The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This article is a part of JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 107.21.186.38, User IP: 107.21.186.38, User IP Hex: 1796586022
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice. J. Vis. Exp. (51), e2879, doi:10.3791/2879 (2011).
שבץ הוא הגורם השלישי למוות ואת הסיבה המובילה למוגבלות בעולם, עם עלות משוערת של קרוב 70000000000 $ בארצות הברית בשנת 2009 1,2. עורק intraluminal באמצע מוחין חסימה (MCAO) מודל שפותח על ידי קואיזומי 4 בשנת 1986 כדי לדמות זו הפתולוגיה האנושית השפעה בחולדה. שינוי שיטת MCAO הוצג מאוחר יותר על ידי Longa 3. טכניקות שניהם היו בשימוש נרחב לזיהוי המנגנונים המולקולריים של פגיעה מוחית כתוצאה שבץ איסכמי ו שיטות טיפוליות פוטנציאליים 5. שיטה זו לא פולשנית יחסית בחולדות הוארך להשתמש בעכברים לנצל מהונדס ועל זני בנוקאאוט 6,7. כדי איסכמיה מודל מוקד מוחין, תפר intraluminal מתקדמת דרך עורק התרדמה הפנימי כדי לחסום את הבסיס של MCA. תפר קירוב לאחר תקופת זמן מוגדרת מחקה reperfusion ספונטני, אבל תפר ניתן גם לשמור לצמיתות. סרט הווידאו הזה יהיה הוכחת שתי הגישות העיקריות לביצוע הליך intraluminal MCAO בעכברים באופן הדרגתי, כמו גם לספק תובנות על החסרונות ואת החסרונות פוטנציאליים. רקמת מוח איסכמי יהיה בהמשך להיות מוכתם על ידי כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) כדי להעריך את מידת אוטם מוחי 8.
פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת פלורידה עולה בקנה אחד עם "עיקרון של טיפול בבעלי חיים במעבדה" (NIH פרסום מס '86-23, מתוקנת 1985).
1. חומרים
בעלי חיים: זכר C57BL / 6 עכברים (הרלן מעבדות, אינדיאנפוליס, אינדיאנה, ארה"ב) במשקל 20-26 גרם בזמן הניתוח.
מצלמה דיגיטלית (V1253, Kodak Co, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב).
תמונה J תוכנה (ImageJ 1.42q תוכנה, ארה"ב National Institutes of Health, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב).
2. טרום ניתוחית צעדים
לפני הניתוח, העכברים הם שוכנו תחת מחזור אור / חושך 12:12 עם גישה חופשית למים מכרסם צ'או.
Sutures עבור MCAO מוכנים ידי הקהיה 1-2mm של קצה תפר עם ציפוי חום 3-4 מ"מ של הפיר תפר מקצה שלה עם גומי סיליקון נוזלי, המאפשר לו להתייבש (7-0; קוטר קצה, 0.20-0.25mm, ציפוי אורך, 3-4 מ"מ, אורך תפר 11-13mm). עקרות צריך להישמר כל הצעדים הנ"ל.
לאחר שקילת העכבר, הרדמה מושרה עם 4% isoflurane בתא אינדוקציה ומתוחזק במהלך ההליך עם 1.5-2% isoflurane ב 30% O 2 ו - 70% N 2 O תערובת הדלק באמצעות facemask.
העכבר ממוקם אפרקדן על כרית גזה שוכב על משטח בקרת טמפרטורה הפעלה (שמיכה תרמית); את הפרווה ראש מגולח.
עיניים משחה חומר סיכה מוחל על שתי העיניים, ואת העפעפיים סגורים כדי למנוע יובש בעיניים במהלך תהליך כירורגי.
