este exemplo demonstra uma cultura pura versus contaminada de E. coli na entrega ponta-a-ponta de meio aos tubos.Às vezes, são necessários volumes precisos. É evidente que, neste caso, há uma transferência imprecisa do meio. Este exemplo mostra o volume incorreto de tampão transferido.Em vez de dispensar 12,5 microlitros, o estudante dispensou 125 microlitros. Embora os números estejam ajustados de forma idêntica na micropipeta, a micropipeta incorreta foi selecionada para a tarefa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter um conhecimento prático de como aplicar uma técnica asséptica em procedimentos laboratoriais rotineiros, como a transferência de soluções e culturas utilizando pipetas serológicas e micropipetas, sem comprometer sua esterilidade.O objetivo é que procedimentos de precaução, como flamejar vidraria, ponteiras de pipeta, tubos de cultura e frascos, bem como trabalhar dentro dos limites de um campo estéril na bancada do laboratório, se tornem habituais em cada experimento. Também é essencial que volumes precisos e exatos sejam medidos e dispensados ao realizar experimentos. Aprender a usar corretamente esses instrumentos de transferência de volume melhorará a confiabilidade dos resultados experimentais.

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Biologia

Quando se trabalha com meios de comunicação e dos reagentes utilizados para os microorganismos de cultura, uma técnica asséptica deve ser praticado para assegurar a contaminação é minimizado. Uma variedade de métodos de revestimento são rotineiramente utilizados para isolar, propagar ou bactérias enumerar e de fagos, os quais incorporam os procedimentos que mantêm a esterilidade de materiais experimentais.

Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

Listeria monocytogenes é um organismo modelo para estudar as respostas imunológicas e suscetibilidade genética para as bactérias intracelulares em camundongos. Este método permite que sejam medidos carga bacteriana e gerar uma única célula suspensões de fígado e do baço de ratos para análise FACS para determinar mudanças em células do sistema imunológico devido à infecção por Listeria.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

A transferência de célula para célula de agregados proteicos, ou sementes proteopáticas, pode estar subjacente à progressão da patologia em doenças neurodegenerativas. Aqui, é descrito um novo ensaio de citometria de fluxo FRET que permite a detecção específica e sensível da atividade de semeadura de amostras recombinantes ou biológicas.

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

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Vamos mostrar o uso de gradientes de densidade descontínuo para separar populações bacterianas baseadas na produção da cápsula. Este método é usado para comparar a quantidade de cápsulas entre culturas, isolar os mutantes com um fenótipo específico da cápsula, ou para identificar os órgãos reguladores da cápsula. Aqui descrito é a otimização e a execução do ensaio.

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O cultivo in vitro é um método de detecção direta da presença de bactérias vivas. Este protocolo descreve métodos para o cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluindo as do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, espécies de Borrelia de febre recidivante e Borrelia miyamotoi.  Estas espécies são fastidiosas e de crescimento lento, mas podem ser cultivadas.

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O presente protocolo descreve a propagação do vírus Zika (ZIKV) em células Vero African green monkey kidney e a quantificação do ZIKV usando métodos de imunodetecção colorimétrica baseados em células nos formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento).

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Comunidades microbianas na Natureza e Laboratório - Entrevista

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Aprenda técnicas assépticas de laboratório para transferências de volume usando pipetas sorológicas e micropipetas. Este método demonstra como minimizar contaminação e garantir precisão em experimentos microbiológicos.

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