חתך קו האמצע (1 ס"מ) מורכב על העור שמעל calvarium מקו עורפית מעולה nasion ואת העור נמשך רוחבית כדי להצמיד microtip גמישה (MT B500-0 Microtip סטרייט, קוטר 0.5mm). Microtip ממוקם בניצב לפני השטח של הגולגולת הקודקודית הימנית (1 מ"מ אחורי ו 5 מ"מ לרוחב על גבחת) כדי לפקח על זרימת הדם בשטח MCA ידי flowmetry דופלר לייזר.
ודא microtip גמישה מחובר הגולגולת היטב לפני החיה היא פנתה בתנוחה אופקית. הצוואר של החיה מושם על משטח רך והאף שלה מוחזק חרטומו של מנגנון ההרדמה. זה יגרום שיש מספיק מקום microtip גמישים.
בדיקה רקטלית טמפרטורה מוכנס לשמור על בעלי חיים קבוע הליבה טמפרטורה של 37 ± 0.5 ° C.
הקדמיות והן hindpaws מוקלטות אל פני השטח את פלטפורמת ההפעלה, הזנב הוא מודבק צינור רקטלי.
</ Ol>
3. MCA ניתוח חסימה:
תחת מיקרוסקופ ההפעלה, חתך בצוואר קו האמצע הוא עשה עם מספריים בין manubrium ואת הלסת בעדינות על ידי הסרת עור רפוי.
בלוטות לזווג submandibular הבסיסית מחולקים בצורה בוטה, עם בלוטת שמאל שמאל באתרם. בלוטת submandibular הנכון הוא חזר בו cranially ומאובטחת יחד עם השריר sternocleidomastoid.
החטיבה חשוף של שריר omohyoid כיסוי הראש נדן מחולק בקפידה עם טנדרים.
עורק התרדמה המשותף הזכות (CCA) מופרד בזהירות מבודד העצב התועה ואת הנדן (הממוקם לרוחב CCA).
מכאן ואילך, את 2 שיטות כירורגיות אשר שימשו לעתים קרובות לבצע חסימה MCA לסטות:
קואיזומי של 4 שיטה
שלושה תפרים צווארון רופף (7-0 משי) ערוכים סביב המרכז לאמנות עכשווית הנכון.
עורק התרדמה החיצוני (ECA) מזוהה, מבודדים, צרוב (2-3mm דיסטלי אל הסתעפות). לאחר מכן הוא יכול להיות מחולק עם מיקרו מספריים. כדי למנוע נזקים היקפיים בשוגג באתר צריבה, הכוח צריך להיות מוגדר ב 1 באמצעות ידית כוח. זה עולה בקנה אחד עבור כל cauterizations.
מתח מספיק מוחל על תפר הצווארון הפרוקסימלי ביותר על המרכז לאמנות עכשווית כדי לחסום את זרימת הדם (קשירת קבע). חסימת זרימת מאומת על ידי ~ ירידה של 50% ערכי בסיס קורטיקלי זלוף.
אז קליפ כלי ממוקמת ממש לפני הסתעפות המרכז לאמנות עכשווית, כדי למנוע זרימת מדרדר בזמן arteriotomy.
Arteriotomy מתבצע בין תפר ligated הפרוקסימלית ו את הקליפ כלי שיט על המרכז לאמנות עכשווית עם מיקרו מספריים (קרוב קשירת).
חום קהה סיליקון מצופה תפר 7-0 ניילון הוא הציג דרך arteriotomy והתקדם עד שהוא מגיע קליפ כלי. 2 התפרים שנותרו צווארון רופף הם להדק בעדינות בין arteriotomy ואת הקליפ כלי כדי למנוע דליפה חזרה לזרום דרך המרכז לאמנות עכשווית, בזהירות לא טראומה הקיר עורקים סביב המרכז לאמנות עכשווית, ולאחר מכן את הקליפ כלי יבוטל.
Longa של 3 השיטה
ECA מזוהה, גזור ככל האפשר (ליד הסתעפות שלה לתוך העורקים לשונית לסתי), צרוב (עם כוח מוגדר 1), מחולק עם מיקרו מספריים.
שני תפרים צווארון רופף (7-0 משי) ערוכים סביב ICA הפרוקסימלי מעל הסתעפות המרכז לאמנות עכשווית.
המרכז לאמנות עכשווית סגור זמנית עם קליפ ספינה. חסימת זרימת מאומת על ידי ~ ירידה של 50% ערכי בסיס קורטיקלי זלוף.
ואז ICA נסגר זמנית עם קליפ כלי מעל שני תפרים צווארון רופף, כדי למנוע זרימת מדרדר בזמן arteriotomy.
Arteriotomy מתבצע באמצעות מיקרו מספריים לסגור את ECA שיקף את הגדם.
חום קהה סיליקון מצופה תפר 7-0 ניילון הוא הציג דרך arteriotomy ב ECA ומתקדם עד שזה מגיע קליפ כלי מיושם ICA. 2 התפרים צווארון רופף ICA הפרוקסימלי יש להדק בעדינות סביב ICA הפרוקסימלי, כדי למנוע זרימת הדם ריפלוקס באמצעות הרשפ"ת, עם תשומת לב מספיק כדי לא טראומה בקיר העורק, ולאחר מכן את הקליפ כלי יבוטל.
שאר ההליך הוא מתכנס במידה רבה:
תפר occluding היא מתקדמת לאט דרך העורק הראשי פנימי (רשפ"ת) לעבר בסיס הגולגולת עד התנגדות קלה מורגשת. ירידה זמנית בשווי זרימת הדם במוח כאחוז (= 80%) ביחס הבסיסית היא מאושרת על ידי flowmetry דופלר לייזר. 2 התפרים לצווארון הם התהדקו סביב החוט מוכנס.
עבור חולף ניסויים איסכמיה מוחית, תפר occluding יבוטל בעדינות לאחר 45 דקות. נקודה זו הפעם ניתן לשנות למטרות ניסויים שונים.
לאחר הוצאת תפר נימה, האתר arteriotomy סגור כדי למנוע דימום לאחר ניתוח. בשיטה של קואיזומי, זה כרוך היטב הידוק התפרים קולר סביב המרכז לאמנות עכשווית. בטכניקה של Longa, אתר arteriotomy בבסיס ECA הוא צרוב, אז התפרים הצווארון ב ICA הפרוקסימלי הם משוחררים הסיר כדי לשחזר את זרימת הראש.
כדי לסגור את החתך, בלוטת submandibular ו SCM מוטלות על שדה הניתוח. קצוות הפצע הם מקורב אז עם דבק רקמות צוואר הרחם באזורים הקרקפת. לחלופין, מצרך נספגים תפר או מתכת יכול לשמש כדי לסגור את הפצע במיוחד כאשר ההישרדות לטווח ארוך של החיה מיועד.
לאחר סגירת החתך, החיה מקבלת 1 גרם מלח חמים תת עורי כמו חידוש נפח. מינון של משככי כאבים מתאימים (כלומר עצירות ב 0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) יש להשתמש כדי למזער את הכאב של החיה ואי נוחות במהלך תקופת ההחלמה. אנימהאני מוסרת את חבילת כירורגית להציב בכלוב התאוששות חם באזור / למנוע היפותרמיה, עם גישה חופשית וקלה מזון, מים רכים.
4. מנותחות הערכה נוירולוגית
אחרי החיה חוזר להכרה מוחלטת, גירעונות נוירולוגיות ניתן להעריך על ידי בקנה מידה פשוטות (חמש נקודות בקנה מידה) כדלקמן 3:
אין גירעונות הנצפה
כישלון להאריך בכפו הנגדי (נוירולוגית קלה הגירעון מוקד)
חג בכיוון הנגדי כדי האוטם (גירעון מתון מוקד נוירולוגית)
נפילה בכיוון הנגדי כדי האוטם (גירעון חמור מוקד נוירולוגית)
רמת מדוכא התודעה ללא תנועה ספונטנית
5. מכתים ומדידה כמותית של נפח האוטם במוח
לאחר 24 שעות של reperfusion MCA, עכבר ששרד נשקל, בהרדמה עמוקה עם isoflorane 4%, והקריב על פי פרוטוקול שאושר.
המוח הוא הסיר בזהירות להציב מבצעה במוח העכבר מטריקס, ואת המוח כולו מחולק coronally ב 2 מ"מ במרווחים.
קטעים שקועים 2% ב TTC שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) בשעה 37 ° C במשך 20 דקות. לאחר מכתים TTC, אזור infracted מוצג רקמה לבן (בלא כתם) סמוך לבנה רקמה אדומה (בת קיימא) (איור 1).
קטעים מצולמים סידורי באמצעות מצלמה דיגיטלית את אזור האוטם נמדדת עם התוכנית J התמונה.
האזור של האוטם (לבן, בלא כתם), שטח של חצי הכדור ipsilateral (לבן ואדום לבנה, מוכתמת), ואת השטח של האונה הנגדי (מוכתם אדום, לבנה) נמדדים עבור כל מקטע. נפח מחושב על ידי סיכום שטחי נציג בכל הסעיפים ומתרבים על ידי עובי הפרוסה. לאחר תיקון עבור בצקת, בנפח של אוטם מחושב כדלקמן 9: נפח האוטם מתוקן (CIV),% = [נפח האונה הנגדי - (נפח האונה ipsilateral - נפח האוטם)] נפח האונה / הנגדי x 100
6. נציג תוצאות
אחרי חסימה ו reperfusion של MCA השמאלי דרך המרכז לאמנות עכשווית להקים איסכמיה מוחית חולפת, בעלי חיים מוקרבים והמוח מחולק coronally שלהם הם מוכתמים TTC להעריך את עוצמת הקול של האוטם (איור 1).
המודל הוא מודל MCAO נקבע כי משכפל איסכמיה מוחית במינים Murine. מודל זה שימש לראשונה אצל חולדות ומותאמת לאחר מכן לעכברים. הימנעות craniectomy לחסל את השפעתה של מניפולציה כירורגית על חדירות מחסום דם מוח ו לחץ תוך גולגולתי יתרון של הטכניקה הזו. עם זאת, משתנים רבים, כגון זן הקשורות להבדלים 10, בגודל של תפר קצה 11, משך 6 חסימה, טמפרטורת הגוף 12, 13 הרדמה, וגורמים אחרים יכולים להוביל לחוסר התאמה בכמויות האוטם במודל זה. יש פרטים טכניים ספציפיים צו להזכיר:
ציפוי סוף תפר תיצור תפר חלקה לניהול עבור occluding MCA עם סיכון ניקוב ירד.
להפריד בעדינות מאובטח העצב התועה מן העורקים הסמוכים ולכן אינו מוגבל בטעות תפר קולר. הקפד להשתמש בשני התפרים לצווארון, כדי למנוע דימום דרך מדרדר arteriotomy תוך עולה תפר occluding ולהדק אותם בעדינות כדי למנוע טראומות בקיר העורק.
עורק pterygopalatine סוטה מן המרכז לאמנות עכשווית הרשפ"ת לאחר הסתעפות. כדי למנוע חריגה קצה תפר עולה לעורק pterygopalatine במקום הרשפ"ת, להקים פלטפורמה כירורגית כדי לשמור את הראש והצוואר העכבר בכיוון ישר. סטייה זו המשותף לשתי קואיזומי של טכניקה של Longa, ולכן יש להקפיד בהליך אחד.
לייזר דופלר flowmetry היא שיטת ניטור בזמן אמת של זרימת הדם באזורים אנטומיים שונים, מיושמת בניסוי שלנו כדי למדוד את זרימת הדם באזור של המוח המסופקים באמצעות MCA. זה מגביר באופן משמעותי את דיוק מיקום תפר, ובכך מבטיחה השגת תוצאות עקביות. זהו יתרון ציין מעל טכניקות פחות מדויקת של מדידת אורך של תפר כדי להיות מוכנס, אשר רגישים להפרעות של וריאציות אנטומיות.
עלייה זמנית flowmetry דופלר לייזר תוך החדרת תפר שלך דרך המרכז לאמנות עכשווית ויק"א מבטיח כי אתה נע בכיוון הנכון וקרוב ostium MCA.
עורק העורפית לרוב נובעת ECA הפרוקסימלית (אם כי לפעמים מן ICA) בכיוון posterolateral. זה צריך להיות מזוהה (במקרים מסוימים ligated) כדי למנוע בלבול מאוחר יותר בזמן החדרת תפר.
כדי להקטין השתנות של אוטם, לשמור על טמפרטורת גוף קבועה עכבר במהלך הניתוח ולהימנע היפותרמיה לאחר הניתוח.
השתמש TTC מכתים עד 72 שעות לאחר הניתוח MCAO לניתוח נפח האוטם כראוי. במשך זמן ארוך יותר נקודות הישרדות להשתמש בשיטות אחרות כגון מכתים מכתים סגול cresyl כדי לקבוע את גודל האוטם.
קואיזומי של שיטת
Longa של שיטת
האתר של הכניסה תפר
Ipsilateral העורק הראשי נפוצות
Ipsilateral העורק הראשי חיצוניים
להקריב עורקי הקבע
Common עורקי הראש הראש ואת חיצוניים
עורק התרדמה החיצוני
הסיכון לקרע קטלני intraoperative עורקי / דימום
פחות דאגה
הדאגה הגדולה
אפשרות של הסחת תפר לעורק Pterygopalatine
כן
כן
פרוצדורלי זמן
בדרך כלל מהר יותר
באופן כללי יותר
לייזר Flowmetry דופלר: ירידה אחוז מנקודת ההתחלה
> = 80%
> = 80%
Flowmetry לייזר דופלר: חסימה / reperfusion המגמה
שתי טיפות מנקודת ההתחלה במהלך ההליך חסימה
אחת לקפוץ במהלך ההליך reperfusion
שתי טיפות מנקודת ההתחלה במהלך ההליך חסימה
שתי קפיצות במהלך ההליך reperfusion
טבלה 1. השוואה בין שתי שיטות של חסימת עורק המוח האמצעי intraluminal (MCAO) בעכברים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke;
a journal of cerebral circulation20 (10), 1407-1431 (1989).
Lloyd-Jones, D. et al, Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics
Subcommittee. Circulation 119 (3), e21-181 (2009).
Longa, E.Z., Weinstein, P.R., Carlson, S., & Cummins, R., Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral
circulation20 (1), 84-91 (1989).
Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., & Ooneda, G., Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in
which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke8, 1-8 (1986).
Fan, Y. et al, Endothelial progenitor cell transplantation improves long-term stroke outcome in mice. Ann Neurol67 (4), 488-497.
Fujii, M. et al, Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral
circulation28 (9), 1805-1810; discussion 1811 (1997).
Bederson, J.B. et al, Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.
Stroke; a journal of cerebral circulation17 (6), 1304-1308 (1986).
Barone, F.C., Knudsen, D.J., Nelson, A.H., Feuerstein, G.Z., & Willette, R.N., Mouse strain differences in susceptibility to cerebral
ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab 13 (4), 683-692 (1993).
Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K.A., & Dempsey, R.J., Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in
mice. Neurosurgery 56 (1 Suppl), 196-200; discussion 196-200 (2005).
Barber, P.A., Hoyte, L., Colbourne, F., & Buchan, A.M., Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and
behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation 35 (7), 1720-1725 (2004).
Kapinya, K.J., Prass, K., & Dirnagl, U., Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?
Neuroreport13 (11), 1431-1435 (2002).
1
ReplyPosted by: Hassan A.June 6, 2011, 10:17 AM